人肝癌靶向脂质体微泡造影剂的鉴定及免疫学性质研究

目的 制备人肝细胞癌靶向免疫脂质体微泡造影剂，并对其免疫学性质进行研究。方法 静电吸附法制备免疫脂质体微泡造影剂；玻片凝集试验、荧光免疫染色试验证明抗体与脂质体微泡的结合；ELISA法检测免疫脂质体微泡的活性；花环形成试验、花环形成阻断试验及荧光免疫染色试验研究免疫脂质体微泡的靶向作用；细胞毒试验(MTT法)评价其安全性。结果 免疫脂质体微泡的玻片凝集试验、荧光免疫染色试验均为阳性；ELISA结果显示，免疫脂质体微泡中单抗的活性与游离单抗基本一致；免疫脂质体微泡围绕人肝癌细胞形成花环，花环形成率达90％以上；免疫脂质体微泡造影剂对人正常肝细胞的增殖没有影响。结论 采用静电吸附法成功制备了具有良好免疫活性的人肝细胞癌靶向免疫脂质体造影剂；该造影剂在体外能与人肝癌细胞高效特异结合，对人正常肝细胞没有毒性。     

抗VEGF抗体介导靶向超声造影剂的体外实验研究

目的以抗血管内皮因子（VEGF）抗体为配体研制能与血管内皮细胞特异性结合的靶向脂质体超声造影剂并检测其体外寻靶能力。 方法以静电吸附法将抗VEGF抗体连接到脂质体造影剂微泡的表面；体外培养ECV304人血管内皮细胞，用免疫荧光法检测靶向造影剂与其体外结合能力，以普通造影剂为对照组。 结果所制备的靶向超声造影剂与普通微泡无显著差异；免疫荧光实验结果显示靶向造影剂能在体外与血管内皮细胞特异性结合。 结论携抗VEGF抗体的脂质体靶向造影剂能通过静电吸附法成功制备，且在体外能与血管内皮细胞特异性结合。     

肝癌靶向液态氟碳脂质微球造影剂的体外寻靶实验研究

目的 制备液态氟碳脂质微球造影剂并研究其体外基本特性,再引入抗人肝癌细胞单克隆抗体,采用生物素亲和素法,进行体外靶向结合的研究.方法 采用旋转蒸发法和高压均质法制备一种纳米液态氟碳脂质微球造影剂,观察其外观、形态、大小及分布情况,计算其浓度,并测定其粒径、电位;制备生物素的抗人肝癌细胞单克隆抗体HAb18,用HABA/Avidin试剂盒检测抗体的生物素化程度;制备NBD标记的生物素化的微球,采用生物素亲和素法研究其体外靶向作用.结果 所制备的液态氟碳脂质微球造影剂外观呈乳白色的混悬液,镜下观察,微球形态圆整,大小均一,性质稳定,平均粒径171.9 nm;采用生物素亲和素法制备的NBD标记的生物素化的微球可靶向结合到靶细胞上.结论 成功制备出稳定的纳米液态氟碳脂质微球造影剂,并引入抗人肝癌细胞单克隆抗体,通过生物素亲和素系统可将其特异结合到靶细胞上.     

携细胞间黏附分子1抗体的Sono Vue微泡造影剂靶向识别受损内皮的实验研究

目的 探讨静电吸附法制备的携细胞间黏附分子1抗体靶向微泡在体外和体内的寻靶能力.方法 采用静电吸附法制备携ICAM-1抗体的靶向SonoVue微泡.体外培养经IL-1β刺激大量表达ICAM-1的人血管内皮细胞ECV304,采用免疫荧光法检测靶向微泡与其结合能力.构建兔急性心肌梗死模型,进行靶向微泡的心肌造影,采用冷冻切片和免疫荧光法榆测靶向微泡与受损血管内膜结合能力.结果 在体外实验中,可见大量携ICAM-1抗体靶向微泡与刺激后ECV304细胞紧密结合,仅有少量靶向微泡与正常ECV304细胞结合.体内实验中,可见大量携ICAM-1抗体靶向微泡在兔梗死心肌受损血管内膜处黏附,仅可见少量靶向微泡在正常血管内膜处黏附.结论 携ICAM-1抗体靶向微泡在体内、体外均能与受损血管内皮特异性结合,不仅有利于靶向超声造影显像,更为微泡携带药物或基因在局部定向释放开辟良好前景.     

亲血栓性靶向超声造影剂的制备及体外实验初步研究

目的 制备亲血栓性靶向超声造影剂，探讨其体外寻靶的特点和规律。方法 在自制的白蛋白超声造影剂的基础上，采用交连法制备血栓靶向微泡造影剂。体外实验分3组：A组，将靶向造影剂滴加于健康人新鲜血凝块上，光镜下观察微泡与血凝块的粘附情况；B组对照，普通白蛋白造影剂；C组对照，6—肽阻断实验。结果 A组微泡在血凝块外围形成一条凝聚带，并顺着网格状的纤维素带延伸到血块内部，而两对照组均未见微泡与血凝块的结合。结论 采用交连法可制备亲血栓性靶向白蛋白超声造影剂；该造影剂微泡在体外能与人新鲜血凝块高效特异结合。     

生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究

目的 以与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237为配体研制靶向脂质体超声造影剂并进行体外性能鉴定.方法 采用"生物素一亲和素"桥接法构建靶向微泡(P-Bio-Av-Bio-Mbs),将KDR不同程度表达的细胞LOVO、HUVECs和LS174T分别与P-Bio-Av-Bio-Mbs孵育,同时另将荧光标记生物素-亲和素桥接靶向脂质体微泡(FITC- P-Bio-Av-Bio-Mbs)、荧光标记的单纯小肽微泡复合物(FITC-P-Mbs)及荧光标记的普通脂质体微泡(FITC-Mbs)分别与LOVO细胞孵育,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合的花环形成率及荧光强度;分别以10 ?g、50 ?g的小肽K237预先与LOVO细胞孵育,再将P-Bio-Av-Bio-Mbs与LOVO细胞孵育,观察细胞周围微泡分布.结果 KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光强度3级,KDR阳性表达的HUVECs周围花环形成率53.46%,荧光强度2级,KDR阴性表达的LS174T细胞周围少数微泡黏附,花环形成率5.57%.荧光强度0～1级,组间花环形成率比较差异有统计学意义(P<0.05).FITC-P-Bio-Av-Bio-Mbs、FITC-P-Mbs及FITC-Mbs与LOVO细胞结合,花环形成率分别为89.62%、7.56%、0%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),荧光强度分别为3级、0～1级、0级.10?g预处理组靶细胞周围花环结构明显减少,50 ?g封闭组靶细胞周围无花环形成.结论 以KDR为靶点携小肽K237的靶向脂质体造影剂通过生物素-亲和素桥介导成功制备,在体外能与靶细胞高效特异结合.针对KDR为靶点进行肿瘤新生血管分子靶向显像可能为肿瘤早期诊断提供新的思路.     

亲血栓性靶向超声造影剂的鉴定及体外寻靶实验研究

目的 制备亲血栓性靶向超声造影剂，探讨其体外寻靶的特点和规律。方法 在自制的白蛋白氟碳超声造影剂的基础上，采用交连法将带有荧光标记的6-肽(FITC-KV-6)与自制的白蛋白氟碳微泡结合，制备血栓靶向微泡造影剂。体外实验分3组，A组：将带有FITC-KV-6的造影剂滴加于健康人新鲜血凝块上，普通光镜和荧光显微镜下观察微泡与血块的黏附情况；B组对照：普通白蛋白氟碳造影剂；C组对照：6-肽阻断实验。结果 靶向微泡荧光免疫染色实验为阳性，对照组为阴性。体外实验显示，A组：微泡在血凝块外围形成一条凝聚带，并顺着网格状的纤维素带延伸到血块内部，而2个对照组均未见微泡与血凝块的结合。结论 采用交连法可制备亲血栓性靶向白蛋白超声造影剂；该造影剂微泡在体外能与人新鲜血凝块高效特异结合。     

L-S靶向超声造影微泡的制备及声学性质的实验研究

目的探讨将淋巴细胞选择素(Lymph-Selectin,L-S)链接到脂质超声造影微泡膜表面的可行性,并体外验证其声学性质,为淋巴结特异靶向超声造影制备靶向微泡。方法采用静电吸附法将L-S链接到普通脂质超声微泡膜表面制备成L-S靶向超声造影微泡,荧光免疫染色实验验证L-S与脂质微泡膜的结合;流式细胞仪检测不同浓度L-S与微泡的结合率;超声体外验证L-S靶向微泡声学性质。结果 L-S靶向微泡的免疫荧光染色实验为阳性;L-S抗体浓度为5、15、35 μg/ml时L-S与脂质微泡的平均结合率分别为(9.88±1.49)%、(29.59±2.23)%、(86.66±4.71)%,两两比较均有统计学意义(P0.01);体外声学造影实验中,普通微泡组(UCM)和L S靶向微泡组(TUCM)平均灰度值分别为:(75.77±7.08)dB和(73.72±8.19)dB(P0.05)。结论采用静电吸附法可将L-S链接到脂质超声微泡膜表面制备成L-S靶向超声微泡,其结合率与加入的L-S抗体浓度有关。L-S的链接不会破坏靶向微泡的声学特性。     

JAR细胞靶向微泡造影剂的体外研究

目的探讨体外靶向SonoVue微泡与人绒毛膜癌细胞（JAR细胞）的结合特性、结合率及靶向微泡的稳定性,为在体研究肿瘤细胞抗原的超声定位显像奠定基础。 方法用SonoVue微泡与兔抗人HCG抗体作用制成靶向造影剂、然后分别与JAR细胞及子宫内膜间质细胞（ESC）作用,比较各自的结合率及冲洗前后的结合率。 结果SonoVue微泡与兔抗人HCG抗体的结合率为67.6%;JAR细胞与靶向SonoVue微泡的花环形成率为（84.3±5.5）%,明显高于ESC的花环形成率（11.4±1.5）%（P〈0.05）;靶向SonoVue微泡与贴壁生长的JAR细胞结合率为（85.8±3.3）%,冲洗后结合率为（82.4±3.7）%（P〉0.05）;流式细胞仪检测JAR细胞与靶向SonoVue微泡的结合率为81.0%。 结论在体外靶向SonoVue微泡与JAR细胞特异性结合力具有一定的强度,可望实现靶向显影。     

LHRHa靶向微泡造影剂的制备及体外寻靶实验

目的 制备人卵巢癌靶向超声造影剂,观察其体外寻靶能力。方法 采用生物素-链霉亲和素法制备促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)靶向脂质微泡,以免疫荧光染色验证LHRHa与脂质微泡的结合情况,并以普通脂质微泡作为对照,在倒置显微镜下观察LHRHa靶向脂质微泡对人卵巢癌A2780/DDP的体外寻靶能力。结果 LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光阳性;体外寻靶实验显示LHRHa靶向脂质微泡能够与表面存在LHRH受体的A2780/DDP细胞特异性结合,而普通脂质微泡则不能结合。结论 利用生物素-链霉亲和素方法可成功制备LHRHa靶向脂质微泡造影剂,该靶向造影剂具有体外寻靶能力。     

超声辐照载羟基喜树碱微泡对肝癌SMMC-7721 细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的 研究超声辐照载羟基喜树碱微泡对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响,并探讨其诱导细胞凋亡的分子机制.方法 SMMC-7721细胞随机分为6组,即对照组、空白脂质微泡+超声组、载羟基喜树碱微泡组、羟基喜树碱组、羟基喜树碱+超声组及载羟基喜树碱微泡+超声组.采用Annexin V-FITC/PI双染法和TUNEL法检测细胞凋亡状况;免疫细胞化学法检测Bel-2、Bax蛋白表达.结果 载羟基喜树碱微泡+超声组用Annexin V-FITC/PI检测细胞早期凋亡率为(12.18±1.38)%;TUNEL法显示染成棕黄色的凋亡细胞,细胞中晚期凋亡率为(34.25±1.83)%;免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达升高,Bel-2/Bax比值明显下降.以上结果与其他组的检测结果相比,差异具有统计学意义.结论 超声辐照载羟基喜树碱微泡能明显诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡,其机制可能与降低Bcl-2/Bax比值有关.     

超声辐照载羟喜树碱微泡对肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

目的 探讨超声辐照载羟喜树碱微泡对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖抑制作用.方法 将SMMC-7721细胞随机分为6组,即载羟喜树碱微泡+超声组、羟喜树碱+超声组、单纯羟喜树碱组、载羟喜树碱微泡组、空白微泡+超声组及对照组.采用MTT法观察各处理因素对细胞的生长抑制情况;流式细胞仪(FCM)分析细胞周期分布;Annexin V-FITC/PI双染法和TUNEL法检测细胞凋亡状况.结果 载羟喜树碱微泡+超声组对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖有明显抑制作用,其24 h、48 h、72 h的抑制率分别为(49.56±1.57)%,(80.01±1.52)%,(91.41±0.64)%;FCM结果显示其将SMMC-7721细胞有效阻滞于G0/G1期;Annexin V-FITC/PI检测细胞早期凋亡率为(12.18±1.38)%;TUNEL法显示染成棕黄色的凋亡细胞,细胞中晚期凋亡率为(34.25±1.83)%.以上结果与其他组的检测结果相比,差异有统计学意义.结论 超声辐照载羟喜树碱微泡能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖.其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期同时诱导细胞凋亡有关.     

携载PSMA单抗靶向前列腺癌的纳米级脂质微泡的制备及体外寻靶能力

目的制备携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡,并观察其体外寻靶能力。方法利用静电吸附法制备携载PSMA单抗靶向前列腺癌的脂质纳米级微泡,检测其一般特性;免疫荧光法检测抗体与纳米级微泡的结合情况;用细胞免疫荧光分析鉴定PSMA的表达及其在细胞膜上的定位;普通光镜下观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,同时以胃癌细胞作对照。结果携载PSMA单抗的靶向纳米级微泡分布均匀,平均粒径为(623.70±66.05)nm,免疫荧光法显示微泡表面可见绿色荧光,细胞免疫荧光检测前列腺癌细胞膜高表达PSMA,体外寻靶实验显示该靶向微泡可与人前列腺癌LNCAP及C4-2细胞牢固结合,而与胃癌MKN45细胞不结合。结论本实验成功制备的携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡具有较强的体外寻靶能力,能特异性地与前列腺癌细胞结合。     

超声造影剂在肝癌基因治疗中的靶向性实验研究

目的 探讨结合了肝细胞配体的超声造影剂在超声辐照下介导目的 基因转染肝癌细胞的可行性,寻找一种新的基因靶向导入方法.方法 制备肝细胞表面特异性配体半乳糖基化多聚赖氨酸(GPLL),并对产物进行红外光谱分析.将c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)、G-PLL与SonoVue微泡三者偶联,在超声波介导下,促使c-myc ASODN转染人肝细胞癌SMMC-7721细胞及肺腺癌A-549细胞(作对照),实验结束后行半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以观察不同组问c-myc基因的表达情况.结果 超声介导微泡破裂可增加c-myc ASODN在SMMC-7721细胞和A-549细胞中的表达;SMMC-7721细胞加入G-PLL组中c-myc基因表达水平显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01),而A-549细胞中加入与未加入G-PLL组间c-myc基因表达量的差异无统计学性意义(P＞0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂的方法可促进基因的转染,而超声联合肝细胞受体介导的微泡造影剂则更具有肝细胞靶向性,能有效地促进目的 基因在肝癌细胞中的表达,为肝癌基因治疗提供了新的途径.     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人肝癌细胞株乙酰肝素酶表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(Hpa)反义寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞株Hpa mRNA和蛋白表达的影响。方法:设计合成互补于Hpa mRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS-ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS-ODN,以阳离子脂质体Oligofectamine~(TM) Reagent包埋后转染SMMC-7721、BEL-7402细胞,以RT-PCR和Western-blot检测转染前后细胞Hpa mRNA以及蛋白表达的变化。结果:与正常对照组和NS-ODN相应浓度组相比,转染AS-ODN组肝癌细胞Hp amRNA和蛋白的表达均下降。结论:Hpa反义寡脱氧核苷酸下调Hpa mRNA和蛋白的表达,可能抑制肝癌的侵袭转移。