真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景:核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的:克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法:采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的:构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4,PF4)的真核表达载体,并在真核细胞中表达,为研究其生物学功能奠定基础。方法:人工合成PF4基因模板,通过PCR方法扩增PF4-cDNA,然后克隆至pUC19克隆载体,经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果:获得了PF4-cDNA基因,序列分析表明,该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明,PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示,此载体成功转染至COS7细胞中,并获得有效表达。结论:利用基因工程技术,成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体,并在真核细胞中获得有效表达,为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的：构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4，PF4)的真核表达载体，并在真核细胞中表达，为研究其生物学功能奠定基础。方法：人工合成PF4基因模板，通过PCR方法扩增PF4-cDNA，然后克隆至pUCl9克隆载体，经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果：获得了PF4-cDNA基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示，此载体成功转染至COS7细胞中。并获得有效表达。结论：利用基因工程技术，成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体，并在真核细胞中获得有效表达，为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

心脏转录因子Nkx2.5真核表达质粒的构建

目的构建人类心脏特殊转录因子Nkx2.5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2.5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法以质粒pCMV6-XL5-Nkx2.5为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2.5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx2.5的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2.5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果成功设计引物扩增出Nkx2.5基因编码区约1 000 bp的目的片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2.5基因序列。结论成功构建了含有Nkx2.5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。     

心脏转录因子Nkx2．5真核表达质粒的构建

目的构建人类心脏特殊转录因子Nkx2．5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2．5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法以质粒pCMV6-XL5-Nkx25为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2．5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx25的PCR产物分别在双酶切后用,T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2．5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果成功设计引物扩增出Nkx2．5基因编码区约1000bp的目的片段。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2．5基因序列。结论成功构建了含有Nkx2．5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定

背景:FasL通过与靶细胞上Fas结合诱导程序性细胞死亡,可维持机体内稳态,诱导同种异基因移植免疫耐受,促进肿瘤细胞凋亡.目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因hFasL的真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL.方法:通过实时聚合酶链反应RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出hFasL基因,与真核空载体 plRES2-EGFP一起,经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接,从而构建pIRES2-EGFP-hFasL.用紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度,经酶切、PCR技术、基因测序等方法进行鉴定.结果与结论:扩增出的hFasL条带大小约846 bp,构建的plRES2-EGFP-hFasL经酶切后在846 bp和2 000 bp处有特异性条带,DNA测序证实hFasL与Genebank上的序列完全一致.提示成功构建了含有hFasL及EGFP的真核表达载体plRES2-EGFP-hFasL.     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA4真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA4引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4。结果PCR扩增GRA4基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA4,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建与鉴定

目的构建神经同源盒基因Brn-4真核表达重组质粒。方法从新生SD大鼠脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法扩增编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,经BamHI、EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得鼠Brn-4的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确,为后续研究在神经干细胞中表达及其体内研究奠定了基础。     

家蚕素Ⅱ基因真核表达载体的构建

目的构建（BbxⅡ）基因真核表达载体,为研究家蚕素Ⅱ在哺乳动物细胞中的生物学作用奠定基础。方法以含有BbxⅡcDNA的PUC57质粒为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增BbxⅡcDNA片段。真核表达载体PcD-NA3.1及PCR产物经双酶切后连接,转化大肠杆菌DH-5α感受态菌,获得重组载体PcDNA3.1-Bbx/His,进行酶切鉴定和测序鉴定。结果 PCR获得与预期大小一致约300 bp的特异性DNA,重组载体PcDNA3.1-BbxⅡ/His经双酶切及测序鉴定证实,BbxⅡ基因的cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论成功构建含有家蚕素基因Ⅱ的真核表达载体。     

Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建

目的构建Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为体外扩增造血干细胞并保持其干细胞特性提供实验材料基础。方法应用PCR技术从质粒TAT-HA-HOXB4-Full中扩增编码人HOXB4的cDNA,用限制性内切酶EcoRI分别酶切HOXB4基因片段和带有Tet-on开关的可调控慢病毒载体,经T4DNA连接酶连接获得慢病毒载体Teto-Fuw-hHOXB4。对构建的HOXB4慢病毒载体进行酶切片段凝胶电泳及DNA测序分析。结果酶切片段电泳分析和DNA测序分析证明Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建成功。结论正确构建了Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为后续的体外扩增造血干细胞及相关研究提供材料。     

Transfection and functional expression of CYP4A1 and CYP4A2 using bicistronic vectors in vascular cells and tissues

20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE), a CYP4A-derived arachidonic acid metabolite, is a potent vasoconstrictor and a modulator of vascular reactivity. We have shown that CYP4A1 and CYP4A2 are the major CYP4A isoforms expressed in the rat renal microcirculation. In the present study, we constructed two bicistronic vectors, pIRES2-EGFP-4A1 and pIRES2-EGFP-4A2, and examined their functional efficacy in COS-1 and vascular smooth muscle (A7r5) cells and in microdissected rat interlobar arteries. Immunocytochemistry coupled with fluorescence microscopy of pIRES2-EGFP-4A1- or pIRES2-EGFP-4A2-transfected COS-1 and A7r5 cells indicated that both enhanced green fluorescence protein (EGFP) and CYP4A1/4A2 were expressed in 80 to 90% of the cells. Western blot analysis showed a 3- to 5-fold increase of CYP4A1 and CYP4A2 proteins in pIRES2-EGFP-4A1- and pIRES2-EGFP-4A2-transfected cells as compared with control pIRES2-transfected cells. Cells transfected with pIRES2-EGFP-4A1 and pIRES2-EGFP-4A2 catalyzed arachidonic acid omega-hydroxylation to 20-HETE at rates of 0.85 +/- 0.29 and 0.27 +/- 0.04 nmol/10(7) cells/h, respectively. Transfection of interlobar arteries with either plasmid yielded EGFP immunofluorescence that was localized to the intima, media, and adventitia. Arteries transfected with pIRES2-EGFP-4A1 and pIRES2-EGFP-4A2 showed increased vasoreactivity displaying EC50 to phenylephrine of 0.24 +/- 0.07 and 0.11 +/- 0.03 microM, respectively, as compared with arteries transfected with pIRES2-EGFP (1.11 +/- 0.21 microM; n=6, p <0.05). The increased vasoreactivity to phenylephrine was inhibited by N-methylsulfonyl-12,12-dibromododec-11-enamide, an inhibitor of CYP4A-catalyzed reactions, suggesting that a product of CYP4A1 and CYP4A2 catalytic activity contributed to the increased constrictor responsiveness. Removal of the endothelium did not prevent the sensitization to phenylephrine in vessels transfected with the plasmid containing the CYP4A1 cDNA, suggesting that the CYP4A product responsible for the sensitizing effect, presumably 20-HETE, is not of endothelial cell origin.     

携带双报告基因真核表达载体pHSV1-TK-IRES2-EGFP在小鼠骨髓间充质干细胞内的表达

背景：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（herpes simplex virus 1-thymidine kinase,HSV1-TK）与绿色荧光蛋白（EGFP）双报告基因共表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞内的表达研究报道较少。目的：构建pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,并检测其在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内的表达。方法：应用聚合酶链式反应从质粒pHSV106中扩增出HSV1-TK基因后与pMD18-T载体连接,构成重组质粒pHSV1-TK/18T。重组质粒以限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ进行双酶切,将其插入同样双酶切处理的pIRES2-EGFP载体内;并将新构成的重组质粒pHSV1-TK-IRES2-EGFP以脂质体法转染小鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论：酶切鉴定结果表明,扩增的HSV1-TK基因序列正确,大小为1130bp;重组质粒载体内的HSV1-TK序列与GeneBank报告的序列完全一致;骨髓间充质干细胞转染后在荧光显微镜下可以观察到有特异性绿色荧光出现,HSV1-TK的mRNA有表达。实验成功构建了pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内能有效的表达。     

携带双报告基因真核表达载体pHSV1-TK-IRES2-EGFP在小鼠骨髓间充质干细胞内的表达

背景:单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpes simplex virus 1-thymidine kinase,HSV1-TK)与绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因共表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞内的表达研究报道较少。目的:构建pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,并检测其在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内的表达。方法:应用聚合酶链式反应从质粒pHSV106中扩增出HSV1-TK基因后与pMD18-T载体连接,构成重组质粒pHSV1-TK/18T。重组质粒以限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ进行双酶切,将其插入同样双酶切处理的pIRES2-EGFP载体内;并将新构成的重组质粒pHSV1-TK-IRES2-EGFP以脂质体法转染小鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论:酶切鉴定结果表明,扩增的HSV1-TK基因序列正确,大小为1130bp;重组质粒载体内的HSV1-TK序列与GeneBank报告的序列完全一致;骨髓间充质干细胞转染后在荧光显微镜下可以观察到有特异性绿色荧光出现,HSV1-TK的mRNA有表达。实验成功构建了pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内能有效的表达。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor，hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。方法：实验于2005—03／2006—01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3．1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中，构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

pIRES2-EGFP/cbfa1真核双表达载体的构建及鉴定

目的 构建成骨细胞特异性转录因子Cbfa1双表达载体，以期用于成骨的体内、外研究。 方法 以含有全长cDNA的pCMV/Cbfa1为模板，PCR扩增Cbfa1，T-A克隆，酶切亚克隆到pIRES2-EGFP载体上，酶切、PCR及测序鉴定正确后命名为pIRES2-EGFP，脂质体转染NIH3T3细胞，G418筛选稳定表达后，提取细胞的总蛋白，Westerbblot检测Cbfa1蛋白的表达，以未转染组为对照。结果 酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP/Cbfa1载体序列正确，脂质体法转染NIH3T3细胞后可见绿色荧光蛋白的表达，Western-blotting检测到cbfa1在蛋白水平的表达。结论 pIRES2-EGFP/Cbfa1载体构建成功，为后续研究奠定基础。     

转录因子Foxp3对RAW264.7细胞表型及免疫抑制相关基因的影响

目的 应用过表达转录因子Foxp3的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞模型,探讨转录因子Foxp3对RAW264.7细胞表型及免疫抑制相关基因的影响,从而为移植排斥提供新的细胞治疗措施奠定基础.方法 采用脂质体转染重组质粒pIRES2-EGFP/mFoxp3及空载质粒pIRES2-EGFP至小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,经G418筛选后,免疫荧光显微镜及流式细胞术检测GFP表达、RT-PCR检测Foxp3表达以鉴定表达效果;采用RT-PCR检测转染重组质粒pIRES2-EGFP/mFoxp3、空载质粒pIRES2-EGFP以及未转染质粒组的RAW264.7细胞表面分子CTLA-4、GITR及GITRL的表达水平;采用RT-qPCR的方法检测各组RAW264.7细胞iNOS及Arg1的表达水平.结果 成功建立稳定表达Foxp3的巨噬细胞RAW264.7细胞模型;与转染空载质粒pIRES2-EGFP和未转染质粒的RAW264.7细胞相比,转染重组质粒pIRES2-EGFP/mFoxp3的RAW264.7细胞的表面分子CTLA-4、GITR及GITRL 的mRNA表达水平明显升高（P〈0.01）,免疫抑制相关基因iNOS及Arg1的 mRNA表达水平也明显升高（P〈0.01）.结论 转录因子Foxp3能够使RAW264.7细胞表面分子及免疫抑制相关基因的表达水平明显升高,可能发挥抑制免疫应答的作用,从而在治疗移植排斥中发挥作用.