硼替佐米对K562/DNR细胞株MAPK信号途径的影响

本研究旨在检测硼替佐米对柔红霉素（daunorubicin,DNR）诱导的K562耐药细胞株K562/DNRMAPK信号途径中ERK、JNK及P38的影响,探讨硼替佐米逆转白血病细胞耐药的分子机制。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）进行耐药细胞株和硼替佐米细胞毒性的判定。选用4μg/L硼替佐米作为实验用药,以100μg/mlDNR单用或联合应用硼替佐米作用于K562/DNR细胞株12、24和36小时,应用Western blot检测不同时间点各组ERK、JNK、p38及P-gp的表达水平,同时应用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果表明,与DNR组相比,在总ERK1/2、p38及JNK无明显变化的情况下,硼替佐米联合DNR可抑制P-ERK、P-P38的表达,增加P-JNK的表达（p〈0.05）,同时减少P-gp表达,其作用随作用时间延长而增强,同时加用硼替佐米可增加细胞凋亡率。结论：硼替佐米可通过MAPK信号通路逆转白血病细胞耐药性,增加细胞凋亡率,该作用呈时间依赖性。     

硼替佐米对K562细胞增殖、凋亡及SHIP基因表达的影响

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)对K562细胞的增殖、凋亡及SHIP基因表达的影响。将不同浓度的硼替佐米作用于K562细胞,采用MTT法测定细胞增殖活性,用流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR方法检测SHIP mRNA表达。结果表明,硼替佐米10、20、50和100 nmol/L作用于K562细胞24 h,细胞增殖抑制率分别为(5.76±1.47)%、(10.55±1.59)%、(17.14±2.05)%和(27.69±3.57)%,空白对照组为(1.30±0.10)%;20nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24、48、72 h,细胞增殖抑制率分别为(10.55±1.59)%、(16.33±2.53)%、(19.78±1.56)%,24 h组与48 h组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),10、20、50、100 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24h,Annexin V-FITC/PI双标法显示其凋亡率分别为(12.7±0.6)%、(26.9±0.9)%、(32.6±1.2)%、(72.5±1.5)%,均高于对照组(1.0±0.5)%(P<0.05)。RT-PCR法检测结果显示应用硼替佐米作用后SHIP mRNA表达上调明显,与空白对照组比较差异有统计学意义。结论:硼替佐米呈时间、浓度依赖性抑制K562细胞增殖,并能通过上调SHIP基因的表达诱导细胞凋亡。     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米对K562细胞株NF-κB活性及ICAM-1表达的影响

为了研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对急性白血病K562细胞株核因子κB（NF-κB）及细胞间黏附分子（ICAM-1）表达的影响，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液体外培养K562细胞，用0、10、20、30、50、100nmol/L的硼替佐米干预K562细胞6小时后收集细胞。用SP免疫组织化学法测各组细胞NF-κB活性，并以反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析K562细胞ICAM-1表达的变化。结果表明：各药物处理组K562细胞NF-κB的活性和ICAM-1的表达均明显受抑制，与对照组相比，存在显著性差异（P〈0．05），且各组NF-κB活性与ICAM-1表达成正相关。结论：蛋白酶体抑制剂硼替佐米可能通过抑制NF-κB活性下调细胞间黏附分子ICAM-1的表达，这为白血病靶向治疗提供了一个新的途径。     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米对K562细胞株NF-κB活性及ICAM-1表达的影响

为了研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对急性白血病K562细胞株核因子κB(NF-κB)及细胞间黏附分子(ICAM-1)表达的影响,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液体外培养K562细胞,用0、10、20、30、50、100nmol/L的硼替佐米干预K562细胞6小时后收集细胞。用SP免疫组织化学法测各组细胞NF-κB活性,并以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析K562细胞ICAM-1表达的变化。结果表明:各药物处理组K562细胞NF-κB的活性和ICAM-1的表达均明显受抑制,与对照组相比,存在显著性差异(p<0.05),且各组NF-κB活性与ICAM-1表达成正相关。结论:蛋白酶体抑制剂硼替佐米可能通过抑制NF-κB活性下调细胞间黏附分子ICAM-1的表达,这为白血病靶向治疗提供了一个新的途径。     

硼替佐米对K562细胞增殖、凋亡及其对XIAP表达的影响

目的 研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomi)对白血病细胞株K562细胞的增殖、凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响.方法 将不同浓度的硼替佐米作用于K562细胞,采用WST-1法测定细胞增殖活性,瑞特-吉姆萨染色观察细胞形态学变化,用流式细胞术、原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,RT-PCR法检测XIAP mRNA表达,SP免疫组化法检测XIAP蛋白的表达.结果 5、10、30、50、100 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,细胞增殖抑制率分别为(13.6±0.2)%、(28.7±0.5)%、(55.4±1.1)%、(68.1±1.1)%、(81.4±0.1)%,空白对照组为(1.2±0.0)%(P＜0.05),24 h IC50值为24.6 nmol/L.30 nmoL/L硼替佐米作用于K562细胞12、24、36、48 h,细胞增殖抑制率分别为(29.1±0.9)%、(55.4±1.1)%、(57.8±0.8)%、(59.8±1.2)%,12 h组与24 h组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),但24 h组与36、48 h组比较差异有统计学意义(P＞0.05);30 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,镜下可见细胞核固缩、核边集、核碎裂,胞质中见大量空泡及凋亡小体,对照组细胞形态正常.TUNEL检测法显示凋亡细胞阳性率为49.0%,空白对照组阳性率2.3%(P＜0.05).10、30、100 nmoL/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,AnnexinⅤ-FTTC/PI双标法显示其凋亡率分别为(32.2±1.2)%、(53.9±1.3)%和(81.3±2.8)%,均高于对照组(0.3±0.6)%(P＜0.05).RT-PCR法检测结果显示随硼替佐米浓度增高,XIAP mRNA表达下调明显.免疫组化结果显示硼替佐米组XIAP蛋白表达下调,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 硼替佐米呈时间、浓度依赖性抑制K562细胞增殖,并可能通过下调XIAP的表达诱导细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the effect of proteasome inhibitor bortezomib on proliferation,apoptosis of K562 cells and the expression of XIAP. Methods K562 cells were treated with bortezomib at different concentration. Cell proliferation was analyzed by WST-1 assay, cell apoptosis by flow cytometry and TUNEL, XIAP mRNA expression from 5 - 100 nmol/L by RT-PCR, and XIAP protein expression by SP immunohistochemistry. Results K562 cells were treated with bortezomib at different concentrations for 24 h respectively, the cells growth was significantly inhibited with inhibition rates from( 13.6 ±0.2)% to (81.4 ±0. 1 ) %, respectively, being markedly higher than that of control ( 1.2 ± 0. 1 ) % ( P ＜ 0. 05 ). IC50 was 24.6 nmol/L of bortezomib treated for 24 h. When K562 cells were treated with 30 nmol/L of bortezomib for 12 - 48 h, the inhibition rates were (29.1 ± 0. 9) % to (59.8 ± 1.2 ) %, respectively, the differences being statistically significant( P ＜0.05 ) between 12 h group and 24 h group, while there was no statistical difference between 24 h, 36 h and 48 h groups. K562 cells treated with 30 nmol/L bortezomib for 24 h showed nuclear condensation, nuclear margination, nuclear fragmentation, cytoplasmic vacuoles and a large number of apoptotic body formation. The apoptotic cells rate was 83.67% in bortezomib treated group, and 2.33% in untreated group (P ＜ 0.05 ). The expression of XIAP mRNA was decreased in a dose-dependent manner, and the expression of its protein was down-regulated. Conclusion Bortezomib can inhibit the proliferation of K562 cells, and induce apoptosis by down-regulating the expression of XIAP, providing the laboratory evidence for the targeted therapy in acute leukemia.     

硼替佐米和柔红霉素联合应用对多发性骨髓瘤细胞株KM3的作用

为了研究硼替佐米（bortezomib,Bor）单用及与柔红霉素（daunorubicin,DNR）联合应用对多发性骨髓瘤（multiple mydoma,MM）细胞株KM3细胞的抑制作用,采用MTT法检测Bor单用及与DNR联合应用对KM3细胞的抑制作用,求出其IC50。结果表明：Bor、DNR对KM3细胞生长抑制作用呈浓度依赖性,IC50分别为0．27μmoL／L,0．16μmol／L;Bor联合DNR对KM3细胞生长抑制作用明显增强（P〈0．05）。结论：在体外,Bor联合DNR对KM3细胞生长抑制有协同作用。     

硼替佐米与阿糖胞苷联用对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bor)单独或联合阿糖胞苷(Ara-C)对髓系白血病细胞系K562细胞增殖、凋亡的影响,并分析可能的作用机制.方法以20 nmoL/L的Bor、0.2μg/ml的Ara-C分别单独处理以及小同序贯方式联合处理K562细胞48 h后,MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术榆测细胞凋亡率.并在两药分别单独处理6 h后用SP免疫组化法分析细胞NF-κB活性及流式细胞术检测细胞周期的变化.结果不同方式联合用药组细胞生长抑制率与细胞凋亡率均高于 两药分别单独处理组(P<0.01),而且在各联合用药组中,先加入Ara-C预处理6 h后冉序贯加入Bor组的细胞生长抑制率和细胞凋亡率分别为(81.5±4.0)%和(29.2±3.1)%,均高于先加入Bor预处理6 h后序贯Ara-c组[(54.1±4.2)%、(18.7±3.5)%]和同时加入组[(66.2±2.8)%、(21.1±2.2)%](P<0.01).Bor单独处理细胞6 h,细胞NF-κB活性减低,细胞阻滞于G_2/M期;Ara-C单独处理细胞6 h,NF-κB活性增高,G_1期细胞明显增多.结论 Bor可有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,与Ara-C联合,这种效应显著增强,尤以Ara-C预处理后序贯Bor组影响最大.Ara-C预处理后,对NF-κB及细胞剧期的影响可能足发挥更大协同效应的原因.     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合柔红霉素对HL-60细胞的凋亡作用和Survivin mRNA表达的影响

目的：研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bor）单用或联合柔红霉素（DNR）对HL-60细胞凋亡和Survivin mRNA表达的影响。方法：将不同浓度Bor,DNR及两药联合组和对照组作用于HL-60细胞,采用MTT法测定细胞增殖活性,RT—PCR检测Survivin mRNA表达。结果：5nmol／L Bor作用24h对HL-60细胞有增殖抑制作用,并诱导其凋亡。随着浓度增加及其作用时间的延长可使细胞凋亡率明显增加,10nmol／LBor与1．0μmol／L DNR联合作用72h细胞凋亡率最高,与同剂量两药单独作用相比差异有显著性（P〈0．01）。RT—PCR检测结果表明：随着药物浓度的增加,Survivin mRNA的表达逐渐下降,10mmol／L Bor与1．0μmol／L DNR联合作用72h Survivin mRNA表达最低。结论：Bor能显著抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,Bor联合DNR对HL-60细胞有协同作用,并能显著下调Survivin基因的表达,这可能是促使HL-60细胞凋亡的机制之一。     

柔红霉素对K562细胞凋亡的影响

目的 研究柔红霉素(DNR)对白血病K562细胞细胞凋亡的影响.方法 对数生长期K562细胞随机分A、B两组,A组(对照组):加RPMI-1640培养液;B组 (DNR组):分别加DNR0.2、2、20 μmol/L分别作用1 、2 、6 、24 h后,用流式细胞检测术检测K562细胞的凋亡率.结果 在没有药物的作用下,K562细胞存在自然凋亡.DNR组: 0.2 μmol/L分别作用1、2、6、24 h,细胞凋亡率与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05);2 μmol/L作用于K562细胞1 h,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);作用2、6、24 h,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01);20 μmol/L作用1、2、6、24 h,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01).结论 DNR能促进K562细胞凋亡,并存在剂量、时间依赖性.     

硼替佐米体外诱导K562细胞凋亡的作用不受骨髓间充质干细胞的影响

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米在有或无骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells)条件下对白血病细胞株K562促凋亡作用,以及对MSC和K562细胞的黏附分子VCAM-1表达的影响.建立MSC和K562细胞的共培养体系,以终浓度为50 mnol/L的绷替佐米处理K562细胞4-24小时,应用Annexin-V/PI双染法检测K562细胞凋亡,半定量RT-PCR检测VCAM-1 mRNA的表达.结果显示,硼替佐米可诱导K562细胞凋亡,并呈现时间依赖性;共培养组调亡细胞比例与单独培养组相比无显著差异;K562细胞与MSC共培养可诱导K562细胞表达VCAM-1,MSC在共培养前后表达VCAM-1无明显变化.硼替佐米作用24小时后,K562细胞表达VCAM-1消失,MSS表达VCAM-1明显下降.结论:硼替佐米在MSC存在的情况下依然可诱导白血病细胞凋亡,提示硼替佐米可拮抗MSC对白血病细胞的保护作用.     

索拉非尼联合柔红霉素对K562细胞株协同作用的研究

本研究探讨索拉非尼(sorafenib,SOR)联合柔红霉素(daunorubicin,DNR)对K562细胞株的增殖活性及凋亡的影响。采用MTT法检测K562细胞株在索拉非尼单药及联合柔红霉素作用下增殖的抑制效应,根据两药相互作用指数(coefficient of drug interaction,CDI)评价两药相互作用性质,并用Hoechst33258荧光染色及流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果表明:索拉非尼单药及联合柔红霉素对K562细胞株有显著的抑制效应,而且两药联合应用具有协同作用,联合组凋亡细胞增加。结论:柔红霉素和索拉非尼联合作用于白血病细胞株K562呈现明显的协同抑制作用。     

汉防己甲素联合柔红霉素对K562／A02细胞株P21蛋白和P糖蛋白表达的影响

本研究旨在探讨汉防己甲素（TET）对人慢性髓系白血病（CML）急性红白血病细胞株K562／A02多药耐药的逆转作用,及其逆转耐药与细胞周期依赖性激酶抑制因子（p21）、P糖蛋白（P—gp）及其基因的关系,为TET的临床应用提供新的理论基础。K562／A02细胞实验分组为：①单用柔红霉素（DNR）对照组;②DNR＋TET0．5mg／L组;⑧DNR＋TET1．0mg/L组;④DNR＋TET2．0m8／／L组。采用Western blot法检测实验各组K562／A02细胞P21的表达。采用流式细胞仪（FCM）检测实验各组细胞P—gp的表达,采用半定量PCR（RT—PCR）测定细胞MDR1基因mRNA表达水平。结果表明：K562／A02细胞中P21蛋白的表达随着TET浓度的增加而增强,P—gp蛋白的表达随着TET浓度的增加而减低。K562细胞中mdr1基因几乎无表达,K562／A02细胞中mdrl基因高表达,随着TET浓度的增加K562／A02细胞mdrl基因表达不断降低。结论：TET对K562／A02耐药具有逆转作用且呈浓度依赖性,其逆转耐药可能与其上调P21蛋白的表达、下调mdrl及P—gp的表达有关,     

拓朴替康诱导K562细胞凋亡时p38MAPK的变化

目的:探讨拓朴替康诱导K562细胞凋亡的相关信号转导途径。方法:0.1μmol/L的拓朴替康处理K562细胞24h时,通过流式细胞仪(FCM)和片段DNA含量检测研究拓朴替康对靶细胞的促凋亡活性;采用免疫印迹法和γ-32P掺入法测定拓朴替康对p38MAPK含量及其活性的影响。结果:FCM检测发现在K562细胞周期图中出现一凋亡峰,凋亡细胞比率为16.9%,凋亡细胞特有的片段DNA含量为(45.9±1.0)%;p38MAPK含量及其活性明显升高,分别为对照组的4.9倍和4.1倍。结论:拓朴替康诱导K562细胞凋亡可能通过激活p38MAPK来实现。     

BCR-ABL抑制剂ST1571对慢性髓系白血病细胞株K562中SARI基因表达影响的研究

为了探讨抑癌基因SARI（suppressor of AP-1 regu1atexi by IFN）在慢性髓系白血病（CML）中表达调控可能的分子机制,收集了46名CML患者和40名健康志愿者外周血样品,使用实时定量PCR技术检测2组人群~eSAIU基因的相对表达水平。在体外以CML细胞株I（562为研究模型,使用BCR．ABL抑制剂ST1571（imatinib）处理K562细胞,用实时定量PCR技术检测聃耐基因的相对表达水平。结果表明,CML患者外周血中SAR1mRNA相对表达量明显低于健康志愿者,2组间具有明显的统计学差异（P〈0．001）。使用ST1571（2．5μmo1／L）处理K562细胞24小时后SARImRNA相对表达量明显高于未处理K562细胞,两组间差异具有显著性（P〈0．001）。结论：CML患者外周血SARImRNA表达水平降低可能与该疾病的发生发展过程相关联,而且融R,基因表达下调与BCR-ABL抑制作用有关。本研究为CML患者基因治疗的研究提供了新线索。