联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶实现红细胞AB→O血型转变

目的研究酶解去除AB型红细胞表面的A和B抗原、实现AB→O血型转变的方法,以获得通用型红细胞。方法联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶酶解AB型红细胞,用单克隆抗-A、抗-A1和抗-B抗体检测酶解效果,用稀有血型抗体检测酶解前后红细胞表面的稀有血型,用流式细胞术检测酶解前后红细胞表面A、B、H抗原,原子力显微镜观察酶解前后红细胞形态,主侧配血试验检测酶解红细胞是否符合临床输血要求。结果A1B和A2B亚型红细胞的A、A1和B抗原均能够完全被酶解去除,酶解前后红细胞的稀有血型抗原不变;流式细胞术显示,酶解后AB型红细胞表面的A和B抗原消失,而H抗原明显增加,和O型红细胞相当;酶解不影响红细胞的形态;主侧配血试验证明酶解改造后的AB型红细胞可以安全输给O、A、B、AB等各型受血者。结论联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶成功实现了AB→O血型转变,获得酶解通用型红细胞。     

丙氨酸溶液作为A-0血型转变酶解缓冲液的研究

本研究旨在探讨丙氨酸缓冲液对α-N-乙酰半乳糖胺酶发挥高效酶解A抗原活性的影响。用Westernblot检测α-N-乙酰半乳糖胺酶在丙氨酸等不同缓冲液中与红细胞的结合能力。结果表明，丙氨酸溶液也可以作为A-O血型转变的酶解缓冲液，α-N-乙酰半乳糖胺酶在丙氨酸溶液中酶解A型红细胞所用剂量与在甘氨酸溶液中的相当；Westernblot证实，在丙氨酸溶液中α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞结合能力与在甘氨酸中相似，这也进一步证明α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞的结合是α-N-乙酰半乳糖胺酶发挥酶解A抗原的活性所必需的。结论：丙氨酸溶液可以作为A—O血型转变的酶解缓冲液，在这-缓冲液中α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞紧密结合，可以发挥高效的酶解A抗原的活性。     

原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造.在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化.利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞.结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D(600)为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时.纯化后α-丰乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg.该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞.结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶.     

ABO血型不合异基因造血干细胞移植后血型转换期的输血策略

背景:造血干细胞移植是目前临床治愈血液系统恶性肿瘤、先天性遗传性疾病以及自身免疫性疾病的重要手段,ABO血型不合的异基因造血干细胞移植并不影响造血干细胞的植活,但ABO血型不合在移植后血型转换期输血时应该制定何种输血策略值得研究。目的:研究ABO血型不合的异基因造血干细胞移植后血型转换期血型抗原抗体的变化及输血时血液的选择策略。方法:应用血型鉴定、抗体检测、抗体效价测定、交叉配血等方法,对24例ABO血型不合的异基因造血干细胞移植患者,在血型转换期进行血型抗原抗体的监测和输血前相容性检测,并与同期30例血型相合的异基因造血干细胞移植患者进行比较,选择适合的血液。结果与结论:24例ABO血型不合患者于移植后全部获得造血重建,但在红系恢复时间上,主要血型不合组和主次要均不合组的时间均有延长,差异均有显著性意义(P<0.05)。根据血型转换期监测的ABO抗原和相应抗体发生的变化,主要ABO血型不合移植者在血型转换期均输注了患者型红细胞;次要血型不合者根据抗原减弱的情况,从输患者型过渡到输供者型红细胞;主次要均不合的患者,从首先输注O型洗涤红细胞再过渡到输注供者型红细胞,24例患者均未发生任何溶血性输血反应。因此ABO血型不合的异基因造血干细胞移植后的输血策略,应根据患者血型转变情况及抗体效价动态变化,权衡所选血型对造血重建的影响,选择合适的血液成分输血,可避免溶血性输血反应且不影响干细胞植活及血型转换时间,保证患者移植安全。     

血型转变

本文描述了人血红细胞表面分子结构及其基因,介绍了有关血型转变的研究进展。从绿色咖啡豆中制备的α-半乳糖苷酶可以将B型血转变为O型血。体外研究证明了转型后的红细胞的完整性,正常活存率,呈现O型血的免疫特征。人Ⅰ期临床实验证明,转型后的B型红细胞可以安全地输给A型和O型血的自愿受试者。用mPEG包裹人血红细胞制备的通用型血,也能应用于临床输血。     

通用型红细胞输血与配合型输血联合应用在创伤失血性休克抢救中的价值研究

目的:探索创伤失血性休克患者抢救治疗中通用型红细胞输血联合配合型输血的应用价值。方法:选取2016年9月—2019年9月我院收治的90例创伤失血性休克患者作为研究对象,随机分为对照组、通用型+交叉配血输血组、通用型+配合型输血组,每组30例。对照组实施传统紧急输血,通用型+交叉配血输血组在15 min内进行通用型红细胞输血、随后进行ABO/RhD血型及交叉配血相合输血,通用型+配合型输血组在15 min以内发通用型红细胞输血、随后予ABO或RhD主要抗原相合的配合型输血。比较3组的病死率、输血有效性、输血不良反应和红细胞不规则抗体检测阳性率。结果:通用型+配合型输血组与通用型+交叉配血输血组24 h内病死率和总病死率均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),通用型+配合型输血组24 h内病死率和总病死率与通用型+交叉配血输血组比较,差异无统计学意义(P>0.05),3组间的24 h后病死率比较差异无统计学意义(P>0.05)。输血后24 h,3组红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞比容均高于输血前,差异均有统计学意义(P<0.05),但3组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3组患者输血后24 h内过敏、非溶血性发热、溶血等不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。输血后1个月,3组患者红细胞不规则抗体检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:创伤失血性休克患者输注通用型红细胞后继续予以配合型输血,该方案有效性与安全性与传统紧急输血方案相当,但可降低24 h病死率和总病死率,值得推广。     

利用新型α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

目的利用原核生物来源的α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造研究。方法应用PCR的方法从脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)中克隆了新型α-半乳糖苷酶基因,构建原核生物表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导α-半乳糖苷酶的胞内可溶性表达,应用重组酶的上清液进行B型红细胞(RBC)初步酶解试验。结果重组酶分子量约为64.6 kD,超声破碎的菌液上清中的酶活力约为2 U/ml。在26℃及pH 6.8的等渗柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中2,h内完全酶解200μl B型RBC需要30μl的上清液,酶解后的B型RBC与抗-B和抗-A单克隆抗体不凝集,流式细胞术检测结果显示酶解后B型RBC的血型抗原呈现O型特征。结论重组的α-半乳糖苷酶可以有效的将B型RBC转变为O型RBC。     

创伤紧急救治通用型红细胞输注的应用实施及效果评价

目的分析《创伤紧急救治通用型红细胞输注专家共识》和探讨医院在创伤紧急医疗抢救输注通用性红细胞的效果和意义。方法按照《创伤紧急救治通用型红细胞输注专家共识》(简称《专家共识》)和《特殊情况紧急抢救输血推荐方案》(简称《推荐方案》),从临床输血数据库和医院病案系统收集2016年1月—2017年12月本院战创伤中心(简称战创中心)紧急抢救输注通用型红细胞(献血者IgM或IgG抗-A和抗-B效价均≤256的0型RhD阳性悬浮红细胞)的34名患者,分析并总结病例的临床特征与紧急输注通用型红细胞的启动指征、启动流程、实施方案、患者的转归和救治效果。结果 2年间,依据《专家共识》及《推荐方案》,共对战创中心34名患者启用通用型红细胞,占该中心同时输血患者的1.27%(34/2 683),共输通用型红细胞109 U,平均(3.2±1.8)U/人;ABO、RhD血型:2人未来得及检测出,10人为A、D阳性,3人AB、D阳性,6人为B、D阳性,13人为O、D阳性。24 h抢救成功率58.8%(20/34),17人康复出院;所有患者均未出现输血不良反应,非O型患者输注通用型红细胞后亦未出现溶血性输血反应。结论依据《专家共识》和《推荐方案》,在第一时间输注通用型红细胞紧急救治创伤患者,使得抢救输血更及时有效,赢得了治疗时间、有益于挽救患者生命。     

1例罕见B（A）血型鉴定及其临床安全输血策略初探

目的 鉴定罕见B（A）血型并探讨其临床安全输血策略。方法 利用全自动血型分析仪检测ABO血型,发现正反定型不符的一位患者,利用血型血清学和分子生物学方法对该患者及其家系中9位成员进行血型鉴定和ABO血型基因测序,分析该家族血型的遗传特点;并对该血型的患者进行临床输血探讨,确保临床输血安全。结果 患者为B（A）血型,与B101基因序列比对,均为nt640A>G,基因型鉴定为B(A)04/O01,B(A)型血清与同型红细胞以及O型、B型红细胞不凝集,B(A)型红细胞与同型以及AB型血清不凝集。结论 血型血清学方法可以对正反定型不符的B（A）血型做出初步判断,分子生物学技术可以进一步准确判断该血型;临床输血应采取自体输血、同型输注及配合相容性输血。     

ABO血型抗体吸附剂:冻干红细胞膜的初步研究

目的制备冰冻干燥红细胞膜,探索其作为ABO血型抗体吸附剂去除血型抗体、制备通用型红细胞的可行性。方法收集A、B型红细胞膜,作冰冻干燥处理,与O型血浆中血型抗体反应后,检测血浆中抗体效价,评价其对血浆抗体的吸附效果;检测红细胞结构、功能及血浆中凝血因子活性变化,评价冻干红细胞膜与红细胞及凝血因子的兼容性;采用离心的方法去除残留的冻干红细胞膜。结果冰冻干燥红细胞膜上的抗原可有效吸附血型抗体、降低血浆中的血型抗体效价,全血中红细胞的变形指数、ATP含量,与反应前比较差异无统计学意义(P>0.05),反应前后均在正常参考范围内;全血血浆中各种凝血因子活性在吸附前后比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。采用离心法可去除冻干红细胞膜,清除率约为77%。结论冰冻干燥的红细胞膜保持了很好的抗原性,作为ABO血型抗体的吸附剂能够有效去除ABO血型抗体;冰冻干燥红细胞膜不影响其中红细胞和凝血因子的理化性状和生物活性,并可通过离心的方法去除。     

侧柏叶中黄酮类化合物对H2O2诱导的人红细胞氧化作用的影响

目的 :观察侧柏叶中黄酮类化合物对H2 O2 诱导的人红细胞氧化作用的影响。方法 :用健康成人静脉血制成1%RBC悬液 ,分为H2 O2 损伤组、损伤加不同浓度的黄酮组、损伤加不同浓度的丹参组 (阳性对照 ) ,孵育后测定RBC溶血度和RBC悬液中丙二醛 (MDA)浓度。结果 :加药组的溶血度及MDA的含量分别下降 ,并与药物浓度相关。结论 :黄酮类化合物具有抑制H2 O2 引起的人红细胞溶血和红细胞脂质过氧化作用     

通用O型全血的初步研究

目的探讨冰冻干燥红细胞膜的制备技术及通用O型去除血型抗体全血的可行性。方法将A型及B型红细胞膜经过冰冻干燥处理后,加入O型全血中,经反应后测定血浆中血型抗体效价,并检测红细胞结构及功能,检测血浆中凝血因子活性变化。结果经过冰冻干燥处理后,红细胞膜仍具有抗原性,可有效降低血浆中的血型抗体效价,而全血中红细胞的变形指数、ATP含量与反应前差异无显著性,反应前后均在正常参考范围内;全血血浆中各种凝血因子活性在吸附前后比较,差异无显著性。结论尽管红细胞膜在体内是否产生大量抗体及其清除过程等尚需进行动物实验确定,但使用冰冻干燥红细胞膜制备通用型血液过程简便易行,具有进一步的研究价值。     

利用外周血单个核细胞生产成熟红细胞

体外制备红细胞的方法大多使用脐血、骨髓或外周动员的CD34＋细胞或胚胎干细胞作为起始材料.本研究利用外周血单个核细胞为原料在体外生产成熟红细胞.以血液滤涂白细胞后剩余的白膜层为原料,从中分离出单个核细胞,然后通过4步培养法制备成熟的红细胞.结果表明：经过不同细胞因子组合的诱导以及小鼠基质细胞系MS-5的支持培养,外周血单个核细胞的扩增倍数达到约1 000倍,其中约90％的细胞是与正常红细胞形态相似的无核成熟红细胞.集落形成能力分析显示,本研究培养体系可使单个核细胞中的祖细胞增殖并且只向红系方向分化.结构和功能分析结果表明,体外培养出的红细胞的平均细胞体积（MCV）为118±4fl,比正常红细胞（80-100 fl）稍大.平均血红蛋白含量（MCH）为36±1.2 pg,比正常的红细胞水平（27-31 pg）稍高.红细胞的最大变形指数（DImax）为0.46,接近正常红细胞水平.葡萄糖6磷酸脱氢酶及丙酮酸激酶的含量与年轻红细胞的特性一致.结论：利用外周血白膜层中含有的造血干祖细胞,通过体外培养能够生产出成熟红细胞,它是一种取材方便、成本低廉的红细胞生产原料,本研究培养体系适于利用单个核细胞生产成熟红细胞.     

Transfusion to blood group A and O patients of group B RBCs that have been enzymatically converted to group O

BACKGROUND: The transfusion of ABO-incompatible RBCs is the leading cause of fatal transfusion reactions. Group O RBCs, lacking terminal immunodominant A and B sugars to which humans are immunized, are safe for transfusion to persons of any ABO blood group. With the use of a recombinant alpha-galactosidase to remove terminal galactose from group B RBCs, the safety and efficacy of enzyme-converted group-B-to-group-O (ECO) RBC components were studied in transfusion-dependent patients. STUDY DESIGN AND METHODS: Twenty-four patients (blood groups A and O) were randomly assigned to receive transfusion(s) of either ECO or control group O RBCs. If a second transfusion was given, the other blood component was administered. RESULTS: Twenty-one patients were given ECO RBCs; 18 also underwent control transfusions. One patient received only a small aliquot for RBC survival studies, instead of a full-unit transfusion, because his serum was incompatible with ECO RBCs. No adverse events occurred. Both ECO and control transfusions resulted in appropriate Hb increments and comparable (51)Cr-labeled RBC survival studies. One patient developed a transient, weak-positive DAT, without hemolysis. Two weeks after transfusion, 5 of 19 evaluable ECO RBC recipients had increases in anti-B titers. CONCLUSION: ECO RBCs were comparable to group O cells for safety and efficacy in this study. The clinical significance of the increase in anti-B and of occasional serologic incompatibilities with ECO RBCs is unclear. If strategies can be developed to remove A epitopes, enzymatic conversion could be used to create a universal (group O) donor blood supply.     

主要ABO血型不合异基因造血干细胞移植后纯红细胞再生障碍

目的 研究主要ABO血型不合异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后患者纯红细胞再生障碍（PRCA）的发病情况及危险因素。方法 分析移植后患者PRCA的发病危险因素，比较抗A凝集素与抗B凝集素对红系造血恢复的影响。结果 100例ABO血型主要及主次要均不合allo-HSCT患者中，12例发生PRCA。A供O者9例，A供B者1例，B供O者2例。有抗A凝集素的患者（10例）较有抗B凝集素的患者（2例）易发生PRCA（P〈0．05）。PRCA的发生不影响急性移植物抗宿主病（GVHD）或巨细胞病毒（CMV）感染的发生。发生PRCA时血型转换的中位时问为150．5d，显著长于无PRCA发生患者（60．0d）（P〈0．05）；红系恢复的中位时间为203．5d，显著长于无PRCA发生患者（76．0d）（P〈0．05）。有抗A凝集素的患者血型转换中位时间为90．0d，显著长于有抗B凝集素的患者（55．0d）（P〈0．05）；红系恢复中位时间为98．0d，长于有抗B凝集素者（80．0d）（P〉0．05），但差异无统计学意义。结论 PRCA是ABO血型不合移植的合并症之一。A供O是主要ABO血型小合allo-HSCT后PRCA发病的危险因素。     

NO对不同天龄红细胞保存质量影响的初步研究

目的探讨一氧化氮(NO)对采用percoll密度梯度离心法分离的不同天龄红细胞(RBC)功能状态的影响作用。方法 1)将Percoll细胞分离液配制成5个不连续密度梯度(1.091,1.098 5,1.106,1.113 5,1.121 g/ml),将RBC按平均密度大小分层,依次吸取每层RBC分别做RBC内丙酮酸激酶(PK)含量测定并计算天龄、RBC内ATP含量检测、RBC变形性评价,以及RBC膜蛋白Western Blot。2)从同1份滤白全血中取出2等份,1份为实验组:加适宜浓度的NO溶液,另1份为对照组:加等体积红细胞保存液Ⅲ,分别于保存初期、中期、末期检测2组血液及不同天龄RBC的功能。结果 1)同1份样品经密度梯度离心分离后,RBC随着密度的增大,PK活性逐渐减小(6.192±1.25、5.165±0.84、4.538±0.76,P0.05)、天龄逐渐增加(10.409、34.957、49.945)、ATP含量逐渐减少(4.755±0.037、3.242±0.445、2.929±0.153,P0.01)、RBC变形性逐渐降低(200-1切变率下,0.381±0.005、0.340±0.033、0.281±0.028、P0.05)、RBC膜带3蛋白量减小、聚簇化的带3蛋白量增多、膜上结合的IgG含量增多。2)NO组与对照组相比,全血各指标无明显差异,但NO组保存中、末期老年RBC变形性明显高于对照组(200-1切变率下,中期:0.290±0.021 vs 0.276±0.021、0.229±0.024 vs 0.211±0.027;末期:0.277±0.017 vs0.263±0.019、0.213±0.038 vs 0.193±0.039,P0.01)。结论 RBC功能随密度的增大逐渐降低;NO可明显改善老年RBC的变形性,但对全血无明显影响。     

主要ABO血型不合异基因造血干细胞移植后纯红细胞再生障碍

20例主要ABO血型不合异基因造血干细胞移植（allo-HSCT)患中，6例发生纯红细胞再生障碍（PRCA）。PRCA对中性粒细胞和血小板植入以及Ⅱ-Ⅳ度aGVHD并无影响。6例PRCA患血型均为O型，而供血型5例为A型，1例B型，提示供／受血型A／O是主要ABO血型不合allo-HSCT后PRCA发生的高危因素。4例除给予RBC输注无其它特殊治疗，随着凝集素滴度降至＜8，红系造血自然恢复，而另2例尽管给予重组人红细胞生成素（rhEPO）治疗红系再障仍持续＞300天，经供型血浆置换而红系恢复造血。在本组病例，环孢菌素在PRCA发生中并无作用，而GVHD发生则可促进红系造血恢复。     

人血浆对红细胞保存的影响

为了研究人血浆对保存的红细胞结构和功能的影响，对悬浮红细胞、洗涤红细胞以及添加不同量血浆的红细胞成分血在不同保存时间内的红细胞的功能指标，包括pH值、K^＋浓度、Na^＋浓度、渗透脆性、血浆游离血红蛋白、乙酰胆碱酯酶活性、ATP含量、2．3-DPG、P50含量进行了比较。结果证明，血浆有利于保存血液维持其高pH值、低K^＋浓度和高Na^＋浓度，有利于保存红细胞维持其ATP含量、携氧能力和红细胞变形性，但对保存血液维持低渗透脆性，对保存血液的血浆游离血红蛋白、乙酰胆碱酯酶活性、ATP含量和2．3-DPG含量无影响。结论：在红细胞成分血中加入一定量的血浆可能有利于红细胞的长期保存。     

ABO反定型试剂红细胞的质量控制

已知血型的试剂红细胞是ABO血型的血清学鉴定中检测抗体必不可少的试剂。为了提高ABO血型检定结果的准确性，解决自制试剂红细胞无标准和无质控的问题，本研究组建立了ABO反定型试剂红细胞的质控方法，进行了试剂红细胞的特异性和亲和性检测、振荡检测、流式细胞术和原子显微镜观察。通过筛选建立了质控参考品，并在此基础上确定质量检定标准及质控方法，同时对制备的3批次试剂红细胞进行了评价。研究结果表明：制备的反定型试剂红细胞既能保证质量和性能的稳定，又能最大限度地降低批次间的差异。结论：制备的AB0反定型试剂红细胞解决了自制红细胞的质控问题，并能提高血型检定结果的准确性。     

去除血型抗体制备O型红细胞的研究

目的建立去除血浆中血型抗体的O型红细胞的制备工艺,为临床提供安全的O型红细胞制剂。方法使用处理后的冰冻干燥A型、B型红细胞膜,分别加入O型红细胞血浆中吸附血浆血型抗体物质,并检测吸附后红细胞的结构和功能。结果使用海藻糖冻干保存红细胞膜可保存其抗原性,吸附后,可去除血浆中抗A、抗B抗体80%—99%,同时红细胞变形指数、ATP、渗透脆性、上清游离Hb含量与吸附前(正常红细胞)比较差异无统计学意义(P>0.05),均在正常参考范围;流式结果显示,吸附后采用离心方法,红细胞膜去除率可达到77%。结论用冰冻干燥红细胞膜去除ABO血型抗体为O型红细胞的他型输注奠定了基础。