环介导等温扩增法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果评估

目的评估环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)法检测粪样中日本血吸虫(Schistosoma japonicum)虫卵DNA的效果,并评价其检测流行区现场牛野外粪样的效果。方法取1 g新鲜的日本血吸虫虫卵阴性牛粪,分别加入5个新鲜日本血吸虫虫卵、50μl日本血吸虫虫卵排泄分泌产物(egg secretion product,ESP)制备人工模拟阳性粪样。用粪DNA提取试剂盒分别提取加入虫卵的未经研磨或研磨2 min后的人工模拟阳性粪样、加入虫卵ESP的粪样和阴性粪样的DNA,以日本血吸虫28S核糖体DNA(r DNA)为检测靶基因,用LAMP法、PCR法检测,评估LAMP法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果。收集2012-2014年湖南、湖北、江西、安徽等4省日本血吸虫病流行区的牛野外粪样221份,研磨后同法提取DNA,用LAMP法检测,并与PCR法、孵化法的检测结果进行比较,评价其检测流行区现场野外粪样的效果。结果LAMP法检测加入虫卵粪样并经研磨后提取的DNA、加入虫卵ESP粪样提取的DNA均为阳性反应,呈绿色;而加入虫卵粪样未经研磨提取的DNA、阴性粪样DNA则为阴性反应,呈棕色;PCR检测的结果与LAMP法检测结果相近。LAMP法、PCR法和孵化法检测血吸虫病流行区牛野外粪样的阳性率分别为5.43%(12/221)、4.52%(10/221)、0.90%(2/221)。LAMP法的阳性率明显高于孵化法(P0.05),LAMP法与PCR法阳性率差异无统计学意义(P0.05)。结论 LAMP法可用于检测流行区现场野外粪样的日本血吸虫虫卵DNA,其现场应用价值有待进一步验证。     

AKP染色鉴别组织内死活血吸虫虫卵的条件探索与效果观察

目的探索碱性磷酸酶(AKP)染色条件,观察其对宿主组织内死活血吸虫虫卵的鉴别效果。方法采用偶氮偶联法和NBT/BCIP两种AKP酶染色方法对血吸虫感染后第45 d鼠(未治疗组10只)和经吡喹酮治疗后3个月鼠(治疗组10只)的肝、肠组织内完整虫卵,冰冻切片虫卵和石蜡切片虫卵进行比较检测和分析;收集12份有近、远期变性虫卵的血吸虫病患者肠黏膜活检标本,进行虫卵染色,计数虫卵阳性数,评价两种AKP染色法对血吸虫死卵和活卵鉴定的效果。结果两种AKP染色方法对未治疗组小鼠组织内完整虫卵染色仅半数阳性,其阳性反应主要取决于完整虫卵是否裸露。未治疗组小鼠肠组织石蜡切片和冰冻切片偶氮偶联染色法阳性率分别为97.72%和92.47%,NBT/BCIP染色法阳性率分别为97.65%和98.49%;肝组织两种染色法的阳性率分别为81.17%、86.55%和74.36%、95.32%。在冰冻切片中,肝、肠组织偶氮偶联检测的敏感性均低于NBT/BCIP法;治疗组两法的阳性率均为0。12份临床标本,偶氮偶联法检出1例阳性,NBT/BCIP法检出3例阳性。结论 NBT/BCIP AKP染色法可用于鉴别组织切片中血吸虫虫卵的死活,但在实际应...     

SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫感染的敏感性研究

目的建立快速、敏感、特异的检测日本血吸虫感染的SYBR Green荧光定量PCR法,准确评估其敏感性。方法将计数的日本血吸虫虫卵掺人健康水牛粪样中,制备人工阳性粪样。采用改良QIAamp DNA Stool Kit粪样DNA提取方法,提取人工阳性粪样DNA,进行SYBR Green荧光定量PCR,建立Ct值与粪样中克粪虫卵数（EPG）的关系;提取单独（不与牛阴性粪样混合）日本血吸虫虫卵DNA与虫卵生理盐水冲洗液DNA,行定量PCR检测,以对本方法进行严格质量控制。结果每200mg粪样仅含1个虫卵时,荧光定量PCR仍呈阳性,人工阳性粪样EPG的对数与PCR的Ct值存在线性关系。结论SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫虫卵DNA敏感性高,EPG对数与PCR的Ct值存在线性关系。     

日本血吸虫感染的虫卵计量变化研究

目的了解粪中日本血吸虫卵计量变异特征。方法对清溪二村民连续7次收集粪便，用改良Kato法涂片2张;对44倒粪检阳性者，再涂片10张。结果一村粪检累计检出率从单次42.38％增加到7次的68.26％，二村从17.02增加到35.98％。虫卵在同一粪便中的分布并非完全随机。结论改良Kato法的敏感性与人群感染度及粪便取样部位有关;个体内虫卵计量变异，可用负二项分布来描述其特征。     

日本血吸虫病常用诊断方法应用价值的评估Ⅲ Kato-Katz法低估疫区人群血吸虫感染率的分析与评价

目的现场评估KatoKatz法不同检测粪样次数和涂片数的居民血吸虫感染检出率与低估率。方法采用＂3检27片＂Kato-Katz法对鄱阳湖区1个血吸虫病流行村人群进行连续3年的粪检,并以此为金标准,评估不同检测粪样数和Kato-Katz片数的血吸虫感染检出率与低估率。结果血吸虫感染的检出率随粪检Kato片数的增加而增加,低估率则逐渐降低。1检3片Kato-Katz法对人群感染的低估率达40.98%～50.80%,即使增加到6张Kato片,低估率仍为30%左右（25.48%～32.39%）。观察区人群2008-2010年的粪检阳性率分别为10.96%、8.54%和3.73%,各年间差异较大,但各Kato片的低估率接近。1检3片、6片、9片法分别和3检3片、6片、9片法的阳性率之间,2检6片与1检6片、3检6片法的阳性率差异均无统计学意义。结论在相同Kato片检测数下,血吸虫感染者的阳性检出率主要取决于Kato片数而不是粪检次数。在血吸虫病低流行状态下,＂1检3片＂KatoKatz法对血吸虫病疫情的低估率较大。为提高KatoKatz法敏感性,宜首先考虑增加Kato片数而不是粪检次数。     

染色法判别日本血吸虫尾蚴生命状态的实验研究

目的采用染色法判别日本血吸虫尾蚴的生命状态。方法以0.4%台盼蓝、0.5%M.E.B、0.5%伊红、0.5%甲基蓝、0.05%中性红等5种染色液分别对死活日本血吸虫尾蚴染色5 min,显微镜下观察着色情况。结果台盼蓝、M.E.B、伊红、中性红4种染色液可使死尾蚴着色,而甲基蓝染液对其不着色;5种染液均不能使活尾蚴着色。结论0.4%台盼蓝、0.5%M.E.B、0.5%伊红、0.05%中性红染液染色可判别日本血吸虫尾蚴的生命状态。     

集卵孵化法与Kato-Katz法不同检查次数诊断血吸虫病的效果

目的 选择一种适宜现场应用的血吸虫病病原学检查方法.方法 采用尼龙绢集卵孵化法和Kato-Katz法不同的检查次数对血吸虫病流行村的337例居民进行检查,比较不同检查次数诊断血吸虫病的效果.结果 337份粪样中,Kato-Katz法1送3检血吸虫卵检出率为19.6%,Kato-Katz法2送6检的检出率为22.6%,差异有显著性意义(χ2=281.59,P＜0.05);Kato-Katz法1送3检的血吸虫卵检出率为18.1%,集卵孵化法血吸虫毛蚴检出率为17.5%,两种方法的差异无显著性意义(χ2=153.878,P＞0.05);Kato-Katz法2送6检的检出率为22.55%,Kato-Katz法加集卵孵化法的检出率为22.55%,两法差异无显著性意义 (χ2=251.619,P＞0.05) .结论 Kato-Katz法1送3检与尼龙绢集卵孵化法联合运用可以取代Kato-Katz法2送6检,是一种适宜于现场应用的病原学检查方法.     

快速诊断家畜日本血吸虫病免疫层析试纸条的研制与初步应用

目的开发研制敏感、简便、快速、经济的日本血吸虫病诊断试纸条。方法利用双抗原夹心法,以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)为检测抗原,以胶体金标记SEA为探针,采用自行设计的免疫层析试纸条装置,检测家畜血清中血吸虫特异性IgG抗体,并用ELISA方法进行比较。结果用该试纸条检测107份人工感染血吸虫病羊血清,其检出率为91.6%;检测80份健康绵羊血清,阴性符合率为87.5%;检测20份粪检阳性水牛血清及15份粪检阴性血清,其阳性符合率为100.0%,阴性符合率为86.7%;检测24份肝片形吸虫病羊血清,交叉反应率为12.5%,与锥虫病牛血清未见交叉反应;与ELISA检测结果比较,两种方法具有良好的一致性。结论应用试纸条诊断家畜日本血吸虫病敏感性高、特异性强,且操作简便、快速,不需特殊仪器设备,适合于基层使用。     

日本血吸虫感染小鼠肝脏组织纤维化染色方法的比较

目的 比较Van-Gieson氏染色和Masson氏三色染色法用于日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化染色的效果.方法 建立日本血吸虫感染小鼠肝脏组织纤维化模型,取肝脏标本,常规切片,进行Van-Gieson氏染色和Masson氏三色染色,应用图像分析软件统计虫卵肉芽肿纤维化面积.结果 染色时间为3 ～7 min时,2种方法显示肉芽肿纤维化面积差异无统计学意义(P＞0.05);染色时间为10 min时,由于非特异性因素使得Masson氏染色法着色面积明显大于Van-Gieson氏染色法,两者差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Van-Gieson氏染色法比Masson氏三色操作过程相对简单,易于掌握,染色结果稳定、可靠,可以作为评价日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化程度的较好染色方法.     

集卵消化透明法定量检测牛粪血吸虫卵

牛粪中血吸虫卵的定量检测,以往主要采用尼龙袋集卵透明法,但由于牛粪定量检查的粪量较人粪多,加之牛为食草动物,粪便中多为植物纤维,集卵后的粪渣量大,且纤维粗渣对虫卵有一定的遮蔽,影响虫卵检出,使用效果不甚满意.为此,我们探索使用集卵消化透明法定量检测牛粪血吸虫卵,并与集卵透明法做了比较,取得一定效果     

日本血吸虫生殖相关蛋白SjWD40的虫体免疫定位

目的研究抗重组日本血吸虫生殖相关蛋白WD40(SjWD40)多克隆抗体对天然SjWD40的结合活性,观察SjWD40在虫体内的定位。方法从阳性钉螺体内逸出尾蚴,感染家兔,于感染后42 d剖杀收集成虫和虫卵制备石蜡切片,利用抗重组蛋白SjWD40多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法探讨SjWD40在虫体内的分布。结果SjWD40广泛分布于雌虫的卵黄腺、雄虫的睾丸,虫卵的毛蚴体壁,尾蚴的头腺、钻腺、腺管等部位。结论免疫荧光染色法确定SjWD40蛋白主要分布于血吸虫成虫的生殖腺、毛蚴体壁及尾蚴腺体等组织。     

日本血吸虫虫卵杀灭剂筛选及快速杀灭技术的研究 Ⅰ化学杀卵剂的筛选

目的从市售的农药或其他化学药品中筛选日本血吸虫虫卵杀灭剂,为建立快速杀卵技术提供物质基础。方法将待筛选化学样品分别配制成浓度为1000、100、10、1mg/L的溶液;分别加入4000～8000只日本血吸虫活虫卵,室内浸泡24h后经盐水和冰水洗涤,常规法孵化,收集所有孵出毛蚴,计算相对孵化率。结果共筛选了6大类41种化学药物,其中35种对日本血吸虫虫卵孵化有不同程度抑制作用。经浓度为1mg/L80%敌敌畏乳油、25%氯硝柳胺悬浮剂和杀虫丁浸泡后的虫卵相对孵化率分别为0、1.01%和6.61%。结论 80%敌敌畏乳油对日本血吸虫虫卵有较强抑制作用,可作为候选杀卵剂对其杀卵条件进行优化研究。     

日本血吸虫不同发育期虫卵内抗氧化酶检测的研究

摘 要:目的 检测日本血吸虫（Sj）不同发育期虫卵内抗氧化酶水平,分析其是否可作为鉴别虫卵死与活的标志物。方法 采用3,3-二甲基联苯胺盐酸盐(DAB)+H2O2底物作为抗氧化酶检测方法对完整Sj虫卵进行染色观察,并探索其染色条件。建立Sj感染后50d和90d的小鼠模型和吡喹酮治疗后30d和90d的小鼠模型。用最佳染色条件对从各模型组小鼠肝肠组织分出的虫卵作检测,比较观察对未成熟卵、成熟卵、近期变性卵和远期变性卵的显色程度与其分布来评价抗氧化酶水平,分析其用于判别Sj虫卵死与活的可能性。结果 与不做染色虫卵比,DAB加入完整游离活卵中经室温震动反应30min时,所呈深棕黄色阳性反应的反差最明显;DAB对沸腾处理30min虫卵染色,未见呈显色反应;DAB对Sj感染50d、90d及治后30d和90d的模型鼠肝肠来源虫卵染色的阳性率分别为92.34%、46.03%、13.68%和0.00 %。其阳性反应程度：未成熟虫卵普遍呈深棕黄色;成熟卵多呈深黄色,分布于毛蚴体部;近期变性卵中部分有显色;远期变性卵和卵壳均无见显色。结论 Sj活虫卵内均富含抗氧化酶成分,其水平则以未成熟卵内为最高,且随着虫卵发育成熟至死亡而逐渐减低。提示,对Sj虫卵作抗氧化酶染色可作为虫卵死与活鉴别的标志物。     

Kato-Katz法诊断日本血吸虫病误判因素的研究

目的探讨并分析Kato—Katz法厚涂片中血吸虫卵误判的原因,为今后的血吸虫病查病工作提供帮助。方法对三个试验点的初查Kato—Katz法血吸虫卵阳性片随机抽查5％进行复核;观察Kato—Katz法血吸虫卵阳性片在不同温度和不同时间下虫卵的形态变化。结果三个试验点总的阳性符合率为86．09％,假阳性率为13．91％。随着温度和时间的变化,血吸虫卵的形态也发生改变。结论由于血吸虫卵在Kato—Katz厚涂片中的形态与水洗片中的标准形态差异较大,且受实验条件的影响,很容易造成误判,必须加强质量控制和技术培训。     

日本血吸虫成虫培养细胞骨架系统的研究

目的：研究日本血吸虫成虫培养细胞的骨架系统。方法：将日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,以RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗菌素的培养基培养,用考马斯亮蓝染色法和魁笔环肽荧光染色法显示培养细胞骨架。结果：考马斯亮蓝染色显示日本血吸虫成虫细胞骨架呈网络状结构,均钭分布于胞质中;用（NH4）2SO4抽提后考马斯亮蓝色显示细胞骨架无明显改变;鬼笔环肽荧光染色后可见细胞内有均匀荧光亮点。结论：日本血吸虫成虫培养细胞骨架呈致密网络状结构,以中间纤维为主,缺乏粗大的微丝束。     

诱导型一氧化氮合酶在不同虫期日本血吸虫虫体中的表达

目的　了解日本血吸虫不同虫期诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达及其在体内的分布。　方法　收集日本血吸虫成虫制成冰冻切片,将含胞蚴、尾蚴的感染性钉螺和含成熟虫卵的小鼠肝脏制成石蜡切片,用免疫荧光法检测成虫、胞蚴、尾蚴以及毛蚴中的iNOS,并观察该酶在各期虫体内的分布;用蛋白质印迹法(Westernblotting)检测成虫匀浆中的可溶性蛋白是否具抗iNOS多抗的可溶性蛋白。　结果　组织切片免疫荧光结果显示,特异性黄绿色荧光主要分布于成虫紧贴皮层下组织处、毛蚴的表层和腺体中以及胞蚴和尾蚴的体表;Westernblotting结果表明,成虫蛋白中出现1条明显的被抗iNOS抗体识别的特异性反应条带,其相对分子质量(Mr)为210000。　结论　日本血吸虫成虫及不同虫期幼虫均有类iNOS的蛋白表达。     

钉螺对不同宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性

目的了解钉螺对不同终宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性差异。方法收集家兔、水牛和小白鼠排出的虫卵,孵出毛蚴,以毛蚴和钉螺5：1的比例感染同一地钉螺。同时设对照组,观察各组钉螺感染率、死亡率。结果实验组家兔、水牛和小白鼠排出虫卵孵出毛蚴感染钉螺,获得的阳性率分别为1.42%、8.67%和19.87%,钉螺死亡率分别为29.5%、13.5%和24.5%;对照组钉螺阳性率分别为2.63%、2.02%和11.66%,死亡率分别为24.0%、49.5%和18.5%。结论不同宿主源日本血吸虫毛蚴对钉螺易感性存在差异。     

日本血吸虫初产卵体外培养的研究(英文)

目的　观察日本血吸虫未成熟虫卵超免疫血清对虫卵胚胎发育及雌虫生殖力影响的效果。方法　本研究通过体外培养系统 ,观察日本血吸虫成虫离体产卵及虫卵发育全过程中形态学特点的变化 ,检测抗未成熟虫卵超免疫血清对虫卵胚胎发育及雌虫生殖力的影响。结果　在含正常兔血清的培养基中 ,初产卵经 12～ 14天培体外培养后 ,能完成发育至成熟期 ,对照组雌虫每周产卵总数为 176 5 7个 (n =2 0 )。但在含有抗未成熟虫卵超免疫兔血清的培养基中 ,雌虫产卵数量较正常兔血清培养对照组有显著降低 (P <0 0 0 1) ;在培养后第 10天 ,试验组雌虫即停止产卵 ,部分初产卵卵胚的发育和成熟过程被完全阻断 ;免疫荧光染色显示 ,抗卵免疫血清可作用于卵胚细胞及雌虫卵黄腺、肠腔内膜组织。结论　体外培养结果表明 ,日本血吸虫未成熟虫卵抗原诱导的免疫应答 ,在抗虫卵胚胎发育及抗雌虫生殖产卵中起重要作用。     

高纯度日本血吸虫卵的分离及活性鉴定

目的 探讨制备高纯度、高生物活性的的日本血吸虫卵分离方法。 方法 将匀浆后的血吸虫感染的兔肝组织悬液分级过滤,再将滤液离心,去除组织碎片,分离的虫卵再次经过325目分样筛过滤,收集筛上虫卵,最后将收集的虫卵用密度1.070的Percoll分离液梯度离心,吸取下层Percoll液中的纯化虫卵;显微镜观察分离虫卵的纯度,吖啶橙染色观察虫卵的死活,环卵沉淀试验鉴定虫卵的分泌活性。 结果 每个肝脏获得约1克左右的虫卵,分离的虫卵纯度高,吖啶橙染色和环卵沉淀试验结果显示,分离的活虫卵比例高、生物活性好。 结论 该虫卵分离方法操作简单、用时短、效果好,分离的虫卵完全满足各种研究的需要。