替莫唑胺及甲泼尼龙对人胶质瘤细胞放射治疗敏感性的影响

目的探讨替莫唑胺(TMZ)和甲泼尼龙(MP)对人胶质瘤细胞系U251放射治疗敏感性的影响,以期为临床优化治疗方案提供依据。方法经体外传代培养的U251细胞根据治疗方案的不同,分为对照组、放射治疗(R)组、放射治疗+替莫唑胺(R+TMZ)组、放射治疗+甲泼尼龙(R+MP)组、放射治疗+替莫唑胺+甲泼尼龙(R+TMZ+MP)组,分别予以放射治疗(2 Gv/24 h)、替莫唑胺、甲泼尼龙及三者联合治疗。采用磺酰罗丹明B(SRB)比色法、流式细胞术和Western blotting法分析U251细胞增殖率和凋亡率,观察凋亡相关蛋白Bax和Bc1-2表达变化。结果放射线照射联合甲泼尼龙治疗后,U251细胞存活率明显升高(均P=0.000);但经体外培养24和48 h后,三者联合治疗组(R+TMZ+MP组)U251细胞增殖率显著高于放射治疗联合替莫唑胺组(P=0.000)。除对照组外,不同抗肿瘤治疗组U251细胞凋亡率均呈现升高趋势(P=0.000),但放射治疗联合甲泼尼龙组细胞凋亡率显著低于其他各组(均P=0.000)。经放射线照射联合替莫唑胺和三者联合治疗后,U251细胞Bax蛋白表达水平升高(P=0.000),而放射线照射联合甲泼尼龙和三者联合治疗,Bcl-2蛋白表达水平升高;其中以放射治疗联合替莫唑胺组Bax/Bcl-2比值最高(P=0.000),放射治疗联合甲泼尼龙组最低(P=0.000)。结论甲泼尼龙可以诱导人胶质瘤细胞产生放射抵抗,而替莫唑胺对甲泼尼龙诱导的放射抵抗具有增敏作用。提示:胶质母细胞瘤患者在应用甲泼尼龙减轻放射治疗不良反应过程中所诱导的放射治疗抵抗可通过同时应用替莫唑胺而抵消。     

全反式维甲酸增强替莫唑胺对U251细胞化疗效果的研究

目的观察全反式维甲酸（ATRA）对替莫唑胺（TMZ）治疗人脑胶质瘤是否有协同作用。方法用ATRA、TMZ或两药联合分别作用于人脑胶质瘤细胞株U251细胞,细胞划痕法检测各组的细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光检测CD133细胞阳性率。结果ATRA、TMZ均能抑制U251细胞的迁移,联合用药时迁移抑制更明显。对照组、ATRA组、TMZ组及联合用药组U251细胞凋亡率分别为（6．24±0．81）％、（24．93±4．58）％、（21．36±3．76）％和（54．27±4．83）％,CD133阳性细胞率分别为（7．05±0．27）％、（0．66±0．30）％、（36．32±3．22）％和（4．70±0．52）％。各组间细胞凋亡率和CD133阳性细胞率均有明显差异（P〈0．01）。结论ATRA和TMZ两药均可抑制U251细胞株迁移,促进细胞凋亡;两药联合应用可增强TMZ对U251细胞的化疗效果;其机制可能与ATRA减少CD133阳性细胞率有关。     

胶质瘤多药耐药细胞株U251/TMZ的生物学特性

目的探讨胶质瘤U251／替莫唑胺（TMZ）多药耐药细胞株的生物学特性。方法采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质瘤多药耐药细胞株U251／TMZ,光镜观察细胞形态,细胞计数计算倍增时间,四甲基偶氮唑蓝法检测耐药指数,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-PCR法检测多药耐药性1（MDRl）、Bcl-2、多药耐药相关蛋白5（MRP5）、肺耐药相关蛋白1（LRPl）等mRNA表达。结果胶质瘤耐药细胞株U251／TMZ对TMZ、依托泊苷、硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素的耐药指数分别为4．39、3．61、2．64、2．00、1．63;细胞周期结果显示U251／TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和s期明显减少（P〈0．05）,GfM期明显增多（P〈0．05）;U251／TMZ倍增时间[（14．64＋1．98）h1较亲本细胞系u251[（10．26＋1．03）h1明显延长（P〈0．05）;U251／TMZ耐药细胞株MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl等mRNA表达均较亲本细胞系U251明显上调。结论间歇TMZ浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤U251多药耐药系,MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl的表达明显上调可能与耐药性形成有关。     

沙利度胺联合替莫唑胺杀伤U251胶质瘤细胞机制的体外研究

目的 对沙利度胺联合替莫唑胺杀伤U251胶质瘤细胞的机制进行体外研究,为制订沙利度胺与替莫唑胺联合化疗方案提供理论依据.方法 经体外培养的人胶质瘤细胞系U251分别接受替莫唑胺(100 μmol/L)、沙利度胺(100 μg/L)、替莫唑胺与沙利度胺联合治疗,噻唑监(MTT)法检测不同抗肿瘤药物处理组肿瘤细胞增殖活性;流式细胞术分析细胞增殖周期;检测经吖啶橙标记的酸性囊性细胞器数目;原位末端标记(TUNEL)法观察肿瘤细胞凋亡情况;Western blotting法榆测肿瘤自噬及凋亡相关蛋白表达变化.结果 与替莫唑胺和沙利度胺单药治疗相比,替莫唑胺与沙利度胺联合治疗对U251细胞生长的抑制更为明显(均P=0.000).且可诱导肿瘤细胞周期阻滞于G0～G1期,以及发生凋亡和自噬.两药联合治疗后,U251细胞微管相关蛋白1轻链3和Caspase-3表达水平高于替莫唑胺组和沙利度胺组(均P=0.000).结论 沙利度胺联合替莫唑胺治疗U251细胞可以上调自噬及凋亡相关基因表达水平.同时诱导凋亡及自噬性死亡,从而达到对U251胶质瘤细胞的杀伤作用.     

替莫唑胺对人胶质瘤细胞系U251细胞miR125b的影响

目的探讨替莫唑胺(TMZ)对人胶质瘤细胞系U251细胞的miRNA125b的表达影响。方法将人胶质瘤细胞系U251细胞分成空白对照组、TMZ组,TMZ组设10、25、50、100、200、400、600μmol/L组。各组分别作用于24、48、72 h后进行实时定量PCR(Real-time PCR)检测miRNA-125b的表达水平;用MTT比色法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果荧光定量PCR检测结果显示:替莫唑胺作用24 h后,miRNA125b表达变化不明显;48 h后对miR-125b表现出抑制作用,miR-125b对U251细胞的抑制率呈良好的时间-剂量效应关系,其Ic50为76μmol,初始抑制浓度为50μmol;流式细胞仪检测显示,U251细胞经TMZ作用后出现G2/M期阻滞,但促凋亡作用并不显著。结论在TMZ对胶质瘤细胞治疗过程中,hsa-miR-125b的表达随着治疗剂量而被抑制,miR-125b可以作为TMZ在用药过程中效果的检测以及抗药性反应的参考依据。     

垂体瘤转化基因RNA干扰对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的 观察垂体瘤转化基因(PTTG)RNA干扰对胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响.方法 实验分4组:对照组:对胶质瘤U251细胞不进行任何处理;替莫唑胺(TMZ)组:胶质瘤U251细胞培养基中加入TMZ;PTTG shRNA转染组:PTTG shRNA片段转染胶质瘤U251细胞;PTTG shRNA联合TMZ组:TMZ作用于转染PTTG shRNA片段的胶质瘤U251细胞.MTT法检测细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 MTT结果显示吸光度值在对照组、TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组分别为0.85±0.07、0.58±0.06、0.55±0.07、0.41±0.05,TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组细胞增殖抑制率分别为(31.56±5.51)%、(35.53±4.60)%、(51.49±6.74)%;PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组抑制细胞增殖更明显,与PTTG shRNA组及TMZ组比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,48 h时对照组凋亡率为(6.29±0.78)%,TMZ组为(33.61±4.88)%,PTTG shRNA组为(39.61±4.95)%,PTTG shRNA联合TMZ组为(66.23±7.60)%,PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组的凋亡率较PTTG shRNA组及TMZ组明显增高,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PTTGRNA干扰可以增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗效果.     

异柠檬酸脱氢酶1基因突变增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性

目的探讨胶质瘤细胞异柠檬酸脱氢酶1（IDHl）基因突变对替莫唑胺（TMZ）细胞毒性的影响。方法将培养的U87胶质瘤细胞分组转染含空载体（空载体组）、野生型IDHl基因（野生组）和R132H突变型IDHl基因（突变组;IDHl第132位的精氨酸被组氨酸所取代）质粒,利用液相色谱串联质谱法检测细胞上清液中2-羟基戊二酸（2-HG）水平、噻唑蓝法检测细胞增殖活性、实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测细胞caspase3mRNA和蛋白质表达;将含三种不同质粒的U87细胞接种大鼠建立荷瘤大鼠模型并观察大鼠经TMZ治疗后60d存活率。结果与空载体组和野生组比较,突变组细胞上清液中2-HG水平、细胞caspase3mRNA和蛋白质表达水平均显著升高（P〈0．05）,而细胞增殖活性显著下降（P〈0．05）;TMZ治疗后60d,突变组大鼠存活率显著升高（P〈O．05）;空载体组和野生组之间均无统计学差异（P〈0．05）。结论IDHlR132H基因能够增加TMZ对神经胶质瘤细胞的细胞毒性作用并提高其治疗荷瘤大鼠的存活率。     

硝普钠诱导胶质瘤细胞株U251细胞凋亡的研究

目的探讨一氧化氮（NO）供体药物硝普钠（SNP）对胶质瘤细胞株U251细胞凋亡诱导效应及其机制。方法以0．2、0．5、1．5和2．0mmol／L浓度SNP作用于U251细胞24h,甲基噻唑基四唑法检测U251细胞生长抑制率,Griess法检测其NO含量,流式细胞术检测其凋亡率,免疫印迹法检测SNP作用24h前后B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）在U251细胞的表达。结果不同浓度SNP对U251细胞生长均有抑制作用（P〈0．01）,且随SNP浓度升高而增强（P〈0．01）。U251细胞内NO含量随SNP浓度升高递增（P〈0．01）,并与细胞生长抑制率的呈正相关（P〈0．01）。不同浓度的SNP均能诱导U251细胞凋亡,且随浓度升高而增强（P〈0．01）。随SNP浓度升高U251细胞Bcl-2表达减少,caspase-3表达增加（P〈0．05）。结论SNP可抑制U251细胞生长并诱导其凋亡,其生长抑制效应可能与NO浓度有关,凋亡诱导作用与U251细胞Bcl-2下调和caspase-3上调有关。     

替莫唑胺对胶质瘤干细胞抗凋亡与多重耐药基因及细胞周期的影响

目的 分析替莫唑胺(TMZ)对胶质瘤U251细胞及其干细胞livin、MRP基因表达及细胞周期的影响.方法 分离培养U251细胞及其干细胞后,不同浓度的TMZ(0、25、50、100、200、400 μmol/L)干预72 h,CCK-8检测细胞增殖变化趋势,流式细胞术(FCM)检测细胞周期变化,RTPCR技术检测livin、MRP1、MRP3 mRNA表达.结果 本研究成功从U251细胞中分离出U251干细胞;与未干预组相比,25 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后其增殖率分别为0.952±0.011(t=-8.219,P=0.001)、0.937±0.029(t=-3.822,P=0.019)和100 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后其增殖率分别为0.750±0.018、0.887±0.039(t=5.480,P=0.005);正常情况下,livin基因在U251细胞及其干细胞中的表达量分别为(0.411 ±0.025)×10-3、(0.571 ±0.040)×10-3(t=-3.348,P=0.004),MRP1基因的表达量分别为(0.295 ±0.018)×-3、(0.481 ±0.034)×10-3(t=-8.439,P=0.001),MRP3基因的表达量分别为(1.128±0.117)×10-3、(0.963±0.059)×10-3(=2.176,P=0.095);200 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后livin mRNA表达量在分别为(0.020±0.002)×10-3(t=27.123,P =0)、(0.066 ±0.007)×10-3(￡=21.345,P =0);200 μmol/L干预后MRP1 mRNA表达量为(0.556±0.041)×10-3 (t=-10.214,P=0.001)、(0.609 ±0.044)×10-3(t=-3.98,P=0.016);200 μmol/L干预MRP3 mRNA表达量为(1.397±0.192)×10-3(t=-2.073,P=0.107)、(1.496 ±0.302)×10-3(t=-2.993,P=0.040);100 μmol/L干预后细胞周期U251细胞G2/M期百分比为11.353 ±0.516、39.1±1.2(t=-37.1,P=0)和U251干细胞S期百分比为21.1±1.0、30.2±1.7(t=-8.07,P=0.001).结论 替莫唑胺能有效降低U251及其干细胞中livin基因的表达,并使细胞分裂周期停滞,降低细胞增殖率,促进细胞凋亡.MRP1和MRP3可能分别是原发胶质瘤与复发胶质瘤耐药的主要原因之一.     

C1QBP调节线粒体功能介导胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐受作用研究

目的 探讨C1QBP通过调节线粒体功能介导胶质母细胞瘤(GBM)对替莫唑胺(TMZ)的耐受作用。方法 采用MTT法检测GBM细胞系U251及耐受TMZ细胞系U251(U251/TMZ)半抑制指数,采用免疫荧光实验、Western Blot检测U251及U251/TMZ中C1QBP的表达水平,C1QBP过表达转染构建U251/TMZ+OE-C1QBP组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组C1QBP的mRNA表达水平,MTT法检测U251/TMZ+OE-C1QBP组半抑制指数,流式检测仪检测各组细胞凋亡水平,荧光显微镜下观察线粒体膜电位变化情况。结果 相比较U251细胞系,U251/TMZ细胞系的半抑制指数以及C1QBP的蛋白表达水平要更高,而转染后的U251/TMZ+OE-C1QBP细胞系的半抑制指数最高,U251、U251/TMZ、U251/TMZ+OE-C1QBP三组细胞系中C1QBP的mRNA表达水平依次增高,细胞凋亡水平依次降低,同时线粒体膜电位表达越来越强。结论 C1QBP的表达水平与GBM对TMZ的耐药性有关,随着C1QBP表达水平的增高,线粒体膜电位即功能增强,同...     

二氢杨梅素促进胶质瘤U251细胞凋亡的实验研究

目的 探讨二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)对人胶质瘤U251细胞凋亡的促进作用及其机制。方法 将体外培养的胶质瘤U251细胞分为对照组和DHM组(根据DHM水平的不同分为3个亚组),MTT法观察细胞活性,Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率,透射电镜观察细胞形态,Western blot检测Bax和bcl-2蛋白表达水平。结果 Hoechst 33258核染色和流式细胞仪检测显示,随着DHM水平的增高,U251细胞凋亡率呈剂量依赖性增高; 电镜观察显示,对照组胶质瘤U251细胞形态正常,DHM组胶质瘤U251细胞肿胀,细胞器呈碎片样分散,随着DHM水平升高,线粒体、内质网等细胞器结构破坏明显。此外, DHM处理后Bax蛋白表达水平增高,Bcl-2蛋白表达水平降低。结论 DHM可能通过改变Bax及Bcl-2蛋白表达水平来抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进其凋亡。     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

线粒体通透性转换孔在缺血预处理脑保护中的作用及机制

目的观察线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)在缺血再灌注及缺血预处理脑保护中的作用。方法将体外培养8 d的海马神经元分为五组,正常对照组(A组),缺血再灌注组(B组),缺血预处理+缺血再灌注组(C组),苍术苷+缺血再灌注组(D组),缺血预处理+苍术苷+缺血再灌注组(E组)。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,罗丹明123染色流式细胞术检测线粒体膜电位,Western-blot检测Bcl-2,Bax的表达水平。结果与A组比较,其余四组线粒体膜电位均降低,神经元凋亡率升高(P<0.05);与B组比较,C组线粒体膜电位升高,神经元凋亡率升高,Bcl-2表达上调,Bax表达下调(P<0.05);与C组比较,E组粒体膜电位降低,神经元凋亡率升高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调(P<0.05)。结论缺血预处理能有效减轻海马神经元缺血再灌注损伤,抑制缺血再灌注后神经细胞凋亡,其机制可能与抑制MPTP的开放有关。     

LRIG3基因对脑胶质瘤细胞系U87和U251的细胞周期、侵袭性和凋亡的影响

目的探讨过表达的富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(LRIG3)基因对脑胶质瘤细胞系U251和U87的细胞周期、侵袭能力和凋亡的影响。方法将过表达的LRIG3质粒(实验组)和空白质粒(对照组)经慢病毒法感染胶质瘤细胞系U251和U87,筛选稳定细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot检测LRIG3表达的变化,碘化丙啶染色后用流式细胞仪测定细胞周期的变化,TransWell小室法检测细胞的侵袭能力,用免疫组化原位末端标记法(TUNEL)检测各组凋亡细胞。结果与对照组相比,实验组U251与U87细胞中LRIG3mRNA水平分别上升67.6%和79.9%,蛋白表达水平分别升高62.3%和91.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组U251细胞中S期与G2/M期细胞数之和低于对照组,有统计学意义(P<0.05);但U87细胞与对照组比无明显差异。实验组U251细胞中穿出细胞数量均明显少于对照组(P<0.05),TUNEL染色结果显示对照组U251细胞凋亡率为23.4%,实验组为35.7%;对照组U87细胞凋亡率为20.2%,实验组为39.5%;对照组与实验组间凋亡率均有明显差异(P<0.05)。结论 LRIG3基因过表达能阻断细胞周期于S期和G2/M期,降低胶质瘤细胞的侵袭能力,加速细胞凋亡。     

缓释BCNU对GL261胶质瘤细胞凋亡作用机制的研究

目的 研究BCNU-PLGA 对GL261 胶质瘤细胞凋亡的作用机制.方法 利用溶剂挥发萃取法制备BCNU-PLGA 缓释微球.将24 只C57BL/6 小鼠随机等分为治疗组与非治疗组,借助动物立体定向仪,将体外培养小鼠GL261 胶质瘤细胞接种于小鼠颅内,行MR 检查掌握颅内成瘤情况.治疗组于术后第2 周立体定位植入BCNU-PLGA 缓释片剂,观察小鼠生存期,MRI 了解瘤体变化.获取标本行HE 染色,并行GFAP、Bax、Bcl-2 免疫组化检查检测其表达情况,相关数据采用统计学方法 进行分析.结果 治疗组与对照组生存期有明显差异(P ＜0.05),治疗组与对照组凋亡相关基因Bcl-2 免疫组化检查提示明显差异性(P ＜ 0.05),Bax 基本无改变,Bax/Bcl-2 比值明显增加.GFAP 表达为阳性.结论 BCNU-PLGA 局部缓释制剂通过下调Bcl-2 蛋白表达,上调Bax/Bcl-2 的比值,从而使胶质瘤细胞发生凋亡.     

反义miR-21抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖的体外研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖能力的效果和机制.方法 脂质体介导转染反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)下调U251人脑胶质瘤细胞株miR-21的表达.使用实时定量PCR和原位杂交法鉴定转染后U251细胞miB-21表达水平下调;MTY法评价AS-miR-21抑制U251细胞生长效果;流式细胞术检测转染后U251细胞周期分布和凋亡;采用细胞免疫荧光技术(PCNA、CyelinD1、Bcl-2、PTEN和Septin-7)评价转染后U251细胞肿瘤生物学性状改变.结果 MTT结果显示AS-miR-21转染组肿瘤细胞生长速度小于对照组与无义寡核苷酸(F=78.926,P=0.000)组;实时定量PCR法:AS-miR-21转染组miR-21表达下调为对照组0.042±0.012;LNA-miR-21原位杂交显示AS-miR-21转染组miR-21表达水平较对照组与无义寡核苷酸组下调;流式细胞术检测可见AS-miR-21转染组细胞周期存在G0/G1期阻滞(X2=14.160,P=0.007)且凋亡比例高于对照组与无义寡核苷酸组(F=23341.25,P=0.000);细胞免疫荧光法表明AS-miR-21治疗后U251细胞PCNA、CyclinD1、Bcl-2表达下调,PrEN、Septin-7表达上调.结论 以miR-21作为靶点抑制U251人脑胶质瘤细胞株生长结果肯定,miR-21可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.