截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立

目的 成功构建HBx及其截断型突变体HBx-Mut120的真核载体,建立了两者稳定表达的HepG2细胞系,并研究了目的基因对细胞生长的影响。方法 采用PCR扩增HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因,然后分别克隆到PCMV-Tag2B载体中,并构建成重组质粒HBx-PCMV-Tag2B和HBx-Mut120-PCMV-Tag2B,经过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒后,将其转染人肝癌细胞HepG2,经Game 418筛选后得到稳定表达目的基因的HepG2细胞,最后通过RT-PCR和Western blot鉴定HBx、HBx-Mut120的mRNA和蛋白在HepG2细胞中的表达情况,并用流式细胞仪检测了各组细胞的周期。结果 （1）成功构建目的基因表达载体PCMV-Tag2B-HBx、PCMV-Tag2B-HBx-Mut120。（2）成功建立稳定表达HBx及其缺失片段的HBx蛋白的HepG2细胞系。（3）通过流式细胞仪检测各组细胞周期及对比,发现HepG2-HBx细胞和HepG2-HBx-Mut120细胞的生长分数（G₂+S）明显高于HepG2细胞及空载体转染的HepG2细胞。结论 本实验成功构建携带HBx及其截断型突变体HBx-Mut120基因的重组表达质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞后分别能够稳定表达HBx蛋白和截断型HBx蛋白,HBx及其突变体稳转细胞后更能促进HepG2细胞的增殖,且突变型目的基因稳转细胞系转移能力较前明显增强。为进一步研究截断型HBx突变体在肝癌的发生、发展中的作用奠定了实验基础。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

高生物安全性内皮抑素真核表达载体的构建

目的：构建具有高度生物安全性的人内皮抑素(Endostatin)真核表达载体，为抗血管生成剂转基因治疗肿瘤奠定实验基础。方法：采用被FDA批准的可用于人体实验的真核表达质粒pVAX1为载体，PCR扩增带有人IgG γ链信号肽序列的Endostatin基因，KpnI、EcoRI双酶切载体和PCR产物，T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体，命名为pVAX-sEN。重组子经KpnI、EcoRI双酶切、PCR及测序鉴定。将测序正确的重组载体经脂质体转染体外培养的人肝癌细胞系(HepG2)，用RT-PCR、ELISA方法鉴定Endostatin的表达。结果：PCR获得了610bp带有信号肽的Endostatin基因，测序结果表明，正确构建了含有信号肽及Endostatin的真核表达载体pVAX-sEN。重组子转染HepG2细胞72h后，RT-PCR显示有EndostatinmRNA表达。ELISA证实，转染重组载体的HepG2细胞上清有目的蛋白的高效表达，表达量为172．34ng／ml。结论：成功构建了高生物安全性真核表达载体pVAX-sEN，为肝癌等实体瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.     

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选.方法 化学合成结合PCR拼接hepcidin 全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达.结果 经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍.结论 成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础.     

hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析

目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plentilox3.7-TWEAK重组质粒,利用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。在293T细胞中包装含TWEAK基因的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,采用荧光定量PCR和Western-blot检测TWEAK表达水平,并通过间接免疫荧光(IMF)检测其细胞表达定位。结果:酶切与测序结果证明重组质粒构建成功,并能在293T细胞中与病毒包装质粒成功包装病毒颗粒。病毒转染的HepG2细胞中,TWEAK基因mRNA表达量约为对照组的500倍,TWEAK蛋白表达量明显高于对照组,且主要定位于胞浆。结论:本研究成功构建了含人TWEAK基因的慢病毒表达载体,其可在人肝癌细胞系HepG2中稳定表达,为后续的功能学研究打下了基础。     

稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体;建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物,从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA,RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段,BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3,1（-）,转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3,经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT-PCR,IFA,Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3;建立了稳定转染的HepG2细胞克隆,命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白,为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．     

重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法：利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt Ⅱ-TOPO载体和pcDNA3.1（＋）表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果：所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.     

转录抑制因子ZHX2功能片段的克隆及表达

目的 构建人ZHX2功能片段的真核融合表达载体。方法 以含有全长ZHX2基因的pcDNA3.0-ZHX2-HA质粒为模板,PCR扩增人ZHX2基因功能片段（242-501AA）经EcoRI,KpnI双酶切后克隆入pcDNA3.0,构建真核表达载体pZHX2(242 501) HA,通过酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pcDNA3.0和含有ZHX2功能片段的真核表达载体分别转染肝癌细胞系HepG2.2.15和非洲绿猴肾细胞COS-7,Western blot检测人ZHX2功能片段融合蛋白的表达。结果 电泳结果显示：PCR扩增的ZHX2基因242-501AA片段大小与预期相符,重组质粒经双酶切和DNA测序,证明其与GenBank报道序列一致。Western blot结果显示,ZHX2功能片段的融合蛋白在肝癌细胞系HepG2.2.15和非洲绿猴肾细胞COS-7中均可有效表达。结论 成功构建含有ZHX2功能片段的真核融合表达载体,为进一步探讨ZHX2基因的功能机制及其应用奠定了基础。     

新基因XTP11剪切体的克隆与亚细胞定位

[目的]克隆乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白反式调节基因11(XTP11)的剪切体,观察剪切体蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位。[方法]利用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transciptase-polymerase chain re-action,RT-PCR)技术扩增XTP11剪切体,将目的基因片段插入克隆载体pGEM-T中,经双酶切和测序鉴定后,定向克隆至荧光表达载体pEGFP-C1中,转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察确定其亚细胞定位。[结果]XTP1剪切体的开放阅读框长度为1314 bp,编码产物为437个氨基酸残基;重组质粒在HepG2细胞中转染效率为50%,蛋白定位于细胞浆。[结论]转染重组表达载体的细胞内出现局限性强绿色荧光信号,推断目的蛋白位于细胞质内。XTP11剪切体的克隆和亚细胞定位为进一步从分子水平分析其生物学功能奠定基础,为阐明其在乙型肝炎病毒X蛋白致病机制中的作用提供信息。     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

FLAG Pull-down技术筛选人乳腺癌细胞中NGAL相互作用蛋白

目的 构建含有NGAL基因的p3XFLAG-NGAL真核表达载体并对其进行鉴定,获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白.方法 提取MCF7细胞中总RNA,反转录为cDNA后采用聚合酶链反应扩增NGAL基因,上下游分别引入NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点,双酶切后将其插入p3XFLAG-CMV-14质粒中,构建p3XFLAG-NGAL重组质粒,并进行双酶切和测序鉴定.采用脂质体法转染该质粒至MCF7细胞中,经Western blot检测FLAG-NGAL融合蛋白的表达情况.再使用FLAG pull-down技术和蛋白质谱测定获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白.结果 经过NotⅠ和EcoRⅠ双酶切及DNA测序验证,本研究成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,免疫印迹法证实转染了p3XFLAG-NGAL载体的人乳腺癌细胞MCF7高表达FLAG-NGAL融合蛋白,并利用FLAG pull-down技术筛选出人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白,经蛋白质谱测定为角蛋白-1(Keratin 1,KRT1).结论 成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,并获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白KRT1,为下一步研究乳腺癌的发生、发展机制提供新的思路和靶点.     

构建人类neuritin真核表达系统

目的：构建人类neuritin基因真核表达载体，并观察其转染的PC12细胞中neuritin的表达。方法：用基因重组技术，将人类Neuritin cDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDN A4．0中，经酶切鉴定及测序分析、并以脂质体介导转染PC12细胞，了解其在细胞内的表达。结果：酶切鉴定及测序分析，表明重组pcDNA4．0-neuritin表达质粒克隆成功．neuritin基因在PC12细胞中获得表达。结论：以脂质体介导pcDNA4．0-neuritin质粒转染真核细胞，为基因治疗神经系统退行性病变奠定实验基础。     

三叶因子2基因真核表达载体的构建

目的：构建TFF2-pcDNA3．1真核表达载体．方法：应用体外基因拼装方法合成TFF2,然后TA克隆于pGM—T easy载体中．阳性克隆经测序鉴定．再经双酶切消化后,插入真核表达载体pcDNA3．1上,经酶切鉴定与测序证实．结果：合成的TFF2经TA克隆后,筛选得到的阳性克隆,经测序鉴定,与设计的TFF、2基因序列完全一致．经酶切连接并成功插入pcDNA3．1上．结论：成功构建了TFF2基因的真核表达载体,为以后的胃溃疡研究奠定了基础．     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.