CXCR4基因修饰骨髓间充质干细胞移植对损伤血管内皮化的影响

目的:探讨基质细胞衍生因子受体4(CXCR4)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠颈动脉球囊成形术后内皮修复的影响。方法:运用密度梯度离心法、贴壁培养并扩增BMSCs,用携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒转染BMSCs,获得CXCR4修饰的BMSCs(EGFP-CXCR4-BMSCs)。建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,随机分成PBS移植对照组(对照组)、空病毒转染BMSCs组(EGFP-BMSCs组)及CXCR4转染BMSCs移植组(CXCR4-BMSCs组)。MTT分别检测慢病毒转染细胞后第1、2、3、4、5d的细胞活力,计算细胞增殖率;细胞移植后14d取血管组织行免疫荧光检测GFP表达,28d行免疫组织化学染色检测血管内膜血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达;苏木精-伊红(HE)染色检测血管形态学变化;Western blot检测血管局部内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。结果:BMSCs转染EGFP空病毒载体及CXCR4后,与对照组相比,各时间点细胞增殖率无统计学差异。CXCR4-BMSCs组损伤血管处有较多的阳性GFP表达。CXCR4-BMSCs与EGFP-BMSCs组血管新生内膜面积、新生内膜/中膜面积均较对照组减轻(均P0.05),CXCR4-BMSCs组尤为明显(P0.05)。CXCR4-BMSCs与EGFP-BMSCs组血管内膜较对照组相比均有CD31及VEGF的表达(均P0.05),损伤血管eNOS表达量较对照组均明显增高(均P0.05),以CXCR4-BMSCs组较为明显。结论:CXCR4基因修饰不影响BMSCs的增殖,CXCR4-BMSCs较单纯EGFP-BMSCs移植更能促进动脉损伤后早期再内皮化,降低血管成形术后再狭窄。     

大鼠骨髓间充质干细胞对胶质瘤的趋向性

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外和体内对胶质瘤细胞的趋向性.方法 免疫组织化学方法检测BMSCs和C6细胞CXCR4和SDF-1的表达.在体外应用Transwell试验检测BMSCs向C6胶质瘤细胞的迁移特性;BMSCs移植到荷瘤大鼠健侧脑内21 d后,荧光显微镜观察其迁移.免疫组织化学方法检测脑组织及肿瘤组织中CXCR4和SDF-1的表达.结果 仅少数BMSCs表达CXCR4,阳性率为0.86%;C6胶质瘤细胞表达CXCR4和SDF-1,阳性率分别为63.53%和48.42%.BMSCs在体外表现出明显的向胶质瘤细胞的迁移特性;免疫组织化学检测肿瘤组织CXCR4和SDF-1表达均呈强阳性,移植21 d后,BMSCs表现了明显的向脑内胶质瘤迁移的特性,广泛分布于肿瘤和正常脑组织之间的胼胝体、皮层和血管.结论 CXCR4和其配体SDF-1参与大鼠BMSCs向胶质瘤细胞的迁移.     

转染CXCR4基因支气管上皮细胞向SDF-1的迁移观察

目的观察转染趋化因子受体CXCR4的人支气管上皮细胞HBE向趋化因子SDF-1的定向迁移情况。方法免疫荧光和流式细胞仪检测正常HBE细胞中的CXCR4蛋白。构建CXCR4慢病毒表达载体并转染HBE细胞。实时荧光定量PCR和Western blot检测转染CXCR4的HBE细胞中的CXCR4 mRNA和蛋白,通过Transwell小室实验观察该细胞向SDF-1的定向迁移情况。结果正常HBE细胞的CXCR4蛋白表达量较低。成功构建了CXCR4慢病毒表达载体。转染CXCR4的HBE细胞中CXCR4 mRNA和蛋白都有较高水平的表达,且向SDF-1定向迁移的细胞数[SDF-1终浓度分别为1、3、10、30、100、300 nM时到达膜背面的细胞分别为（42.8±2.8）（、47.6±6.2）（、57.8±3.3）（、62.4±5.0）（、89.8±4.7）（、100.0±4.8）（、62.4±5.0）个]较未加入SDF-1时的细胞数（[32.8±2.2）个]显著增加（P均〈0.05）,并呈浓度依赖性（P〈0.05）。结论转染趋化因子受体CXCR4的HBE细胞向趋化因子SDF-1的定向迁移明显增加。     

RNA干扰阻断CXCR4基因对胰腺癌AsPC-1细胞侵袭转移的影响

目的:观察针对CXCR4基因慢病毒Lentiviral(LV)介导的RNAi转染胰腺癌细胞株As PC-1后细胞增殖、迁移、侵袭的影响,探讨可能机制.方法:人CXCR4基因干扰靶点设计后成功转染人胰腺癌细胞系As PC-1细胞,然后分为转染组(LV-si CXCR4-1)、阴性对照组(As PC-1-LV-con)和空白对照组(AsP C-1细胞),实验组加入基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α),MTT法检测细胞增殖,迁移实验检测细胞迁移,Transwell检测细胞的体外侵袭,Western blot检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质蛋白金属酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP9的表达.结果:在SFM或10%NCS培养条件下,SDF-1α均可刺激As PC-1细胞、As PC-1-LV-Con细胞增殖(P0.01),对LV-si CXCR4-1增殖均无明显促进作用;SDF-1α可促进As PC-1、As PC-1-LV-C o n细胞迁移和侵袭(P0.01),对LVsi CXCR4-1无明显促进作用;在SDF-1α作用下,LV-si CXCR4-1细胞的MMP9及VEGF的蛋白表达低于As PC-1、As PC-1-LV-Con细胞(P0.01).结论:CXCR4基因RNAi可显著抑制SDF-1α引起的As PC-1细胞的增殖、体外迁移和侵袭,进一步证实SDF-1/CXCR4受体配体系统参与了胰腺癌的增殖、侵袭及转移,通过RNAi技术可抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭及转移.     

促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞移植修复小鼠急性肾损伤的作用机制

目的:构建缺血再灌注(I/R)诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠模型,经尾静脉注射行骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植,观察外源性促红细胞生成素(EPO)对BM-MSCs移植修复AKI效应的调控,并探讨基质细胞衍生因子1(SDF-1)/CXCR4轴在调控中的作用. 方法:C57BI/6小鼠100只,随机分为正常对照组、模型组(AKI组)、BM-MSCs移植组、EPO干预组、EPO干预+BM-MSCs移植组,移植BM-MSCs采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记.建模后Id、3d、7d、14d处死部分小鼠,检测血清尿素氮(BUN)及肌酐(SCr)水平,观察肾组织病理变化,行急性肾小管损伤程度评分(ATN评分),免疫组织化学观察移植后其BM-MSCs在小鼠肾组织的分布,Western印迹法检测损伤肾组织中SDF-1水平. 结果:与BM-MSCs移植组及EPO干预组比较,EPO干预+BM-MSCs移植组小鼠BUN、SCr及ATN评分降低幅度更大,至移植后第14d小鼠的BUN、SCr水平甚至接近正常对照组.免疫组化显示BM-MSCs移植组小鼠肾脏中可检出BrdU+细胞分布,以术后第7天最多(11.32％±1.38％),在此基础上联合EPO干预可增加肾组织中BrdU+阳性细胞比例.AKI建模后肾组织SDF-1水平升高,建模后7d达高峰,EPO干预可显著增加SDF-1的表达. 结论:EPO干预可增加BM-MSCs移植后受损肾组织中移植细胞数量,增强AKI的修复作用,其中肾脏中促干细胞归巢因子SDF-1表达增加为其可能机制之一.     

人源性脐带间充质干细胞向胃癌细胞的迁移及机制探讨

目的：观察人源性脐带间充质干细胞（ UCMSCs ）是否能向胃癌细胞迁移,并探讨其可能机制。方法原代分离培养和鉴定人UCMSCs;Cylinder 柱分隔培养UCMSCs 和胃癌细胞SGC-7901,显微镜下观测细胞迁移距离;Transwell 双室培养体系检测UCMSCs 向胃癌细胞SGC-7901的迁移能力;蛋白印迹法检测胃癌细胞中基质衍生因子-1（SDF-1）和UCMSCs 中细胞趋化因子受体CXCR4的蛋白质表达;应用AMD3100特异性封闭UCMSCs 中CXCR4的表达,作为实验对照。结果成功分离得到UCMSCs;Cylinder 柱和Transwell 实验结果显示,UCMSCs 向胃癌细胞SGC-7901表现出明显的定向迁移能力;在诱导发生细胞迁移的培养体系中,胃癌细胞高表达SDF-1,同时UCMSCs 高表达CXCR4;特异性封闭UCMSCs 中CXCR4的表达后,胃癌细胞的迁移力明显下降（P ＜0．05）。结论人源性UCMSCs 可向胃癌细胞定向迁移,其可能借助SDF-1／CXCR-4轴发挥此作用。     

hRAMP1基因修饰BMSCs对心脏的保护作用及其机制

目的探讨人受体活性修饰蛋白(hRAMP)1基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)对心功能的影响及其机制。方法分离和培养兔BMSCs,流式检测细胞表面标记鉴定,建立兔心肌梗死再灌注模型,随机分为3组:Ad-EGFP-hRAMP1-BMSCs(hRAMP1-BMSCs组),Ad-EGFP-BMSCs(BMSCs组)和对照组,检测血管腔面CD31表达情况及血管内皮生长因子(VEGF)和核因子(NF)-κB表达水平,并比较超声心动图指标。结果骨髓细胞分离24 h后开始贴壁,后呈鱼群状、漩涡状排列生长,经传代后细胞逐渐呈长梭形,呈现成纤维细胞样外观。CD29阳性率95.79%,CD45阳性率12.49%和CD90阳性率98.58%。BMSCs移植后损伤侧血管腔面可见被EGFP标记呈绿色荧光的BMSCs,而对侧(未损伤血管)未检测到EGFP荧光信号。经TRITC标记的CD31在BMSCs表达处发出红色荧光,阳性转染组出现CD31和EGFP表达。细胞移植后28 d,BMSCs组及hRAMP1-BMSCs组VEGF表达显著高于对照组,NF-κB水平显著低于对照组(均P0.01);hRAMP1-BMSCs组VEGF表达显著高于BMSCs组,NF-κB水平显著低于BMSCs组(均P0.01)。hRAMP1-BMSCs组LVDd和LVDs均明显降低,LVFS和LVEF均明显增加(均P0.01)。结论 hRAMP1修饰BMSCs具有延缓及改善左室重构作用;其机制是通过hRAMP1修饰BMSCs可分化为血管内皮细胞,参与血管生成。     

过表达GATA-4骨髓间充质干细胞通过外排体修复心肌损伤的机制

目的:探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)通过分泌外排体(exosome)修复心肌损伤的机制。方法:构建过表达GATA-4的小鼠BMSCs并提取其分泌的exosome。而后将GATA-4-BMSCs-exosome与BMSCs共同培养,空载体-BMSCs-exosome与BMSCs共同培养,BMSCs-exosome与BMSCs共同培养、BMSCs单独培养及小鼠心肌细胞单独培养48h,采用Q-PCR定量检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)、α肌动蛋白(α-actin)、连接蛋白43(connexin 43)、结蛋白(Desmin)心肌特异性抗原表达量。再将过表达GATA-4BMSCs分泌的exosome与心肌细胞共培养,空载体-BMSCs分泌的exosome与心肌细胞共培养,BMSCs分泌的exosome与心肌细胞共培养及心肌细胞单独用于低氧培养无血清培养诱导细胞凋亡作为阳性对照培养48h诱导细胞凋亡。采用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率。进一步采用TMT标记定量蛋白质组学分析过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的蛋白。结果:Q-PCR显示:过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以有效促进BMSCs向心肌细胞转化并具有极强的抗凋亡能力。蛋白质谱提示有8个蛋白有关细胞分化。有6个蛋白有关细胞调亡。其中Slit homolog 2protein及Connective tissue growth factor蛋白既涉及细胞凋亡又涉及细胞分化。结论:过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以促进BMSCs向心肌细胞分化并具有抗凋亡能力。Slit homolog 2protein及Connective tissue growth factor蛋白既涉及细胞凋亡又涉及细胞分化。     

基质细胞衍生因子-1及其受体CXCR4在骨髓干细胞治疗脑梗死中的作用

脑组织损伤后修复是一个复杂的过程.随着干细胞领域基础研究的迅速发展,外源性骨髓干细胞移植和内源性骨髓干细胞动员的临床应用逐渐成为治疗缺血性脑血管疾病有效方法 之一.基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)及其特异性受体CXCR4 (CXC chemokine receptor 4)结合后形成的SDF-1/CXCR4轴,在脑梗死时骨髓干细胞的迁移、募集过程中起着关键作用.通过调控SDF-1/CXCR4轴,增加干细胞的治疗效果,将成为治疗缺血性脑血管病一个新的干预靶点.本文就脑梗死的干细胞治疗,以及SDF-1/CXCR4轴在骨髓干细胞的迁移、募集和脑梗死修复过程中的作用作一综述.     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得窦房结细胞表型的初步研究

目的 通过建立体外骨髓间充质干细胞(BMSCs)与纯化培养的乳鼠窦房结细胞共培养体系,探讨窦房结微环境对BMSCs分化的诱导作用.方法 自新生乳鼠的心脏分离窦房结细胞,并差速贴壁纯化培养,免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的表达.自成年大鼠的骨髓分离BMSCs,传2代后,用脂质体介导pEGFP-N1转染标记BMSCs,再与纯化培养的窦房结细胞以1:5比例进行直接接触共培养,并用窦房结细胞条件培养液对转染后的BMSCs进行培养作为对照.1周后应用免疫荧光检测BMSCs的HCN4和Cx45表达.结果 接触共培养组中,可见部分表达绿色荧光蛋白的BMSCs同时表达HCN4和Cx45,而条件液培养组中未见HCN4和Cx45的表达.结论 直接接触共培养体系可诱导BMSCs初步分化为窦房结样细胞.