冠心病患者外周血单个核细胞Toll样受体4表达的测定及临床意义

目的:观察Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)在冠心病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的表达水平,并探讨其与冠状动脉粥样硬化发生发展的关系.方法:流式细胞术检测50例冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)患者及40例健康对照者PBMCs TLR4的表达;生化常规测定所有入选者血脂水平;应用TaqMan荧光探针技术建立实时荧光定量RT-PCR方法,在GeneAmp 5700型检测仪上测定了入选对象PBMCs中TLR4 mRNA的含量.结果:PBMCs的阳性率为(29.5±7.9)%,显著高于健康对照组的阳性率[(23.4±7.7)%,P<0.01];冠心病组TLR4 mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组[(5.3±3.8)×106 vs (1.8±1.4)×106, P<0.01];而冠心病血脂正常组和血脂异常组的TLR4阳性率和mRNA平均拷贝数均无明显差异.结论:TLR4主要表达于外周血单个核细胞,在CAD患者中其阳性率升高;CAD患者TLR4 mRNA的含量显著高于健康对照组;TLR4的阳性率和mRNA含量高低与血脂无关;TLR4及其介导的天然免疫应答与动脉粥样硬化的发生发展存在一定的相关性.     

定量RT-PCR法检测冠心病患者外周血15-脂氧合酶基因表达水平的研究

目的建立检测15-脂氧合酶(15-Lipoxygenase,15-LOX)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR方法,测定冠心病患者外周血单核细胞中15-LOX的基因表达水平,探讨15-LOX基因表达水平与冠状动脉粥样硬化发生、发展的关系。方法构建重组质粒pMD18-T-15-LOX作为定量模板,建立以Taqman探针技术为基础的Real-ti me定量RT-PCR方法,测定了60例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者和40例健康对照组白细胞中15-LOX mRNA的含量。结果15-LOX mRNA在60例患者单核细胞中的表达范围为4.23×104～2.67×107copy/mL;40例健康对照的表达范围为6.15×103～5.25×106copy/mL,冠心病组15-LOXmRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组〔(7.43±3.81)×105vs(4.79±1.76)×104;P<0.05〕。结论成功建立了15-LOX基因表达含量的荧光定量检测方法,检测发现冠状动脉粥样硬化性心脏病患者单核细胞中15-脂氧合酶mRNA的含量显著高于健康对照组,单核细胞中的15-LOX表达量与动脉粥样硬化的发生、发展存在一定的相关性。     

荧光定量RT-PCR检测急性白血病患者外周血WT1基因的表达

目的　了解急性白血病患者外周血WT1基因的表达水平。方法　建立荧光定量RT -PCR方法 ,用PEABI 770 0PCR仪检测 114例急性白血病患者、2 6例非白血病患者和3 6例正常人外周血中WT1基因的表达水平。结果　 2 2例急性髓系白血病 (AML)和 15例急性淋巴细胞白血病 (ALL)初发患者WT1基因的表达量为 10 5～ 10 6拷贝 / μgRNA ,取得部分缓解的 2 6例AML和 19例ALL患者的表达水平为 10 2～ 10 4拷贝 / μgRNA ,而取得完全缓解的 17例AML和 13例ALL患者的表达水平为 0～ 10 2拷贝 / μgRNA。 结论　WT1基因在白血病外周血中有高水平的表达 ,可作为急性白血病疗效考核及监测微残留病的指标。     

荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用

目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。     

Real time RT-PCR定量检测AFP mRNA表达水平方法的建立

目的　建立realtime逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测AFPmRNA表达水平方法。方法　提取BEL740 2细胞总RNA ,进行RT PCR扩增并纯化AFP基因片段 ,构建重组质粒 ,建立realtimeRT PCR检测AFPmRNA表达水平方法。结果　重组质粒的阳性克隆效率为 81.8% ,经酶切鉴定 ,目的基因片段已插入PMD 18T载体内 ,得到realtimeRT PCR动力学曲线。结论　成功建立了realtimeRT PCR定量检测AFPmRNA表达水平方法。     

应用RT-PCR方法定量分析肾癌患者多药耐药基因表达水平及其临床意义

目的　探讨肾癌患者多药耐药与组织学分级和临床病理学分期之间的关系。方法　采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法定量检测36例肾癌和15例正常肾组织的mdr-1表达水平。结果　肾癌的mdr-1表达水平与肾癌的组织分级有相关性,而与临床病理分期无关。结论　临床检测肾癌患者mdr-1基因的表达,可以预测患者对化疗的敏感性,为临床选用化疗药物提供依据。     

荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达

目的：建立荧光定量RT-PCR检测肿瘤细胞有机阴离子转运多肽E(organic anion transporting polypeptide-E,OATP-E)mRNA的方法，了解乳腺癌细胞株MCF-7和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达水平。方法：构建重组质粒，绘制荧光定量RT-PCR检测OATP-E mRNA的标准曲线，并运用此方法检测MCF-7/ADR和MCF-7细胞株中OATP-E mRNA的表达。结果：荧光定量RT-PCR检测MCF-7和MCF-7/ADR细胞OATP-E的基因表达，重复10次实验所得结果平均分别为5.47×105拷贝数/μg RNA和2.82×104拷贝数/μg RNA，两者相差约19.4倍，P＜0.05。结论：成功建立了荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达的方法，检测结果用绝对拷贝数表示，定量准确可靠，并有利于标准的统一。初步应用发现乳腺癌耐药株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达量比不耐药株MCF-7减少。     

肠道病毒基因实时定量RT-PCR方法的建立

肠道病毒感染可引发众多疾病 ,并可暴发流行 ,导致死亡 ,严重危害人类健康。该病毒是病毒性心肌炎的主要病原体 ,新近又发现该病毒的持续感染与扩张性心肌病有关[1] 。因此 ,及早发现病毒感染和治疗具有非常重要的意义。本研究建立了肠道病毒的实时、定量ＲＴ ＰＣＲ检测方法 ,制备了肠道病毒ＲＮＡ的检测试剂盒 ,为肠道病毒感染的诊断及随访提供了有效的检测手段。材料和方法材料　ｐＵＣｍ Ｔ克隆试剂盒购自上海博彩公司 ,ｐＳＰ 72载体购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。逆转录酶、Ｔａｑ酶购自ＰＥ公司 ,内切酶购自Ｎｅｂ公司。Ｔｒｉｚｏｌ购自…     

应用RT-PCR分析食管癌组织中lrig1基因的表达

目的：观察lrigl基因在食管鳞癌中的表达及意义．方法：采用RT．PCR检测36例食管鳞状细胞癌癌组织、相应的癌旁组织和远癌组织中lriglmRNA的表达情况．PCR产物经凝胶电泳，比较3种组织中ragl与GAPDH条带的灰度值之比，半定量分析IriglmRNA的表达水平．结果：36例食管癌组织中有15例（42％）lriglmRNA检测到阳性表达，21例（58％）lriglmRNA表达缺失，其阳性表达率低于相应的癌旁组织（92％）和远癌组织（100．0％，P〈0．05）；癌组织中lriglmRNA表达水平（0．76±0．22）低于相应的癌旁组织（0．89±0．33）和远癌组织（1．13±0．40）；随着肿瘤分化程度的升高，lriglmRNA在癌组织中的阳性表达率也增加（P〈0．05），但lriglmRNA表达缺失与食管癌临床分期（TNM），淋巴结有无转移和病理类型均无统计学差异（P〉0．05）．结论：lriglmRNA在食管癌组织中存在表达缺失和低表达，提示Irigl基因在食管癌的发生发展中可能具有抑癌基因的作用．     

外周血MUC1基因表达与食管癌微转移的关系

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,我国食管癌发病率居世界之首,每年新增发病15万人之多.尽管采用以手术为主的综合治疗,效果仍不尽人意.     

难治性颞叶癫痫脑组织MCP-1表达及外周血单核细胞水平变化的意义

目的探讨MCP-1在难治性颞叶癫痫脑组织中的表达及外周血单核细胞水平变化的意义。方法27例前颞叶切除的海马硬化型颗叶癫痫患者,术中脑电生理技术监测棘波定位致痫灶和对照组织,分别标记后行免疫组化、免疫印迹检测MCP-1表达,配对t检验比较;测入院时外周血单核细胞水平,并与80名健康体检者作对照。结果难治性颞叶癫痫致痫灶组织中MCP-1表达较对照组织增加-夕h周血单核细胞水平阳性率较对照组增加（P〈0．05）。结论难治性颞叶癫痫患者致痫灶有MCP-1高表达,并诱导外周血单核细胞水平提高。     

乙肝患者外周血单个核细胞FOXP3 mRNA表达检测方法的建立及应用

目的:比较乙肝患者与健康人外周血单个核细胞(PBMC)中 FOXP3 mRNA表达水平差异. 方法:利用实时荧光定量RT-PCR的方法检测25例慢性乙肝患者以及11名健康人PBMC中FOXP3 mRNA的水平. 结果:乙肝患者PBMC中FOXP3 mRNA的表达水平高于健康对照组,差异具有统计学意义(P＜0.01),且与血清中的病毒含量呈正相关(r=0.70,P＜0.01),而与谷丙转氨酶(ALT)水平无关(r=0.06,P＞0.05). 结论:慢性乙肝患者FOXP3表达水平可能是HBV感染持续的一个因素.     

冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-L1的表达及意义

目的研究程序性死亡配体-1(PD-L1)在冠心病患者外周血中T淋巴细胞上的表达及意义。方法按照WHO关于冠心病诊断标准,将实验分为稳定型心绞痛(SA)组(n=23)、急性冠脉综合征(ACS)组(n=21)和正常对照组(n=18),三组均经冠状动脉造影证实。采集三组人群的外周血,用流式细胞技术及RT-PCR技术测定T淋巴细胞PD-L1蛋白及mRNA表达情况。结果与正常对照组比较,SA组和ACS组外周血T淋巴细胞PD-L1蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);但SA组与ACS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-L1表达上调,其可能在动脉粥样硬化斑块形成过程中起作用。     

CD1s在Graves病患者外周血淋巴细胞及单核细胞中的表达

目的:CD1s是一种可以识别脂质抗原的特殊分子,在多种自身免疫病中发挥了重要作用.本实验研究Graves病(GD)患者外周血淋巴细胞及单核细胞中CD1s(CD1a、CD1b、CD1c、CD1d)的表达. 方法:取33例GD患者作为试验组,另取17例正常人为对照组,用流式细胞仪检测其外周血淋巴细胞和单核细胞中CD1s+表达细胞的百分数,并同时使用微量放射免疫法检测GD患者的甲状腺功能(FT3、FT4、TSH). 结果:GD患者外周血淋巴细胞及单核细胞中CD1a+表达的细胞百分数较对照组显著升高(P<0.05),而CD1b+、CD1c+及CD1d+表达的细胞百分数与正常对照组间差异无统计学意义(P>0.05).CD1c+与FT3、FT4间呈显著正相关. 结论:部分CD1s在GD患者中的表达较正常对照组升高,这将为我们探究GD的发病机制提供了一条新的途径.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞TNIP1基因表达

目的 探讨TNIP1 基因在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞中的表达情况,以及与SLE疾病活动指数(SLEDAI)、单核苷酸多态性(SNP)位点rs10036748的相关性.方法 收集61例SLE患者和66例正常对照的临床资料及血样,采用实时荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞中TNIP1 mRNA表达量;应用Sequenom MassArray技术对所有病例对照SNP rs10036748位点进行基因分型.结果 SLE患者TNIP1基因 mRNA表达低于正常对照组(P=0.000 4);TNIP1基因 mRNA表达水平与SLEDAI和SNP rs10036748基因型之间无相关性.结论 TNIP1基因在SLE发生中可能起着某种作用.     

实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的表达

目的：建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应（real-time fluorescence quantitative RT-PCR）检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的方法,并研究其与CD4＋CD25＋Treg细胞活性相关性。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA,将mRNA逆转录成cDNA,以β-actin为内参照,实时荧光定量RT-PCR检测29例哮喘患儿及24例同龄对照FOXP3 mRNA的相对表达量,采用融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性;同时采用流式细胞技术检测CD4＋CD25＋Treg细胞含量,分析两者相关性。结果：哮喘患儿组CD4＋CD25＋Treg细胞百分率明显低于同龄对照组,P〈0.01;FOXP3 mRNA的表达也显著降低,P〈0.05;FOXP3和β-actin的融解曲线分析表明均仅有单一峰,Tm值分别为82.4℃和87.8℃;琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。结论：应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测FOXP3 mRNA表达水平简便易行、结果稳定可靠。初步结果证实,外周血CD4＋CD25＋Treg细胞数量和FOXP3 mRNA表达有相同的趋势,存在一定的相关性。     

唾液酸黏附素Siglec-1在疾病中作用的研究进展

唾液酸黏附素(Siglec-1或CD169)是表达于组织的巨噬细胞上免疫球蛋白超家族类黏附分子。在炎症反应中,Siglec-1可调节MIP-1α/β、MCP-1、MIP-2等细胞因子的分泌,促进炎症反应的发生;在病毒感染过程中,Siglec-1可通过介导病原体与巨噬细胞的的结合,促进病毒感染和吞噬;在对免疫的调节过程中,Siglec-1既可也以抑制IFN-α的过量表达,抑制固有免疫,也可抑制DC细胞活性,降低适应性免疫。本文主要阐述了Siglec-1在病原体感染、炎症反应和免疫调节中最新研究进展。     

The Gene Expression Patterns of Peripheral Blood Mononuclear Cells in Patients with Systemic Lupus Erythematosus

This study examined the gene expression patterns of peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) in patients with systemic lupus erythematosus(SLE) by using serial analysis of gene ex-pression(SAGE) technology.Following the construction of serial analysis of gene expression(SAGE) library of PBMCs collected from 3 cases of familial SLE patients,a large scale of tag sequencing was performed.The data extracted from sequencing files was analyzed with SAGE 2000 V 4.5 software.The top 30 expressed genes of SLE patients were uploaded to http://david.niaid.nih.gov/david/ease.htm and the functional classification of genes was obtained.The differences among those expressed gene were analyzed by Chi-square tests.The results showed that a total of 1286 unique SAGE tags were identified from 1814 individual SAGE tags.Among the 1286 unique tags,86.8% had single copy,and only 0.2% tags had more than 20 copies.And 68.4% of the tags matched known expressed sequences,41.1% of which matched more than one known expressed sequence.About 31.6% of the tags had no match and could represent potentially novel genes.Ap-proximately one third of the top 30 genes were ribosomal protein,and the rest were genes related to metabolism or with unknown functions.Eight tags were found to express differentially in SAGE li-brary of SLE patients.This study draws a profile of gene expression patterns of PBMCs in patients with SLE.Comparison of SAGE database from PBMCs between normal individuals and SLE pa-tients will help us to better understand the pathogenesis of SLE.     

冠心病患者外周血TL1A表达水平及临床意义

目的 探讨肿瘤坏死因子配体相关分子1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule-1A,TL1A)在冠心病患者外周血中的表达水平及临床意义. 方法 分别采用实时定量PCR和酶联免疫吸附法检测35例稳定型心绞痛(stable angina pectoris,SA)、30例不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris,UA)、25例急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者及35例正常对照外周血中TL1A mRNA的表达水平和血浆中TL1A水平. 结果 SA组(0.35±0.10)、UA组(0.43 ±0.11)、AMI组(0.53 ±0.13)患者外周血中TL1A mRNA水平明显高于对照组(0.28±0.09),差异有统计学意义(P＜0.05),UA组、AMI组患者与SA组患者相比外周血中TL1A mRNA水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05).SA组[(0.98±0.22)ng/ml]、UA组[(1.22±0.24) ng/ml]、AMI组[(1.41±0.29)ng/ml]患者血浆中TL1A水平明显高于对照组[(0.82±0.21) ng/ml],差异有统计学意义(P＜0.05),UA组、AMI组患者与SA组患者相比血浆中TL1A水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 冠心病患者外周血TL1A表达水平升高,TL1A可能参与了冠心病的发病过程.