人pcDNA3.1(+)-Cav-1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1 (+)-Cav-1真核表达载体,建立稳定转染pcCav-1的6-10B细胞系(6-10B-Cav-1).方法 提取5-8F细胞总RNA,利用RT-PCR获取caveolin-1(Cav-1)开放读码框(Open reading frame,ORF)序列构建Cav- 1/TA亚克隆载体,再将双酶切后的目的片段连入pcDNA3.1(+)真核表达载体并转染6-10B细胞.结果 RT-PCR扩增Cav-1基因ORF序列在783 bp附近见目的条带;质粒酶切鉴定及菌落PCR鉴定分别在783 bp及346 bp附近见目的条带;转染6-10B细胞后,转染组与对照组相比,Cav-1在mRNA水平表达差异具有统计学意义(P =0.027),在蛋白质水平前者比后者高出2倍以上.结论 人Cav-1重组真核表达载体pcDNA3.1( +)-Cav-1构建成功并获得稳定表达Cav -1的6-10B细胞,为进一步检测C av -1在鼻咽癌转移过程的作用奠定基础.     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

CRMP-1 真核表达载体的构建

 目的构建人坍塌反应调节蛋白1（CRMP-1）CRMP-1基因表达载体,以研究CRMP-1 蛋白在目的细胞中的生物学功能。方法
从购买的人胚肾细胞株293T 中提取总RNA,经过RT-PCR 方法扩增含人CRMP-1基因的全长cDNA,将CRMP-1基因开放阅
读框（ORF）cDNA 序列,克隆到真核表达载体p3x-FLAG-myc-CMV-24 中,构建真核表达质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24。
以酶切和CRMP-1基因序列测定方法鉴定重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 的正确性。结果酶切鉴定和CRMP-1基因序列测定均证实
重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 构建正确。结论成功构建人CRMP-1基因真核表达载体。     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

FTH1真核表达载体的构建与鉴定

目的构建携带人铁蛋白重链多肽1（FTH1）基因的真核表达载体pCMV－Myc-FTH1,为研究FXR1P与FTH1体内相互作用奠定基础。方法以人胎脑cDNA文库为模板进行聚合酶链反应（PCR）特异扩增FrH1基因片段,将扩增片段经EcoRI和XhoI双酶切后克隆到同样经EcoRI和XhoI双酶切的pCMV－Myc载体,酶切鉴定阳性克隆并进一步测序鉴定。结果成功构建了pCMV－Myc—FTH1重组真核表达载体。结论pCMV－Myc—FFH1重组真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1P与VrH1相互作用奠定了基础。对研究FXR1在脆性x综合征中的作用机理提供了依据。     

正反义人PIN1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆正、反义人PIN1基因（hPIN1）及构建hPIN1基因正、反义真核表达载体.方法 应用RT-PCR技术从人骨肉瘤细胞系MG-63细胞总RNA中成功扩增出990bp包含hPIN1基因编码区的cDNA序列,按正、反方向加上BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点后形成正、反义hPIN1基因,然后连入含BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点的pIRES2-EGFP表达质粒上,构建正、反义hPIN1基因的重组真核表达质粒phPIN1.结果 扩增的cDNA经测秩序与基因文库完全一致;BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,正、反义表达质粒形成5.3 ＋0.99kb 两条带,与理论计算值完全一致.结论 成功克隆正、反义人PIN1基因及构建hPIN1基因的正、反义真核表达载体.     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

人血管生成素1真核表达载体的构建

目的构建人血管生成素1(angiogenin-1,ang-1)的真核表达载体。方法提取人总RNA,RT-PCR特异扩增人的Ang-1cDNA,与pGEM-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α。筛选表达蓝白斑的阳性菌株扩增,提取质粒。选择正确的序列的产物,Xho I、BamH I双酶切产物和质粒,T4DNA连接酶连接,PCR扩增后转化大肠杆菌,抽提质粒进行测序。结果测序结果显示基因序列与人血管生成素1序列完全一致。结论成功构建了pEGFP/Ang-1真核表达载体。     

survivin启动子的真核表达载体构建

目的构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv。方法用PCR扩增survivin启动子,构建其真核表达载体并检测survivin启动子的活性。结果PCR成功扩增出survivin启动子,其真核表达载体构建成功。结论survivin启动子能驱动EGFP的表达,证明其具有活性。     

hOP-1全长基因克隆及真核表达载体的构建

目的证实人牙乳头细胞中OP-1的表达,获得hOP-1全长基因及其高效真核表达载体.方法提取人牙乳头细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增hOP-1全长基因并克隆入T载体,筛选阳性克隆进行序列测定后.构建高效真核表达载体pCI/OP-1并筛选鉴定.结果 PCR扩增得到一特异性的约1 300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致.构建的pCI/OP-1质粒,用于基因转染纯度较好.结论人牙乳头细胞中首次克隆到hOP-1全长基因,并构建获得该基因高效真核表达载体.     

构建人ICAM-1真核表达载体的实验研究

目的：构建人ICAM-1—1真核表达载体pcDNA3．1（-）-ICAM-1。方法：设计特异性引物,利用PCR技术扩增出ICAM-1全编码区基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。结果：PCR扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1800bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3．1（-）-ICAM-1。结论：成功构建了人ICAM-1真核表达载体,为进-步建立稳定转染ICAM-1的细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

rAQP4-M1真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的 构建rAQP4-M1基因真核表达载体,建立稳定转染AQP4-M1的CHO细胞系.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织中扩增rAQP4-M1,并将PCR产物双酶切后插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过菌落PCR、双酶切及测序验证的pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1质粒通过脂质体转染CHO细胞.G418筛选建立稳定转染rAQP4-M1的CHO细胞系.采用细胞免疫荧光和免疫印迹技术检测rAQP4-M1在该细胞系中的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.免疫荧光检测结果显示,rAQP4-M1在CHO细胞膜上稳定表达;免疫印迹检测可见34×103处的阳性条带,表明rAQP4-M1在该细胞系中成功表达.蓝绿温和胶电泳技术证实了rAQP4-M23而不是rAQP4-M1参与了正交排列颗粒(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形成.结论 rAQP4-M1在CHO细胞系中稳定表达成功,rAQP4-M1未参与OAPs的形成.     

lefty1基因真核表达载体构建鉴定及转染

目的:构建lefty1基因与pcDNA3.1(+)相融合的真核表达载体,并在lefty1基因的下游加上Flag标签,转染人肾小管上皮细胞株验证重组质粒活性。方法:设计并合成lefty1基因上下游引物,同时加上Flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag和pcDNA3.1(+)分别转染至人肾小管上皮细胞株HK-2,qPCR和Western blot检测lefty1在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以lefty1基因质粒模板扩增得到的片段约1 150bp,双酶切得到目的基因片段,测序的结果显示与lefty1基因序列相同。转染肾小管上皮细胞后,pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag能表达lefty1蛋白。结论:成功构建lefty1基因真核表达载体,为一步研究lefty1基因功能奠定了基础。     

LETM1基因真核表达载体的构建

[目的]构建线粒体LETM1基因真核表达载体．[方法]从肾癌细胞株293T细胞中提取mRNA及合成cDNA,设计并合成线粒体LETM1基因引物,用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-6上,构建重组质粒pCMV-3Tag—LETM1,经酶切和测定序列进行鉴定．[结果]构建了重组质粒pCMV-3Tag—LETM1．[结论]成功地构建了线粒体LETM1真核表达载体．     

膜联蛋白V真核表达载体的构建

目的：构建人膜联蛋白V基因真核表达载体,探讨人膜联蛋白V的生理功能。方法：PCR方法扩增含EcoRI及BamHI酶切位点的膜联蛋白V基因序列,对真核表达载体pcDNA3．1(-)和膜联蛋白V基因扩增产物进行双酶切,用连接酶将二者连接并转化到大肠杆菌BL21,重组质粒经测序鉴定,称为pcDNA3．1(-)AxV。结果：酶切琼脂糖电泳分析pcDNA3．1(-)AxV中含有膜联蛋白V基因,序列分析表明与文献报道的序列完全一致。结论：成功地构建了人膜联蛋白V基因的真核表达载体,为研究其生理作用奠定了基础。     

先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆先天性长QT综合征KCNE1基因，并构建真核表达载体。方法：从人胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出KCNE1基因；采用T-A克隆法，将KCNE1基因克隆入pCR2．1 TOPO载体中，经限制性酶切基因重组后，构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，经DNA测序鉴定，用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果：采用基因克隆和重组法，得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，并在HEK293细胞中得到了表达。结论：KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。     

融合自杀基因FCU1真核表达载体的构建与表达

目的 构建含有融合自杀基因FCU1的真核细胞表达载体pEGFP-FCU1，并转染肝癌细胞SMMC7721，初步探讨Fcu1／5-氟胞嘧啶(5-FC)系统对体外培养细胞的生长抑制作用。方法 用SmaⅠ，XhoⅠ两种限制性内切酶分别切割质粒pEGFP-C1和pCIneoFCU1，所得载体片断和目的基因片断连接后转化，阳性重组子转染肝癌细胞SMMC7721，以绿色荧光蛋白基因为报告基因，用G418筛选出阳性细胞克隆后，进行体外药物敏感实验。结果 酶切鉴定重组子阳性克隆率约为60％，转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光；转染的细胞在5-FC作用下其生长抑制率明显高于未转染细胞的生长抑制率，且旁观者效应显著。结论 自杀基因FCU1真核表达载体构建正确，转染细胞成功并获稳定表达，FCUl／5-FC系统对肝癌细胞SMCC7721具有实验性的基因治疗作用。     

RNAi人端粒酶反转录酶(hTRET)真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建和鉴定人端粒酶反转录酶( hTERT)干扰真核表达载体.方法 人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到siRNA(small inlerfereace RNA)真核表达载体pSilencer 3. 1 H1 neo;采用PCR ,酶切,浓度及纯度和测序鉴定.结果 成功构建了hTERT干扰真核表达载体.结论 hTERT干扰真核表达载体的构建为进一步研究端粒、端粒酶在肿瘤细胞中的生物学作用奠定了基础.