磷脂酰肌醇蛋白多糖-3对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨shRNA干预磷脂酰肌醇蛋白多糖（GPC）-3基因转录对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将GPC-3-shRNA插入pGPU6／GFP／Neo质粒,转染人肝癌tlepG2细胞,以Western Blot和荧光定量PCR分别分析GPC-3蛋白和mRNA表达;以nTr法分析HepG2细胞增殖;以流式细胞术、Annexin—V—PE／7-AAD及细胞凋亡-DNA ladder等分析细胞周期及细胞凋亡率。结果shRNA1转染HepG2细胞,GPC-3mRNA沉默效率为89．3％,与GPC-3蛋白下调一致;以shRNA转染HepG2细胞,增殖抑制率为71．1％;细胞周期阻滞在G1期,细胞凋亡率达65．6％。结论资料显示shRNA干预GPC-3基因转录,可显著抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。     

GPC-3特异性短发夹型RNA干预基因转录对肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察磷脂酰肌醇蛋白多糖（GPC）-3基因特异性短发夹型RNA（shRNA）对HepG2细胞增殖的抑制作用。方法设计、合成和筛选GPC-3特异的高抑制率shRNA并构建质粒;观察shRNA沉默GPC-3基因对肝癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建了4种GPC-3 shRNA干扰质粒,以脂质体介导分别转染HepG2细胞后,筛选出的shRNA干扰质粒抑制率最高达89.3%;以该高效GPC-3 shRNA质粒转染HepG2细胞24h、48h和72h后,细胞增殖较对照组分别下降了33.2%、56.0%和71.1%（P〈0.05）,细胞多被阻滞在G1期;HepG2细胞凋亡率达65.6%,显著高于对照组（约为5%,P〈0.05）。结论 GPC-3特异性的shRNA可有效降低HepG2细胞中GPC-3基因转录水平,抑制增殖并促进其凋亡。因此,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

干预磷脂酰肌醇蛋白多糖3基因转录联合抗肿瘤药物抑制肝癌细胞增殖的协同作用

目的探讨干预磷脂酰肌醇蛋白多糖(GPC)3基因转录和联合抗肿瘤药物对肝癌细胞增殖的抑制效果。方法构建4种GPC-3-shRNA质粒转染肝癌HepG2细胞,以realtime-PCR、Western Blot法观察GPC-3基因及蛋白表达水平,分析其与肝癌细胞增殖、凋亡的关系。计量资料两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果 4种转染质粒中shRNA1转染HepG2细胞效率85%,在mRNA水平的沉默效率为89.3%,GPC-3蛋白表达显著抑制(P0.01)。shRNA1干扰组72 h HepG2细胞抑制率71.1%,与阴性组比较差异有统计学意义(t=18.092,P0.001);shRNA1干扰组肝癌细胞发生生物学特性改变,迁移抑制率为89.1%,明显慢于阴性组,差异有统计学意义(t=8.326,P0.001);HepG2细胞运动抑制率为53.6%、侵袭抑制率60.1%,与阴性组比较差异均有统计学意义(t值分别为52.400、48.245,P值均0.001)。shRNA1干扰组β-catenin mRNA抑制率为46.9%,Gli1 mRNA上调率为7.4%,与对照组比较差异均有统计学意义(t值分别为30.108、-3.551,P值分别为0.001、0.009)。在24 h时,10μmol/L索拉非尼与shRNA1联合,对肝癌细胞抑制率为52.6%,100μmol/L索拉非尼与shRNA1联合,对肝癌细胞的抑制率为79.5%,与对照组比较差异有统计学意义(t值分别为23.314、50.352,P值均0.001)。索拉非尼对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC_(50))值为(4.67±1.20)μmol/L、雷帕霉素为(7.85±2.00)nmol/L、厄洛替尼为(18.36±0.56)μmol/L,与shRNA1联合使用后HepG2细胞抑制率达95.11%。结论特异性shRNA干预GPC-3转录可抑制肝癌细胞增殖、迁移运动和侵袭能力,并诱导肝癌细胞凋亡,与抗肿瘤药物协同抑制癌细胞增殖,提示GPC-3可能是肝癌治疗有效靶点,联合靶向治疗将为肝癌提供更佳治疗策略。     

SEPT9基因在人肝细胞癌侵袭转移中的作用

目的研究SEPT9基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响。方法通过westernblot法筛选SEPT9蛋白高表达肝癌细胞系,慢病毒转染沉默后检测细胞SEPT9蛋白表达量,通过EdU染色检测sh-SEPT9对肝癌细胞增殖的影响;Transwell和划痕实验检测沉默SEPT9表达后肝癌细胞的侵袭能力和迁移能力;westernblot分析沉默SEPT9表达对肝癌细胞HIF-1α、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、Vimentin, N-cadherin、E-cadherin蛋白表达影响。结果 westernblot显示SEPT9蛋白在肝癌HepG2细胞存在高表达,慢病毒转然能够获得稳定遗传的HepG2-SEPT9-shRNA细胞系,sh-SEPT9转然后,EdU染色显示HepG2细胞增殖受到明显抑制(P0.05),细胞的侵袭能力和迁移能力显著降低(P0.05);HepG2细胞Ki67、PCNA、Vimentin、N-cadherin、HIF-1α、MMP-9及VEGF表达量明显降低,E-cadherin的蛋白水平明显上升(P0.05)。结论 SEPT9基因通过增强肝癌HepG2细胞的EMT机制,促进肝癌HepG2细胞的侵袭转移。     

PBLD通过MAPK通路抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和转移

目的分析PBLD对HepG2细胞增殖、侵袭及转移的影响,并初步探讨其发挥作用的分子机制。方法首先利用细胞转染技术构建PBLD过表达的HepG2稳转细胞株,CCK-8法检测PBLD过表达后肝癌细胞增殖能力的变化,Transwell实验检测PBLD过表达后HepG2细胞侵袭、转移能力的变化,最后利用Western-blot技术筛选并验证PBLD可能的下游信号通路。结果 PBLD过表达后HepG2细胞的增殖能力被显著抑制(P0.05),同时,发生侵袭、迁移的细胞数量与空载对照细胞相比显著减低[(68±12.5)vs.(19±10.21),P0.01;(30±8.83)vs.(11±4.41),P0.01]。进一步Western-blot检测结果显示,PBLD过表达可显著抑制MAPK信号通路相关分子的表达。结论 PBLD可通过MAPK信号通路抑制Hep G2细胞的增殖、侵袭和转移。     

IL-8对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制研究

目的探讨白细胞介素-8(IL-8)在肝癌细胞中的表达及其对增殖、迁移、侵袭的影响并分析其可能作用机制。方法采用qRT-PCR与Western blot方法分别检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721及正常肝细胞L02中IL-8 mRNA和蛋白表达水平。将IL-8 siRNA转染至HepG2细胞,MTT检测沉默IL-8对HepG2细胞增殖能力的影响,Transwell迁移及侵袭实验检测沉默IL-8对HepG2细胞迁移及侵袭能力的影响,采用qRT-PCR与Western blot方法分别检测MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平。Western blot法检测沉默IL-8对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路蛋白表达的影响。HepG2细胞中加入PI3K/Akt信号通路抑制剂(LY294002),观察其对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果相较于L02相,肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721中IL-8 mRNA及蛋白表达均显著升高(P 0. 05); HepG2细胞中敲低IL-8后细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,MMP-2、MMP-9及PI3K、p-AKT表达水平均明显降低;加入LY294002可明显抑制HepG2细胞增殖、迁移及侵袭能力。结论 IL-8可能通过激活PI3K/Akt信号通路进而增强肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。     

siRNA沉默Cyclin E基因对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察siRNA沉默Cyclin E基因表达对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:构建2个靶向Cyclin E基因siRNA载体,转染人肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞.RT-PCR、Western blot检测转染后HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞Cyclin E基因mRNA和蛋白表达水平.CCK-8试验、软琼脂克隆形成实验检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖、克隆形成能力.流式细胞术、transwell试验分别检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞周期和侵袭能力.结果:构建的2个Cyclin E基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞后,干扰1组、干扰2组与空白对照组和阴性对照组比较,C y c l i n E m R N A和蛋白表达量均显著降低(P<0.05),细胞生长速度延缓,软琼脂细胞集落形成数、穿透细胞数均显著降低(P<0.05),S和G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例增加.结论:沉默肝癌细胞Cyclin E表达水平,可有效抑制细胞生长、增殖和侵袭能力.     

沉默FABP-5基因对人肝癌HepG2细胞的影响

目的:研究RNA干扰技术的重组慢病毒载体沉默人肝癌Hep G2细胞中表皮脂肪酸结合蛋白-5(fatty acid binding protein-5,FABP-5)基因对其增殖、凋亡和侵袭力的影响及作用机制.方法:构建3个靶向FABP-5基因sh RNA载体,并筛选出最有效的靶点.将Hep G2细胞分为3组:实验组用FABP-5基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-sh RNA-FABP-5)感染HepG2细胞;阴性对照组用空载慢病毒颗粒(LV-sh RNANC组)感染Hep G2;空白对照组正常培养.应用RT-PCR、实时荧光定量PCR检测FABP-5基因m RNA的表达;Western blot技术检测各组细胞FABP-5蛋白的相对表达;MTT法测定细胞体外增殖能力;Giemsa染色法检测细胞的克隆形成;细胞侵袭小室法检测各组细胞的体外侵袭力;流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测各组细胞增殖和凋亡的变化情况.结果:通过测序验证构建的FABP-5-shRNA表达载体,感染人肝癌HepG2细胞,荧光显微镜观察到细胞感染率90%.Real-time PCR和Western blot结果得出:相比空白对照组和阴性对照组,实验组的3种靶点FABP-5-sh RNA干扰序列中,LV-sh RNA-FABP-5(1)靶点中FABP-5表达的敲减率最高(P0.05),筛选出此组为最佳靶点;MTT法结果提示:实验组细胞490 n m处的吸光度(A)值在转染后第1-5天时均低于阴性对照组、空白对照组,差别有统计学意义(P0.05).Giemsa染色法结果显示:稳定转染Hep G2细胞后细胞的增殖能力明显下降(P0.05);细胞侵袭小室实验显示:与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞的侵袭力明显受到抑制(P0.05);流式细胞技术检测发现实验组的细胞相对于阴性对照组出现了明显的凋亡(P0.05).实验组较阴性对照组、空白对照组G2/M期延长,G1期缩短,差别具有统计学意义(P0.05).结论:人肝癌Hep G2细胞中沉默FABP-5基因可以有效抑制其表达,能够降低肝癌细胞的侵袭力,抑制肝癌细胞的增殖,将细胞周期阻滞于G2/M期,使其凋亡显著增加.     

内皮抑素30肽抑制HepG2细胞侵袭转移的机制

目的探讨RGD修饰的人内皮抑素30肽抑制HepG2细胞侵袭转移的机制。方法以人内皮抑素27肽作为对照,采用细胞增殖实验和Transwell实验分别检测30肽对HepG2细胞增殖和侵袭能力的影响,同时筛选与侵袭作用相关的整合素;免疫荧光检测30肽对HepG2细胞表面αvβ3整合素的聚集作用;RT-PCR及Western印迹检测30肽对细胞诱导型环氧合酶(iCOX-2)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响。结果 30肽能明显抑制HepG2细胞增殖、侵袭,对侵袭作用的影响与整合素αvβ3相关,同时30肽能下调Hep G2细胞中i Cox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白表达,30肽加入αvβ3抗体后,上述作用明显增强。结论 30肽可通过整合素αvβ3发挥其抗肿瘤侵袭转移作用。     

小干扰RNA沉默甲胎蛋白基因对HepG2细胞迁移及侵袭的影响

目的研究甲胎蛋白(AFP)对肝癌HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法应用合成的靶向沉默AFP小干扰RNA(siRNA)转染肝癌HepG2细胞,分为空白对照、阴性对照组及AFP siRNA组,各组细胞干预48 h后,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和ELISA法检测细胞转染后的沉默效率,Transwell小室实验检测沉默AFP基因后HepG2细胞的侵袭、迁移能力,用Western blotting法观察沉默AFP基因的表达对上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(N-cadherin、Vimentin和E-cadherin)、AKT和p-AKT蛋白表达的影响。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果转染沉默后,与空白对照组相比,AFP siRNA组中AFP mRNA的相对表达量明显降低(P 0.01),抑制率达86.440%,同时AFP siR NA组细胞上清液中AFP蛋白表达水平同样明显降低(P 0.01)。与空白对照组相比,AFP siRNA组的迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降,差异具有统计学意义(P值均0.01)。沉默HepG2细胞中AFP基因的表达后,与空白对照组比较,AFP siRNA组EMT相关蛋白E-cadherin蛋白的表达水平升高(P 0.01),而N-cadherin及Vimentin表达水平均明显降低(P值均0.05),且PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT的表达水平明显降低(P 0.01)。结论沉默AFP可抑制肝癌细胞转移,基于HepG2细胞株的机制研究可能与阻断PI3K/Akt通路抑制EMT相关。     

RhoA短发夹状双链RNA对肝癌细胞HepG2生物学行为的调控研究

[目的]探讨肝癌细胞HepG2中RhoA的表达水平,以及载体表达的短发夹状双链RNA(shRNA)特异性抑制RhoA在HepG2中的表达后,对肝癌细胞侵袭迁移和增殖能力的影响。[方法]RT-PCR和Western-blot方法检测RhoA在HepG2及L02中的表达;构建RhoA shRNA真核表达载体;脂质体法转染至高表达RhoA的HepG2细胞中;筛选得到稳定低表达RhoA的HepG2细胞株,用侵袭小室法(transwell)检测该细胞株侵袭和迁移能力的改变;并用染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记该细胞株,流式细胞仪检测细胞增殖能力的变化。[结果]HepG2中RhoA mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常人肝胚胎细胞系L02(两者均P0.05)。转染pshRNARhoA真核载体特异性抑制RhoA的表达后,HepG2细胞分别在侵袭实验和迁移实验中穿过微孔膜的细胞个数均远少于对照组细胞(两者均P0.05),增殖能力也明显减弱(P0.05)。[结论]抑制肝癌细胞HepG2中RhoA基因的表达能降低细胞的侵袭迁移和增殖能力,部分逆转肝癌细胞的恶性表型,为进一步研究肝癌侵袭转移和增殖机制提供了实验基础。     

下调GPC-3基因转录对肝癌细胞侵袭及血管新生的抑制作用

目的:观察以短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)下调磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)基因转录,对抑制肝癌MHCC-97H细胞侵袭和血管新生的作用与机制.方法:将对GPC-3特异性shRNA转染肝癌MHCC-97H细胞,以荧光定量PCR和Western blot分析GPC-3 mRNA及蛋白表达;以5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)和Transwell法等评估细胞增殖、迁移和侵袭能力.结果:shRNA1转染MHCC-97H细胞,GPC-3在mRNA水平下降75.6%(t=15.473,P0.001),蛋白表达同步下调;干预GPC-3基因转录,可抑制肝癌细胞增殖,细胞迁移与侵袭能力减低,与抗癌药物具协同作用;Wnt/β-catenin中β-catenin表达下调67.7%;Hedgehogs通路中脑胶质瘤相关癌基因1(glioma-associated oncogene 1,Gli1)表达上调53.3%;shRNA1转染72 h细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达下调54.2%(t=46.746,P0.001).结论:shRNA下调GPC-3转录,经Wnt/β-catenin和Hh信号通路抑制癌细胞迁移、侵袭和血管新生,为肝癌基因治疗潜在的分子靶目标.     

溪黄草黄酮对肝癌细胞增殖,迁移和侵袭的影响及相关机制

目的探讨溪黄草黄酮[Flavonoids from Rabdosia serra(Maxim.)Hara]对人肝癌细胞株Hep G2的增殖、迁移与侵袭能力的影响,并研究初步机制.方法 CCK-8法检测不同浓度溪黄草黄酮(0、1、5、10、20和40μmol/L)对Hep G2细胞活性的影响;划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测Notch-1,Cyclin D1,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平变化.结果 CCK-8法检测结果显示溪黄草黄酮呈浓度依赖性抑制Hep G2细胞的生长,当浓度到达20μmol/L时,抑制作用达到最大;经溪黄草黄酮干预后,Hep G2细胞迁移和侵袭能力显著下降,Notch-1,Cyclin D1,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平显著下降.结论溪黄草黄酮具有抑制肝癌细胞株Hep G2增殖、迁移和侵袭的作用,其作用机制可能与溪黄草黄酮抑制Notch-1-MMP-2/-9和Notch-1-Cyclin D1信号通路相关.     

新型基质金属蛋白酶抑制剂LY52对肝癌细胞HepG2.2.15体外侵袭能力的影响

目的研究新型基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)抑制剂LY52对转染HBV的肝癌细胞HepG2.2.15中MMP的表达及细胞侵袭能力的影响。方法用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐细胞增殖检测试剂盒测定LY52对细胞增殖的影响;用明胶酶谱分析法研究药物对MMP-2及MMP-9表达的影响,并进一步应用蛋白印迹(Westernblotting,WB)杂交检测MMP-2蛋白表达的改变。用侵袭小室法检测药物作用后肿瘤细胞侵袭能力的改变。结果 LY52能够抑制肿瘤细胞的增殖;明胶酶谱法和WB杂交提示HepG2.2.15细胞表达较高水平的MMP-2和MMP-9;LY52作用后,HepG2.2.15细胞的MMP-2表达受到显著抑制,而MMP-9表达的抑制作用不明显,且HepG2.2.15细胞体外侵袭能力明显降低。结论 LY52能够通过抑制MMP-2的活性及表达,抑制肝癌细胞HepG2.2.15的侵袭能力。LY52作为有潜力的抗肿瘤侵袭药物值得进一步研究。     

PEG10基因RNA干扰对人肝癌细胞系Hep3B体外增殖的影响

目的研究PEG10基因RNA干扰对肝癌细胞系Hep3B体外增殖的影响。方法psiRNA-PEG10真核表达载体转染Hep3B细胞,MTT法检测细胞体外增殖速度,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果psiRNA-PEG10真核表达载体转染Hep3B细胞后,明显沉默了Hep3B mRNA和蛋白的表达,转染后48 h抑制效率最高。Hep3B细胞体外增殖受到抑制（P〈0.05）,流式细胞仪分析结果显示大量Hep3B细胞凋亡,激光共聚焦显微镜观察到凋亡细胞形态。结论PEG10基因RNA干扰在体外可明显沉默肝癌细胞内PEG10基因的表达,抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡。     

分泌型卷曲相关蛋白2对HepG2细胞生物学行为的影响

目的 了解分泌型卷曲相关蛋白2(sFRP2)对HepG2细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为的影响.方法 采用sFRP2重组腺病毒感染HepG2细胞,四甲基偶氮唑盐法检测HepG2细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫组织化学法检测肿瘤转移相关因子的表达,Westernblot检测β连环素的表达,Tmnswell小室检测细胞迁移能力.结果 sFRP2明显抑制HepG2细胞增殖,限制细胞周期从Go/G<,1>期进入S期;sFRP2显著增强nepG2细胞CD44和CD82/KAI1等与肿瘤转移抑制相关蛋白的表达,而明显降低有助于肿瘤侵袭转移的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达; sFRP2可降低HepG2细胞的迁移能力.sFRP2感染前后,HepG2细胞均有β连环素的表达,且其表达差异无统计学意义.结论 sFRP2的重组腺病毒能成功感染HepG2细胞,并对H印G2细胞的增殖、侵袭和转移具有抑制效应.     

特异性寡聚脱氧核苷酸对Hep3B肝癌细胞恶性表型的作用

目的研究一段序列和胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因第四启动子互补的特异性寡聚脱氧核苷酸(SODN)对Hep3B肝癌细胞株的抑制效应。方法根据IGF-2基因第四启动子序列人工合成一段与之互补的特异性脱氧核苷酸,并制备其长效的硫代衍生物,通过转染试剂将其导入高表达IGF-2的Hep3B 肝癌细胞株后,采用逆转录聚合酶链反应法和western blot技术分析SODN对IGF-2基因转录和蛋白表达的抑制效应,并通过四甲基偶氮唑盐法、流式细胞术、细胞克隆形成实验以及细胞侵袭和运动实验进一步观察SODN对Hep3B细胞的生长、细胞周期、体外克隆形成能力及侵袭和运动能力所产生的影响。结果空白对照组和导入非特异性寡聚脱氧核苷酸(CODN)对照组相比,导入SODN的Hep3B细胞,其IGF-2 mRNA 和蛋白的表达有明显降低;SODN对Hep3B细胞的增殖及运动能力不产生效应,但可以抑制其在培养板上的克隆形成数和穿透Matrigel的细胞数,抑制率分别为90.2%、95.5%。结论SODN具有"分子开关"作用,可以抑制和下调Hep3B肝癌细胞的IGF-2基因表达,并可逆转其部分恶性表型。     

Zebularine对肝癌HepG2细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨新型DNA甲基转移酶抑制剂Zebularine对肝癌细胞系Hep G2细胞凋亡的影响及其机制。方法体外培养Hep G2细胞,用不同浓度的Zebularine(25~400μmol/L)处理24、48、72 h,MTT法测定其对Hep G2细胞增殖的影响;Zebularine(100、200、400μmol/L)处理Hep G2细胞48 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Rho123探针染色流式细胞仪检测线粒体膜电位变化,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9表达,并检测RUNX3基因表达情况。结果 Zebularine能抑制Hep G2细胞的增殖,呈剂量和时间依赖性;Zebularine(浓度分别为50、100、200μmol/L)作用Hep G2细胞48 h后,细胞凋亡率分别为12.4%、23.4%、35.4%,对照组凋亡率仅为3.3%;线粒体膜电位降低;凋亡相关蛋白Bax蛋白表达量升高,而bcl-2蛋白表达量降低,Pro-Caspase-3、Pro-Caspase-9表达减弱,而Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表达增强,呈浓度依赖性;RUNX3表达上调,也呈剂量依赖性。结论 Zebularine能抑制Hep G2细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与上调RUNX3表达,进而增加细胞Casepase-3、Casepase-9活性,下调Bcl-2基因的表达及上调Bax基因有关。     

KDM5C基因shRNA重组慢病毒载体的构建及其对肝癌HepG2细胞的增殖和迁移的影响

目的制备干扰KDM5C基因重组慢病毒载体,观察干扰人KDM5C基因后对肝癌Hep G2细胞增殖、迁移及长链非编码RNA GAS5表达的影响.方法设计3对针对KDM5C基因短发夹型RNA干扰序列(short hairpin RNA,sh RNA)和1对阴性对照序列,退火后连接到p LKD载体上,经转化PCR阳性克隆筛选及测序鉴定.使用四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒,慢病毒包装后用孔稀释法进行滴度测定.将慢病毒感染Hep G2细胞,q RT-PCR和Western blotting检测Hep G2细胞KDM5C的m RNA和蛋白表达.MTT法及细胞划痕实验检测转染Lv-sh KDM5C后细胞增殖及迁移能力,同时观察lnc RNA GAS5 m RNA的表达水平变化.结果P C R扩增和测序结果证明,成功构建L vsh KDM5C慢病毒载体.经包装产生的3组慢病毒载体滴度:Lv-sh KDM5C-1是4.95×108TU/m L,Lv-sh KDM5C-2是3.46×108 TU/m L,L v-s h K D M5C-3是3.08×108 T U/m L.与正常肝细胞相比,肝癌Hep G2细胞KDM5C表达明显增加.与未转染组及阴性对照组相比,3组Lv-sh KDM5C病毒感染Hep G2细胞后KDM5C的m RNA及蛋白表达量均显著下降(P0.05);其中Lv-sh KDM5C-3组下降最为明显(P0.05),因此选取Lv-sh KDM5C-3进行后续实验.MTT结果显示Lv-sh KDM5C-3转染肝癌Hep G2细胞后48 h和72 h细胞生长增殖均受到抑制(P0.05).细胞划痕实验结果显示Lv-sh KDM5C-3中细胞迁移率明显低于阴性对照组(P0.05).q RT-PCR结果表明干扰KDM5C后lnc RNA GAS5 m RNA表达显著升高(P0.05).结论本研究成功构建了特异性沉默人KDM5C基因的sh RNA慢病毒载体.将其转染肝癌Hep G2后可有效抑制细胞增殖和迁移.我们首次发现干扰KDM5C还可增加长链非编码RNA GAS5的表达.