大鼠CREB结合蛋白RNA干扰重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠CREB结合蛋白(CREB binding protein,CBP)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察该载体对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)CBP表达的沉默效应。方法设计合成4条CBP基因的siRNA序列,将筛选确定的CBP RNAi有效靶序列与pFU-GW-iRNA载体连接产生CBP shRNA慢病毒表达载体,转化、PCR筛选阳性克隆及测序鉴定。脂质体2000将CBP shRNA慢病毒载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的重组慢病毒感染大鼠VSMCs,实时定量RT-PCR检测CBP mRNA的表达,并与未转染及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞进行比较。结果 PCR扩增和测序结果证实,成功构建大鼠CBP shRNA慢病毒载体。经包装产生的慢病毒滴度为2×10~9 TU/ml,与未转染慢病毒及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞比较,CBP shRNA慢病毒转染可使VSMCs的CBP mRNA分别下降88.5%和92.7%。结论成功构建CBP基因RNAi慢病毒表达载体,对VSMCs的CBP表达具有良好沉默作用,为后期基因治疗血管增殖性疾病奠定基础。     

慢病毒载体介导人非小细胞肺癌A549细胞Akt2基因靶向抑制

目的通过构建慢病毒shRNA表达载体,靶向抑制Akt2基因的表达,获得稳定干扰Akt2基因的细胞克隆,为进一步探讨Akt2的功能奠定基础。方法设计并合成针对Akt2靶基因的双链寡核苷酸序列,经退火、酶切、连接反应,将干扰序列插入pGCsil-GFP质粒,经感受态细胞转化、阳性克隆测序鉴定所插入的片段,经转染及慢病毒包装,收集浓缩病毒进行滴度测定,感染至人肺腺癌细胞A549,通过无菌流式细胞分选GFP强阳性细胞,并应用荧光定量PCR及Western-blot验证干扰效果。结果重组pGCsil-shAkt2-GFP质粒载体经阳性克隆测序鉴定显示插入序列与shAkt2干扰序列完全符合,测定重组慢病毒vshAkt2滴度为3E＋9TU/ml。重组慢病毒shAkt2感染A549细胞,经流式细胞术分选90.1%GFP为强阳性细胞群。通过qRT-PCR与western blot检测Akt2mRNA及蛋白表达水平,提示与正常对照组比较,shAkt2组细胞中Akt2mRNA水平下降63.39%,蛋白水平减少91.56%。结论本研究所构建的慢病毒shAkt2表达载体,能够在A549细胞内稳定、有效的抑制靶基因Akt2的表达,为深入研究Akt2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用奠定了基础。     

靶向人BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证

目的:构建靶向人BRG1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并验证其沉默效率。方法:设计3个针对人BRG1基因的特异性shRNA序列(shBRG1),构建于pLKO.1慢病毒载体中,并与psPAX2和pMD2.G质粒共同转染293T细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞(HASMC),应用实时荧光定量PCR和western blot检测BRG1 mRNA和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果:3种shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低BRG1 mRNA表达水平(P均0.01)。其中shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC后BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降(P0.01)。结论:靶向人BRG1基因的shRNA慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低BRG1 mRNA和蛋白表达水平。     

大鼠PAX2基因RNA干扰慢病毒载体的构建及沉默效果

目的构建PAX2特异性shRNA干扰慢病毒载体并观察其对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)中PAX2基因的沉默效果。方法采用PAX2基因RNAi靶点序列合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定。用脂质体转染法将质粒共转染293T细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染NRK52E细胞,RT-PCR、Western印迹检测PAX2 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR与DNA测序证实合成的含PAX2 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。经RNA干扰后的靶细胞PAX2 mRNA及蛋白表达水平明显降低。结论成功构建人PAX2基因RNA干扰慢病毒载体,为以PAX2基因为靶点的梗阻性肾病基因治疗研究奠定了基础。     

靶向人 BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证

目的：构建靶向人 BRG1基因的短发夹 RNA（shRNA）慢病毒载体并验证其沉默效率。方法：设计3个针对人 BRG1基因的特异性 shRNA 序列（shBRG1）,构建于 pLKO．1慢病毒载体中,并与 psPAX2和 pMD2．G 质粒共同转染293T 细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞（HASMC）,应用实时荧光定量 PCR 和 western blot 检测 BRG1 mRNA 和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果：3种 shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低 BRG1 mRNA 表达水平（P 均＜0．01）。其中 shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC 后 BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降（P ＜0．01）。结论：靶向人 BRG1基因的 shRNA 慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低 BRG1 mRNA和蛋白表达水平。     

RNAi沉默HMGN5基因对肺癌A549细胞增殖的影响

目的构建HMGN5基因的shRNA慢病毒载体,并在肺癌A549细胞上鉴定其沉默效率,观察其对细胞增殖能力的影响。方法筛选HMGN5基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,与LentiLox3.7慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞,设阴性组及干涉组,应用Real-time PCR和Western印迹的方法检测HMGN5在mRNA和蛋白水平的沉默效率,MTT和克隆形成实验观察HMGN5基因沉默对A549细胞增殖的影响。结果构建的shRNA慢病毒颗粒感染A549细胞后,干涉组HMGN5基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了71.7%,显著抑制其蛋白表达;MTT结果表明细胞增殖能力明显降低,干涉组克隆形成能力较阴性组明显减弱。结论成功构建了HMGN5基因的shRNA慢病毒表达载体,其能够在肺癌A549细胞上有效沉默靶基因。HMGN5基因具有影响肺癌细胞恶性增殖的能力,为肺癌的基因治疗奠定了实验基础。     

人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒载体的构建及沉默效应鉴定

目的构建PETA-3/CD151shRNA慢病毒表达载体,并在人乳腺癌细胞株MCF-7细胞鉴定其转染及基因沉默效果。方法应用基因工程技术,构建4条针对PETA-3基因的RNAi靶序列,分别与慢病毒载体Pg LV3连接,构建重组慢病毒表达载体PETA-3-shRNA-1~4;将连接产物转化到Top10感受态细胞,经筛选阳性克隆、测序鉴定。应用脂质体法转染293FT细胞,进行病毒包装及滴度测定。将包装产生的4种重组慢病毒分别感染MCF-7细胞,实时定量PCR和Western印迹检测MCF-7细胞PETA-3 mRNA和蛋白的表达。根据筛选的结果,选取最有效的载体进行病毒的大量包装。结果 4个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,感染MCF-7细胞96 h后,PETA-3-shRNA-2 mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降,其中mRNA表达下降85%,蛋白表达下降84%(均P<0.05)。shRNA-2病毒载体大量包装后其滴度为1×109TU/ml。结论成功构建针对PETA-3基因的慢病毒载体PETA-3-RNAi-LV3,体外感染MCF-7细胞后可有效抑制PETA-3基因和蛋白的表达。     

慢病毒介导的CyPA基因沉默对非小细胞肺癌细胞生长的影响

目的 构建特异性沉默CyPA基因的慢病毒颗粒,体外观察其对非小细胞肺癌H1299细胞生长的影响. 方法根据已筛选的特异性沉默CyPA基因靶序列寡核苷酸,合成一对正义反义寡核苷酸DNA,采用基因克隆技术分别插入PGCL-GFP慢病毒载体,以脂质体法将重组PGCL-GFP与病毒包装载体pHelper1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,制备假包装病毒颗粒(Lv-shCyPA)并感染非小细胞肺癌H1299细胞,4 d后采用RT-PCR、Western-blot及MTT分别检测CyPA基因mRNA、蛋白表达水平及H1299细胞增殖状态.结果 构建的LV-shCyPA慢病毒颗粒感染H1299细胞,CyPA mRNA及蛋白表达显著下调,H1299细胞生长明显减缓,与未转染病毒、阴性对照病毒转染的H1299细胞比较有显著差异(P＜0.05).结论 成功构建了沉默CyPA基因慢病毒载体,其产生的假包装病毒颗粒能特异地沉默CyPA基因,抑制H1299细胞增殖,提示CyPA可能在非小细胞肺癌的发生发展中发挥一定的作用.     

Cx43基因shRNA慢病毒载体的构建及其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用

目的构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用。方法针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序。用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度;以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率;应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果。结果经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108TU/mL、转染效率为82.59%。荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10%,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16%。结论成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达。     

靶向MTDH的小干扰RNA对人原发性肝癌细胞HepG2骨架重排的影响

目的构建人MTDH基因的shRNA干扰载体,并观察其对原发性肝癌细胞HepG2骨架重排的影响。方法针对MTDH基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到载体pGCsilencerTM H1/Neo中,RT-PCR、Western blotting及免疫荧光检测转染后MTDH mRNA和蛋白表达变化情况,并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体,并将其转染人原发性肝癌细胞HepG2,用罗丹明标记的鬼笔环肽显示沉默MTDH基因后对人原发性肝癌细胞HepG2骨架蛋白F_actin的改变。结果靶向MTDH干扰质粒构建成功。与转空载体的阴性对照组及未转染组比较,转染pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-shRNA后,HepG2中MTDH mRNA和蛋白表达明显降低,其中以pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-S1最为明显,达到90%以上;细胞形态及细胞骨架显示转染pGCsilencerTMH1/Neo-MTDH-S1的细胞骨架蛋白F_actin发生重排。结论成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向MTDH干扰pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-S1,该载体能有效重排肝癌细胞骨架。     

体外靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的 本研究旨在构建靶向肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达。方法 设计了2对针对TP53BP2基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后,应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落PCR和测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,并采用Western Blot、qRT-PCR和激光共聚焦技术观察慢病毒Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞TP53BP2基因的干扰效果。结果 测序比对结果显示,各重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示各重组慢病毒体构建成功;重组慢病毒载体经慢病毒包装后,显示pHS-ASR-LW429、pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513的滴度分别为9.7×10⁸ TU/mL、6.1×10⁸ TU/mL和6.4×10⁸ TU/mL;用慢病毒Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)感染HepG2细胞后,与...     

慢病毒携带的短发夹RNA对乳腺癌细胞乙酰肝素酶基因表达的沉默作用

目的通过构建短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,探讨慢病毒携带的shRNA对乳腺癌细胞乙酰肝素酶(HPA)基因表达的沉默作用。方法采用RNA干扰(RNAi)序列设计原则,以乳腺癌HPA基因为靶基因,将构建5对shRNA重组慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过Western印迹检测HPA-shRNA对MDA-MB-231细胞HPA蛋白表达水平的影响;用CCK-8的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞的生长抑制作用及5-氟尿嘧啶(5-Fu)对乳腺癌细胞的杀伤作用,运用transwell实验检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。进一步,运用流式分析的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞周期的影响。建立小鼠转移瘤模型,检测HPA-shRNA在体内对乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果成功构建HPA-shRNA重组慢病毒载体。在体外,实验组HPA-shRNA1组、HPA-shRNA3组、HPA-shRNA4组有效沉默了人乳腺癌MDA-MB-231细胞HPA的表达,HPA蛋白表达明显降低(P<0.05)。HPA-shRNA1对乳腺癌细胞的生长具有良好的抑制作用,HPA-shRNA1能够增加乳腺癌细胞对5-Fu的敏感性。此外,HPA-shRNA1能够诱导乳腺癌细胞在S期发生细胞周期阻滞。在体内,HPA-shRNA1组HPA基因mRNA相对表达量明显低于阴性对照组(P<0.05),HPA-shRNA1能够沉默乳腺癌移植瘤HPA mRNA表达。在体内HPA-shRNA1同样能够抑制乳腺癌细胞生长。结论 HPA-shRNA重组慢病毒载体可有效抑制乳腺癌HPA基因的表达,进而发挥良好的抗肿瘤作用。     

慢病毒载体介导的结缔组织生长因子基因沉默对下游基因的影响

目的利用RNA干扰技术,以慢病毒为载体,介导结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默,并观察其对下游基因表达的影响。方法用构建的CTGF小干扰RNA(siRNA)慢病毒转移质粒与包装质粒、包膜蛋白质粒共转染293T细胞,包装成介导CTGF基因沉默的慢病毒载体;感染肝星状细胞系HSC-T6,应用Real-time PCR和Western免疫印迹法筛选基因沉默效率最高的慢病毒载体;再根据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测感染效率;应用Real-time PCR法检测CTGF基因沉默后HSC-T6中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2和I型胶原mRNA表达水平。结果包装的慢病毒载体感染HSC-T6细胞的效率高于50%;感染HSC-T6细胞后,CTGF的表达在mRNA和蛋白水平均受到明显抑制,其中TS1具有最佳的抑制效率;HSC-T6细胞CTGF基因沉默后,其TIMP-1、TIMP-2和I型胶原mRNA水平也显著降低。结论包装的慢病毒载体在HSC-T6中具有较好的感染效率和CTGF基因沉默效果,基因沉默后可进一步抑制HSC-T6细胞TIMP-1、TIMP-2和I型胶原的基因表达,这在抗纤维化的研究中具有积极的意义。     

ezrin基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其在人胃癌SGC-7901细胞系中的表达

目的构建ezrin基因RNA干扰慢病毒载体并建立ezrin基因稳定干扰的人胃癌SGC-7901细胞系,为ezrin基因的功能研究奠定基础。方法设计ezrin基因特异性RNA干扰靶序列,与PHR-SIN-CSGW-H1a载体定向连接,构建PHR-SIN-CSGW-H1a真核入门表达载体。通过与psPAX2和PMD2.G载体进行重组,获得ezrin基因真核表达重组慢病毒表达载体。利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染人胃癌SGC-7901细胞。结果成功构建PHR-Eai-psPAX2-PMD2.G真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度>1×107U/L。RT-PCR、Western blot结果表明,ezrin基因mRNA及蛋白表达显著降低。结论成功构建人ezrin基因特异性的重组慢病毒干扰载体,获得ezrin基因稳定干扰的人胃癌SGC-7901细胞系。     

双启动子shRNA干扰的协同效应

目的构建含有两段不同靶特异干扰序列的双启动子shRNA载体,并比较其与单个靶特异干扰序列的shRNA载体的干扰效应。方法通过PCR方法扩增H1启动子序列,构建含有U6和H1双启动子的shRNA载体,命名为PLKO.1-H1。设计2对针对EGFP基因不同位点的shRNA片段,同时设计2对无干扰作用的片段shS1和shS2作为对照。分别构建携带上述片段的慢病毒表达载体shEGFP1-H1-shS2、shS1-H1-shEGFP2及shEGFP1-H1-shEGFP2,同时以shS1-H1-shS2质粒作为对照。将重组质粒转染293t细胞,收集病毒感染Hela/EGFP细胞。比较各组之间细胞的荧光强度,并以Western blot检测EGFP的蛋白表达情况。结果成功构建含有双启动子的shRNA慢病毒表达载体。实验组与对照组相比,EGFP蛋白表达水平明显下调,以shEGFP1-H1-shEGFP2重组质粒干扰效应最强。结论含有两段不同靶特异干扰序列的双启动子shRNA载体存在协同干扰效应。     

人MEF2C基因shRNA慢病毒载体构建及其对Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响

目的构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对髓母细胞瘤Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响。方法设计MEF2C基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pGLV3/H1/GFP/Puro载体,筛选有效shRNA慢病毒载体,继而在293T细胞中包装成病毒颗粒,将其感染髓母细胞瘤Daoy细胞,Real-time PCR检测MEF2C mRNA。结果构建的MEF2C基因shRNA慢病毒载体测序正确,包装获得的shR-NA慢病毒颗粒感染Daoy细胞后其MEF2C mRNA表达量较阴性对照组下降了81.1%。结论成功构建了MEF2C基因shRNA慢病毒表达载体并包装成慢病毒颗粒,其能够有效抑制MEF2C mRNA的表达。     

MCFP慢病毒干涉载体及HepG2稳定细胞系的构建

目的:研究线粒体转运蛋白质超家族新成员SLC25A40(MCFP)RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体对人肝癌细胞系HepG2细胞中MCFP基因的沉默效果.方法:通过RNAi序列设计软件进行MCFP干涉片段设计,筛选出MCFP基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pSiCoR-MCFP慢病...     

靶向RelA(p65)基因shRNA慢病毒载体构建及功能鉴定

目的 构建靶向RelA(p65)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并对其功能进行验证。方法 设计3对针对RelA基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落聚合酶链式反应(PCR)及测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,通过Western blot实验筛选出对HepG2细胞株中RelA基因干扰效果最好的慢病毒,并通过CCK-8检测Lenti-shRelA对细胞增殖活性的影响。结果 测序结果显示重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示重组慢病毒载体构建成功。重组慢病毒Y4056、Y21318、Y21319、Y21320的滴度分别为3.13×10⁸ TU/ml、2.97×10⁸ TU/ml、2.51×10⁸ TU/ml、3.40×10⁸ TU/ml。用慢病毒Lenti-shRelA(Y21318、Y21319、Y21320、Y4056)感染HepG2细胞,Wester...     

小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体的构建及其在DC2.4细胞中的表达

目的构建携带小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体,鉴定其在小鼠树突状细胞系(DC2.4)中SOCS1基因的表达并筛选稳定沉默表达SOCS1基因的小鼠树突状细胞系。方法根据小鼠SOCS1基因筛选相应靶序列,与表达载体pYr-Lvsh连接后转化感受态DH5α细胞,挑取细胞克隆进行酶切及测序鉴定,鉴定正确的载体转染293FT细胞,进行慢病毒包装及滴度测定。将包装的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA转染DC2.4细胞系,通过荧光显微镜、流式细胞仪及real-time PCR检测DC2.4细胞中SOCS1基因的表达,通过台盼蓝染色检测转染后细胞活性。结果表达载体pYr-Lvsh测序显示引物完全连接到载体上。将测序所得序列与引物比对,PLV-musSOCS1-sh构建成功。扩增后检测慢病毒滴度约为4×109 TU/ml。慢病毒转染24h后荧光显微镜下可见少量表达绿色荧光的DC2.4细胞,且随着时间的延长,转染成功的细胞逐渐增多,细胞内荧光强度渐次增强,48h后表达量明显增多,72h后更加明显。经流式细胞仪检测,转染48h及72h细胞绿色荧光表达率均达100%。对照组的细胞活性为(92.27±0.80)%,转染组转染后48h的细胞活性为(88.40±0.92)%,差异有统计学意义(t=5.499,P0.01);转染组转染后72h的细胞活性为(44.97±3.70)%,与对照组及48h转染组比较差异有统计学意义(t值分别为21.637和19.733,P0.01)。real-time PCR检测,转染组SOCS1基因相对表达量较空病毒载体对照组下调约75.3%(t=-10.179,P0.01)。结论构建的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA在DC2.4细胞中成功沉默SOCS1基因并稳定表达,成功筛选出低表达SOCS1基因的小鼠树突状细胞系,为通过SOCS1基因沉默调控DC免疫状态抗真菌感染免疫等相关研究奠定了基础。     

shRNA基因沉默靶向治疗对乳腺癌细胞HER2表达的影响

目的 构建针对HER2基因RNA干扰的真核表达载体并筛选出HER2基因的高效RNA干扰序列.方法 采用化学合成方法合成三段针对HER2基因的shRNA,通过酶切连接方法与真核表达载体pSuper/GFP/neo相连接,构建针对HER2基因的RNA干扰载体,并通过酶切和测序方法鉴定是否含有设计的shRNA.应用脂质体转染试剂分别转染载体到人乳腺癌SK-BR-3细胞中,采用实时定量PCR和Western印迹检测其对HER2基因沉默的效果.结果 EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定,281 bp条带出现,证明质粒中插入外源基因,再经测序证实含有设计的shRNA序列.实时定量PCR和Western印迹结果显示3段shRNA均可降低HER2 mRNA的水平并且降低跨膜蛋白HER2的表达,其中shRNA2的HER2 mRNA抑制效率最高,达到89%.结论 构建了3个真核表达载体pSuper/GFP/neo-HER2,并筛选出shRNA2这段序列,可以有效沉默人乳腺癌细胞系SK-BR-3 的HER2基因,为乳腺癌的HER2基因沉默靶向治疗奠定了基础.