CREB1在氧诱导视网膜病变小鼠模型中的表达变化

目的研究CREB1在氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型视网膜新生血管形成中的表达变化,探寻视网膜新生血管形成的可能机制。方法实验研究。选用7日龄健康清洁级C57BL/6J小鼠134只,随机分为正常对照组（67只）和OIR模型组（67只）。将小鼠与哺乳母鼠共同置于（75±2）％氧环境内饲养5 d后转移至正常环境中饲养5 d,建立小鼠OIR模型,17日龄的OIR鼠在空气中再继续饲养4 d,正常对照组在正常氧环境中饲养21 d。出生后第17 d时取OIR模型组和正常对照组小鼠制备视网膜切片HE染色法和FITC-dextran心脏灌注视网膜铺片法观察视网膜新生血管情况,以及视网膜组织冰冻切片免疫荧光染色观察P-CREB1表达情况。取2组鼠第7、9、12、14、17、21 d的视网膜采用实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）法和Western Blot法检测CREB1mRNA和蛋白在小鼠视网膜中的表达情况。数据分析采用独立样本t检验和两因素方差分析方法,两两比较采用Bonferronipost-test检验。结果17 d时OIR模型组较正常对照组突破视网膜内界膜的内皮细胞核数明显增加（t=11.31,P<0.05）,且模型组视网膜新生血管区及无灌注区面积分别为（21.40±2.72）%和（30.61±3.12）%。与正常对照组相比,模型组小鼠视网膜中可见大量P-CREB1蛋白荧光,主要表达在内核层和神经节细胞层。Real-time PCR和Western Blot结果表明,正常对照组第7、9、12、14、17天的CREB1mRNA和蛋白在视网膜中的表达水平逐渐升高,21 d时开始出现下降的趋势;在各相应时间点OIR模型组里的CREB1相对表达量除第7天外,其余时间点均高于正常对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论CREB1的表达水平与视网膜新生血管的形成存在时空对应关系,CREB1的高表达可能参与了OIR模型中视网膜新生血管的形成过程。     

靶向血管内皮生长因子的RNA干扰抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管生成的研究

目的探讨玻璃体腔注射靶向血管内皮生长因子（VEGF）的RNA干扰慢病毒抑制氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜新生血管生成的作用及其机制。方法实验研究。构建4对针对靶基冈小鼠VEGF的siRNA干扰载体,筛选并进行慢病毒包装。60只C57Bif6J小鼠分成4组（每组15只）：正常对照组．OIR模型组,OIR＋空载体组,OIR＋VEGF-RNA干扰组。OIR＋空载体组和OIR＋VEGF-RNA干扰慢病毒组的小鼠在生后第5天玻璃体腔注射相应的1μ1的7.5×10^7空载体慢病毒和VEGF-RNA干扰慢病毒。后3组小鼠在生后第7天建立OIR模型。第17天时FITC-Dextran灌注视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态及面积变化,视网膜铺片免疫荧光染色检测紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin的分布变化．Westernblot检测VEGF、磷酸肌醇3激酶（P13K）、酪氨酸蛋白激酶SRC、磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）蛋白表达量的变化。数据采用单因素方差分析进行比较。结果FITC-Dextran灌注视网膜铺片显示正常组视网膜血管分布呈均匀网状;RNA干扰组新生血管面积（0．271399mm^2）明显较OIR模型组（1.212782mm^2）、空载体组（1．152504mm^2）少（F=449．924,P〈0．01）。OIR模型组和空载体组间差异无统计学意义,其余两两间差异均有统计学意义（P〈0．01）。视网膜铺片免疫荧光染色显示紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin在RNA干扰组中与正常组相似,呈均匀光滑线性分布,而在OIR模型组、空载体组的分布中断、不均匀,在新生血管团中可见团块状的强荧光;VEGF的RNA干扰组中VEGF、P13K、酪氨酸蛋白激酶SRC和p-ERK的蛋白表达量较OIR模型和空载体组低。结论玻璃体腔注射靶向VEGF的RNA干扰慢病毒能有效抑制OIR小鼠模型中VEGF及其下游通路蛋白的表达．从而抑制视网膜新生血管的形成．为临床上早产儿视网膜病变的防治提供了新思路和新途径。     

基质细胞衍生因子-1在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中的表达

背景早产儿视网膜病变（ROP）的进展与多种新生血管调控因子有关,而基质细胞衍生因子·1（SDF．1）在氧诱导视网膜病变（OIR）动物模型视网膜中的表达及其作用机制尚不明确。目的对SDF-1在OIR小鼠模型视网膜中的表达进行定位和定量分析。方法应用随机数字表法将动物随机分组。将20只7日龄C57BL／6J幼鼠暴露在体积分数（75±2）％浓度的高氧状态下5d,随后在正常氧环境下5d,作为OIR组;另20只同日龄幼鼠作为正常对照组。通过免疫组织化学染色和实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR）法观察视网膜的SDF-1的蛋白表达以及SDF-1mRNA的变化。结果OIR组12日龄小鼠的视网膜神经节细胞层可见SDF．1蛋白呈阳性表达;OIR组17习龄小鼠的神经节细胞层、内层视网膜的血管内皮细胞、新生血管内皮细胞可见SDF-1蛋白呈强阳性表达;正常对照组12日龄小鼠SDF-1蛋白和正常对照组17日龄小鼠SDF-1蛋白微弱表达于内层视网膜及视网膜血管附近。OIR组17日龄小鼠的SDF-1mRNA表达水平明显高于OIR组12日龄小鼠（P〈O．01）及正常对照组17日龄小鼠（P〈0．01）;OIR组12日龄小鼠SDF-1mRNA表达水平明显低于正常对照组12日龄小鼠（P〈0．05）。OIR组17日龄小鼠的SDF-1mRNA表达水平明显高于OIR组12日龄小鼠（t=8．072,P〈0．05）和正常对照组17日龄小鼠（t=10．026,P〈O．05）;OIR组12日龄小鼠SDF-1mRNA表达水平明显低于正常对照组12日龄小鼠（t=4．336,P〈0．05）。结论SDF-1在相对低氧状态下的视网膜中表达明显上调,因而可促进OIR的视网膜新生血管形成。     

VEGF siRNA抑制鼠视网膜新生血管的实验研究

背景血管内皮生长因子（VEGF）在视网膜新生血管的发生过程中发挥重要作用,抑制VEGF是目前视网膜新生血管治疗和预防研究的热点。VEGF小片段干扰RNA（VEGFsiRNA）在抗肿瘤新生血管的研究中已经取得了显著疗效,但对于视网膜新生血管的干预作用报道较少。目的研究VEGF siRNA对鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法48只新生C57BL／6J幼鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、空载体组和VEGF siRNA质粒转染组,每组12只幼鼠。7日龄C57BL／6J幼鼠36只及其母鼠置于密闭的氧舱5d建立缺氧性新生血管模型,其中12只幼鼠不进行质粒转染作为模型对照组,其余24只鼠玻璃体腔内注射脂质体（LF2000）包裹的空载体质粒或VEGF siRNA表达质粒。待小鼠19日龄时获取小鼠眼球并分离视网膜,用苏木精一伊红染色法计数各组小鼠视网膜新生血管内皮细胞核的数目,用实时荧光定量聚合酶链反应（tea-time PCR）法检测视网膜中VEGF mRNA的表达,并应用免疫荧光技术检测小鼠视网膜中VEGF蛋白的表达。结果正常对照组、模型对照组、空载体组和VEGFsiRNA质粒转染组19日龄小鼠视网膜突破内界膜的内皮细胞细胞核数目分别为（0．19±0．09）个、（24．89±2．03）个、（23．65±2．15）个和（8．83±1．12）个,表明VEGFsiRNA质粒转染组小鼠的新生血管内皮细胞数明显低于模型对照组和空载体组,差异均有统计学意义（q=5．67、q=4．97,P〈0．01）。Real-time PCR检测表明,正常对照组小鼠视网膜中仅见弱的VEGF mRNA表达,而模型对照组与空载体组VEGF mRNA表达量为正常对照组的52．3倍和36．7倍,VEGF siRNA质粒转染组小鼠视网膜VEGF mRNA的表达量为正常对照组的3．5倍,明显低于模型对照组与空载体组。VEGF siRNA对VEGF mRNA的抑制率为43．39％。免疫荧光染色显示,正常对照组小鼠VEGF蛋白呈弱阳性表达,模型对照组和空载体组VEGF小鼠视网膜中VEGF蛋白表达呈强阳性,VEGF siRNA质粒转染组VEGF蛋白表达明显减弱。结论玻璃体腔注射VEGF siRNA表达质粒可有效抑制C57BL／6J小鼠氧诱导视网膜病变模型新生血管的形成。     

DNA损伤标志物γH2AX在氧诱导视网膜新生血管形成中的作用

背景 氧浓度变化诱导产生视网膜新生血管,并导致细胞DNA损伤反应.以往认为促血管生成因子过度表达是血管新生的原因,但DNA损伤是否与视网膜新生血管有关尚不清楚. 目的 探讨参与DNA损伤修复的磷酸化蛋白γH2AX与小鼠视网膜血管新生的关系. 方法 应用72只17日龄C57BL/6J小鼠按照随机数字表法随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组,每组18只.视网膜铺片免疫荧光法对比观察视网膜新生血管形态学变化及γH2AX表达情况.将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)分为正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组.细胞处理后12h,采用免疫荧光法比较并分析各组γH2AX的表达情况,采用Western blot法定量检测各组γH2AX的表达. 结果 正常对照组、OIR模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组17日龄小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积比较,总体差异均有统计学意义(F=437.62、93.05,均P＜0.01),其中OIR模型组和OIR阴性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较正常对照组明显增大;OIR阳性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较OIR模型组和OIR阴性对照组明显减小,差异均有统计学意义(均P＜0.01).17日龄小鼠视网膜γH2AX焦点团聚集出现情况与新生血管和无灌注区面积大小变化趋势相一致.正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组HUVECs中γH2AX焦点阳性细胞百分数比较,差异有统计学意义(F=64.97,P＜0.01),其中低氧模型对照组和阴性干扰组γH2AX焦点阳性细胞百分数均较正常对照组明显增大,差异均有统计学意义(均P＜0.01);阳性干扰组均较低氧模型对照组和阴性干扰组明显减小,差异均有统计学意义(均P＜0.01).各组HUVECs间γH2AX的表达量与免疫荧光趋势相一致.结论 缺氧环境下,γH2AX在小鼠视网膜血管和体外培养的HUVECs中均大量表达.γH2AX的表达与视网膜血管新生有关.低氧诱导的DNA损伤修复反应可能与视网膜血管新生有一定关系.     

慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00%、(35.71±2.81)%、(36.57±4.53)%、(15.33±4.75)%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。     

CXCL12/CXCR4轴调节小鼠角膜新生血管的实验研究

目的 观察CXCL12/CXCR4轴与VEGF-A家族及角膜新生血管之间的关系。设计 实验研究。研究对象 24只小鼠。方法 将小鼠分为三组,每组8只。采用标准三针缝线法诱导小鼠出现角膜新生血管,1组为缝线诱导的角膜新生血管模型组,2组为缝线联合平衡盐溶液结膜下注射组,3组为缝线联合AMD 3100结膜下注射组。观察7天后角膜新生血管情况,免疫组化方法检测 CXCR4表达,荧光定量PCR、蛋白印迹法检测CXCL12/ CXCR4以及VEGF-A、VEGFR-1的表达,免疫荧光分析检测新生血管侵入的面积。主要指标 CXCR4表达,CXCL12/ CXCR4以及VEGF-A、VEGFR-1的表达,角膜新生血管面积。结果 在缝线模型组,CXCL12（0.40±0.01 μg）、CXCR4（0.40±0.03 μg）、VEGF-A（0.99+0.39 μg）、VEGFR-1 （0.91+0.45 μg）在mRNA和蛋白水平的表达均明显升高。在结膜下注射AMD3100组中CXCL12（0.20±0.02 μg）、CXCR4（0.28±0.07 μg）、VEGF-A（0.64+0.20 μg）及VEGFR-1 （0.64+0.25 μg）在mRNA和蛋白水平的表达降低。CXCL12/CXCR4的表达增多与免疫荧光显示的新生血管面积增大一致（1.00±0.22）。结论 CXCL12/CXCR4通过VEGF-A参与角膜新生血管生成,AMD3100可望用于控制角膜新生血管形成。     

脂质体介导缺氧诱导因子-1α特异性小干扰RNA重组质粒对小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的 观察脂质体LipofectamineTM 2000(LF2000)介导pSUPER为载体的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性小干扰RNA重组质粒(pSUPERsiHIFα)对小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 构建重组质粒pSUPERsiHIF-1α.将48只7日龄C57BL/6J小鼠分为正常组、空白对照组、空载体组和基因治疗组,每组12只.正常组小鼠在正常空气中饲养.空白对照组、空载体组和基因治疗组建立氧诱导的视网膜新生血管模型.后空白对照组小鼠不再作任何处理.于出舱前1d,空载体组小鼠玻璃体腔注射pSUPER和LF2000脂质体混合物1μl,基因治疗组小鼠玻璃体腔注射重组质粒pSUPERsiHIF1α和LF2000脂质体混合物1μl.采用荧光造影视网膜铺片观察各组小鼠视网膜血管形态变化;作病理切片,光学显微镜下计数各组突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数;免疫组织化学染色法检测各组小鼠视网膜中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达;逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)检测各组小鼠视网膜中HIF-1αmRNA的表达.结果 视网膜铺片荧光显微镜观察显示,正常组小鼠整个视网膜血管分布呈均匀网状;空白对照组、空载体组小鼠视网膜中周部可见大片无灌注区及新生血管丛,伴荧光渗漏;基因治疗组无灌注区及新生血管丛空白对照组、空载体组明显减少,视网膜血管网状结构基本正常.光学显微镜观察发现,空白对照组、空载体组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数较正常组明显增多,差异有统计学意义(F=5850.016,P＜0.05);基因治疗组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数较空白对照组明显下降,差异有统计学意义(F=3012.469,P＜0.05).免疫组织化学染色结果显示,HIF-1α蛋白阳性表达主要位于细胞核中,VEGF蛋白阳性表达主要位于细胞浆中.正常组小鼠视网膜中HIF-1α蛋白表达均呈阴性,VEGF蛋白表达呈弱阳性;空白对照组、空载体组小鼠HIF-1α、VEGF蛋白表达均呈阳性;基因治疗组小鼠视网膜中HIF-1α、VEGF蛋白表达均呈弱阳性.RT-PCR检测结果显示,空白对照组、空载体组较正常组小鼠视网膜中HIF-1α mRNA表达上调,差异有统计学意义(F=3102.326,P＜0.05).基因治疗组小鼠视网膜中HIF-1α mRNA表达较空白对照组下调,差异也有统计学意义(F=3336.425,P＜0.05).结论 脂质体介导重组质粒pSUPERsiHIF-1α转染视网膜可有效抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的形成.     

抗血管内皮生长因子对氧诱导视网膜新生血管病变模型小鼠视网膜多巴胺含量的影响

目的　研究抗血管内皮生长因子（VEGF）融合蛋白康柏西普（Conbercept）玻璃体内注射对小鼠氧诱导视网膜新生血管病变（OIR）模型中视网膜多巴胺（DA）含量的影响。方法　普通级7 d龄C57BL/6小鼠100只,随机分为空白对照组、OIR组、OIR+生理盐水（NS）组及OIR+ Conbercept组,每组25只。其中空白对照组小鼠在常氧环境中饲养至17 d龄。OIR组、OIR+NS组及OIR+ Conbercept组小鼠通过高流量吸氧建立OIR模型,并在此环境中饲养至12 d龄,OIR+NS组和OIR+Conbercept组小鼠分别行右眼玻璃体内注射1 μL NS、1 μL Conbercept后,在常氧环境中饲养至17 d龄,处死。取各组小鼠右眼眼球行HE染色及视网膜铺片,观察突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数及血管分布;行Western blot检测各组小鼠视网膜中酪氨酸羟化酶（TH）、血管内皮生长因子（VEGF）表达量;行高效液相色谱仪检测各组小鼠视网膜DA含量。结果　空白对照组小鼠视网膜各层清晰,未见明显无灌注区及新生血管。与空白对照组相比,OIR组小鼠视网膜各层排列紊乱,视盘周围可见大片无灌注区,突破内界膜的血管内皮细胞核数、VEGF相对表达量均增加,TH相对表达量、DA含量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;OIR+NS组与OIR组相比,小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量差异均无统计学意义（均为P>0.05）;与OIR组及OIR+NS组相比,OIR+ Conbercept组小鼠视网膜各层排列较清晰,视盘周围可见小片状无灌注区,突破内界膜的内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　OIR模型中视网膜DA含量及TH相对表达量均降低;玻璃体内注射Conbercept后,视网膜新生血管及VEGF相对表达量均减少,TH相对表达量、DA含量均进一步降低。     

磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂LY294002对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用

目的　探讨磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/丝氨酸-苏氨酸激酶（Serine/threonine kinase,AKT）信号转导通路抑制剂LY294002对小鼠氧诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy,OIR）的视网膜新生血管（retinal neovascularization,RNV）形成的影响。方法　取C57BL/6J小鼠60只,随机分为实验组和对照组,每组各30只,均制备OIR模型。小鼠出氧箱前1 d即鼠龄11 d时实验组玻璃体内注射0.5 μL的LY294002,对照组玻璃体内注射等体积的PBS。病理切片计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,免疫组织化学和RT-PCR法检测pAKT、VEGF蛋白及mRNA的表达情况。结果　实验组小鼠新生血管内皮细胞核数为（12.53±1.71）个,较对照组（25.31±1.42）个明显减少（P<0.05）;实验组小鼠pAKT、VEGF的蛋白表达呈弱阳性,阳性细胞的吸光度值（9.12±1.35、13.91±1.49）均较对照组（15.11±2.17、19.72±2.61）明显下降（均为P<0.05）;实验组小鼠AKT、VEGF mRNA相对表达量均较对照组明显下降（均为P<0.05）。结论　LY294002通过抑制PI3K/AKT信号转导通路,可有效抑制小鼠OIR的RNV形成,LY294002有望成为防治血管增生性视网膜病变的一种有效方法。     

α-黑素细胞刺激素抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的生成

背景 视网膜新生血管形成(RNV)可发生于多种眼病,导致视网膜出血甚至脱离,抑制病理性RNV已逐渐成为眼科疾病治疗中的重点.α-黑素细胞刺激素(α-MSH)对视网膜发育过程中的生理性血管生成有抑制作用,但其在病理性RNV方面的作用尚未见报道. 目的 以氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠为模型,研究玻璃体腔注射不同质量浓度的α-MSH对病理性RNV的作用. 方法 选取健康清洁级7日龄C57BL/6J幼鼠40只,应用随机数字表法随机分为OIR+0.33μg/μl α-MSH组、OIR+1.67 μ.g/μl α-MSH组、OIR+3.30 μg/μlα-MSH组、OIR组和正常对照组,每组8只.不同剂量α-MSH干预组和OIR组幼鼠在氧体积分数(75±2)％的高氧环境下饲养5d,然后在普通空气环境中饲养5d,正常对照组幼鼠则在普通空气环境中饲养10d.各组取17日龄鼠,球后静脉注射高相对分子质量异硫氰酸葡聚糖(FITC-dextran),制备视网膜铺片,观察视网膜的血管形态,计算无灌注区面积相对于整个视网膜的面积.对小鼠眼球行石蜡切片和苏木精-伊红染色,计数突破内界膜突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数. 结果 视网膜铺片结果显示,正常对照组、OIR组、OIR+O.33 μg/μl α-MSH组、OIR+1.67 μg/μl α-MSH组和OIR+3.30 μg/μl α-MSH组视网膜无灌注区相对面积分别为(0.00±0.00)％、(23.01±3.39)％、(18.14±7.20)％、(15.64±7.07)％和(7.62±6.52)％,各组间视网膜无灌注区相对面积总体比较,差异有统计学意义(F=19.635,P＜0.05);其中OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR+3.30 μg/μl α-MSH组,差异有统计学意义(t=4.293,P＜0.01).组织病理学检查结果显示,正常对照组、OIR组、OIR+0.33 μg/ μl α-MSH组、OIR+ 1.67 μg/μl α-MSH组和OIR+3.30 μg/μl α-MSH组突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数分别为(0.00±0.00)、(11.45±4.26)、(6.35±2.34)、(4.96±1.79)和(1.03±1.25)个.各组突入玻璃体腔的新生血管内皮细胞核数总体比较,差异有统计学意义(F=147.87,P＜0.05);其中OIR组突入玻璃体腔新生血管内皮细胞核数显著高于OIR+0.33μg/μl α-MSH组、OIR+ 1.67 μg/μlα-MSH组和OIR+3.30 μg/μl α-MSH组,差异均有统计学意义(均P＜0.001). 结论 α-MSH可减少OIR小鼠模型视网膜中无灌注区的相对面积和视网膜新生血管核数,其对病理性RNV的抑制作用呈剂量依赖性.     

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。     

CCR7/p-ERK1/2/VEGF signaling promotes retinal neovascularization in a mouse model of oxygen-induced retinopathy

AIM: To investigate the role of CCR7/p-ERK1/2/VEGF signaling in the mouse model of oxygen-induced retinopathy (OIR). METHODS: Neonatal C57BL/6J mice were evenly randomized into four groups: normoxia, OIR, OIR control (treated with scramble siRNA), and OIR treated (treated with CCR7 siRNA). Normoxia group was not specially handled. Postnatal day 7 (P7) mice in the OIR group were exposed to 75%±5% oxygen for 5d (P7-P12) and then maintained under normoxic conditions for 5d (P12-P17). Mice in the OIR control and OIR treated groups were given injections of scramble or CCR7 siRNA plasmid on P12 before returning to normoxic conditions for 5d (P12-P17). Retina samples were collected from all mice on P17, stained with adenosine diphosphatase (ADPase), and retinal neovascularization (RNV) was assessed. Retinas were also stained with hematoxylin and eosin (H&E) for RNV quantitation. The distribution and expression of CCR7, p-ERK1/2 and vascular endothelial growth factor (VEGF) were assessed via immunohistochemistry, Western blot, and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). RESULTS: High oxygen promoted retinal neovascularization (P<0.05) and increased the number of endothelial nuclei in new vessels extending from the retina to the vitreous body; CCR7 promoted this process (P<0.05). CCR7 and VEGF mRNA were expressed at higher levels in the OIR and OIR control groups than in the normoxia and OIR treated groups. CCR7, p-ERK1/2, and VEGF protein were expressed in the retinas of mice in the OIR and OIR control groups. Intravitreal injection of CCR7 siRNA significantly reduced CCR7, p-ERK1/2, and VEGF expression in the OIR mouse model (all P<0.05). CCR7 significantly enhanced the neovascularization and non-perfusion areas in the OIR group (P<0.05). CCR7 siRNA significantly reduced levels of p-ERK1/2 and VEGF as compared to OIR controls (P<0.05). CONCLUSION: These results suggest that CCR7/p-ERK 1/2/VEGF signaling plays an important role in OIR. CCR7 may be a potential target for the prevention and treatment of retinopathy of prematurity.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

川芎嗪对氧诱导视网膜病变中视网膜神经细胞凋亡的抑制作用

目的 观察川芎嗪(TMP)对氧诱导视网膜病变(OIR)中视网膜神经细胞凋亡的抑制作用.方法 48只C57BL/6新生幼鼠随机分为正常对照组、OIR对照组及OIR药物组,分别为18、18、12只.正常对照组在正常空气环境中饲养.OIR对照组、OIR药物组幼鼠于出生后7 d置于含氧体积分数(75±3)%的氧气箱中连续生活5 d;出生后12 d,幼鼠回到正常空气环境中饲养,建立OIR模型.出生后12～16d,OIR药物组按200 mg/kg的剂量腹腔注射TMP,1次/d;正常对照组、OIR对照组同时注射相同体积的含0.1%二甲基亚砜(DMSO)的生理盐水.出生后12、14、17 d,摘除幼鼠眼球作石蜡切片并行苏木精-伊红(HE)和脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记(TUNEL)染色.观察视网膜无灌注区形态学变化,检测视网膜神经细胞凋亡数量.结果 正常对照组幼鼠视网膜各层结构清晰.出生后12 d,OIR对照组幼鼠视网膜内核层(INL)可见少量染色质凝聚的细胞核.出生后14 d,OIR对照组幼鼠视网膜INL可见大量染色质凝聚的细胞核,OIR药物组幼鼠视网膜INL均可见少量染色质凝聚的细胞核.出生后17 d,OIR对照组幼鼠视网膜INL、内丛状层(IPL)和外丛状层(OPL)厚度变薄;OIR药物组幼鼠视网膜中周部INL、IPL和OPL厚度较正常对照组薄,较OIR对照组厚.出生后12 d,OIR对照组幼鼠视网膜TUNEL阳性细胞数量为正常对照组的6倍,差异有统计学意义(t=9.432,P＜0.001).出生后14 d,3组幼鼠视网膜TUNEL阳性细胞数量比较,差异有统计学意义(F=587.217,P＜0.001);OIR对照组幼鼠视网膜TUNEL阳性细胞数量为正常对照组的28倍,差异有统计学意义(t=49.813,P＜0.001);OIR药物组幼鼠视网膜TUNEL阳性细胞数量较OIR对照组减少了82.3%,差异有统计学意义(t=42.434,P＜0.001).出生后17 d,3组幼鼠视网膜TUNEL阳性细胞数量比较,差异无统计学意义(F=587.217,P>0.05).结论 TMP能明显抑制OIR中视网膜神经细胞凋亡.

Abstract：

Objective To observe the inhibitory effect of tetramethylpyrazine(TMP)on apoptosis of retinal neurons in oxygen-induced retinopathy(OIR).Methods 48 C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group(n=18),OIR control group(n=18)and OIR TMP group(n=12).The mice of normal control group were raised in room air.From the postnatal day 7(P7),mice of the other two groups mice of OIR TMP group received intraperitoneal injection of TMP(200 mg/kg)once a day from P12 to P16.meanwhile the mice of normal control group and OIR control group were iniected with the same volume of normal saline containing of 0.1% DMSO.At P12,P14 and P17,the morphologic changes in retinal avascular zone and the number of retinal apoptotic cell were observed by HE staining and TUNEL assay.Results At P1 2.there were a few of chromatin condensation and pycnic nuclei in the inner nuclear layer (INL)of OIR control group.At P14,a great quantity(OIR control group)or some(OID TMP treated group)chromatin condensation and pycnic nuclei in the central INL were observed.At P17,the thickness of INL,inner plexiform layer(IPL)and outer plexiform layer(OPL)in the OIR control group were reduced;the thickness of INL,IPL and OPL in the OIR TMP group weas thinner than those in the normal control group and thicker than those in the OIR control group.At P12,the TUNEL-positive cells in the OIR control group was 6 times of the normal eontrol group(F=587.217,P＜0.001).At P14,the difference of TUNEL-positive cells in three groups was significant(F=587.217,P＜0.001);the TUNEL-positive cells in the OIR control group was 28 times of the normal control group(t=49.813,P＜0.001);the TUNEL-positive cells in the OIR TMP group has reduced 50% compared with the OIR controI group(t=42.434,P＜0.00 1).At P17,there was no significant difference in TUNEL-positive cells among the three groups (F=587.217,P>0.05).Conclusions TMP can inhibit apoptosis of retinal cells in OIR significantly.