脐血巨核祖细胞的体外扩增

目的联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)和肝素用脐血CD34 细胞定向扩增巨核祖细胞.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34 细胞,用TPO、IL-11和肝素定向扩增巨核祖细胞,巨核祖细胞集落分析(CFU-MK)测定巨核祖细胞扩增倍数,流式细胞术检测巨核祖细胞分化过程中不同细胞组群(CD34 、CD41a 、CD61 、CD34 CD41a 和CD41a CD61 )的变化,免疫组织化学染色(CD41a)和透射电镜观察巨核细胞形态及超微结构,血小板体外活化实验及非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞功能.结果单用TPO 7 d时,CD34 CD41a 细胞扩增(4.0±1.7)倍;与IL-11联用后扩增到(10.5±4.8)倍;再加入肝素后扩增达(29.9±6.4)倍,TPO IL-11 肝素组扩增倍数为TPO组、TPO IL-11组的7.5、2.85倍,与两组相比差异均有显著性(P＜0.05).TPO IL-11 肝素组巨核祖细胞中大集落(＞50个细胞/集落)达(106.8±26.9)倍,较TPO、TPO IL-11组均有明显增加(P＜0.05).将扩增第7天的巨核细胞静脉输注于经放射预处理的非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠,可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率.电镜显示扩增的巨核细胞有一定的界膜发育等成熟特征,体外血小板活化实验证实,扩增的巨核细胞在体外可产生血小板,有正常巨核细胞功能.结论TPO、IL-11和肝素组合的培养体系可有效扩增脐血巨核祖细胞.     

血小板生成素促进HEL细胞增殖及其c-Mpl的表达

目的 研究血小板生成素(thrombopoietin，TPO)对巨核细胞系-HEL细胞的增殖及其e-Mpl受体表达的影响。方法 ①细胞集落计数法研究TPO对HEL细胞增殖的影响；②间接免疫荧光方法及流式细胞术检测TPO刺激后，HEL细胞TPO受体e-Mpl的表达。结果 ①TPO可促进HEL细胞集落的形成；②TPO上调HEL细胞e-Mpl膜蛋白的表达。结论 TPO促进HEL细胞的增殖，其部分机制可能是通过上调TPO受体e-Mpl的表达来实现。     

重组人瘦素对慢性特发性血小板减少性紫癜患者骨髓巨核细胞的影响

目的：探讨瘦素对 CITP 骨髓巨核细胞的影响。方法以急性巨核细胞白血病细胞株 M07e 和 CITP 骨髓 CD34＋细胞经诱导分化的巨核细胞为研究对象。运用 RT-PCR 检测 M07e 细胞瘦素受体 mRNA 表达,运用 Brdu-ELISA 法检测瘦素对 M07e 细胞的增殖作用,运用 Annexin V/ PI 双标流式检测瘦素对 M07e 细胞的凋亡作用。经TPO、SCF 诱导磁珠分选后获得的 CITP 骨髓 CD34＋细胞分化为巨核细胞,运用流式测定瘦素对其分化过程中CD41a ＋、CD61＋的表达以及 CD41a ＋细胞的凋亡是否有影响。结果瘦素受体长型 Ob-RL 和短型 Ob-RS 在 M07e细胞均有 mRNA 表达。瘦素对 M07e 细胞的增殖有促进作用,并呈现一定的剂量依赖性,浓度为5 ng/ ml 即显示出促增殖效应（P =0.037）,但浓度在5、10、25 ng/ ml 之间无明显统计学差异,浓度为100 ng/ ml 时其增殖效应最大。在时间依赖效应上,瘦素作用48 h,其细胞增殖明显高于24 h,而作用72 h 其细胞增殖介于两者之间（P =0.000）。瘦素对 M07e 细胞具有抑制凋亡作用（P =0.001）,而且在作用72小时后凋亡率最高。瘦素对骨髓 CD34＋细胞分化为巨核细胞过程中 CD41a ＋、CD61＋表达的影响,与不加瘦素组相比无明显统计学差异（P ＞0.05）。对 CD41a ＋细胞凋亡的影响与不加瘦素组相比亦无明显统计学差异（P ＞0.05）。结论瘦素通过促进 M07e 细胞的增殖,抑制其凋亡来参与巨核细胞白血病的发生、发展。瘦素在 TPO ＋ SCF 诱导 CITP 骨髓巨核细胞分化中无明显协同作用,对分化产生 CD41a ＋巨核细胞的凋亡亦无明显作用。     

脐血CD34+细胞向巨核细胞的分化扩增及基因的表达变化

目的研究脐血CD34+细胞向巨核细胞的诱导分化及体外扩增,并观察此过程中巨核细胞特异性基因表达的变化。方法免疫磁珠法分离获得CD34+细胞培养在无血清无基质培养基中,采用TPO+SCF+IL 3+IL 6、 TPO+SCF+IL 3、 TPO+SCF三种不同因子组合对其诱导分化及扩增。收集3、7、10、14?d的扩增产物,运用荧光显微镜检测巨核细胞的表面标志;流式细胞术（FCM）检测巨核细胞的凋亡;对巨核细胞进行DNA含量检测以及荧光定量PCR检测特异性基因表达的变化。结果分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增,随培养时间的延长,CD34+/CD41+细胞数第7天达最高值,之后逐渐下降;而CD41+、CD42b+、CD61+细胞随培养时间的延长表达量逐渐增高。DNA含量检测发现,随着培养天数的增加,多倍体细胞所占的百分比增加。三种因子组合中TPO+SCF+IL 3+IL 6组扩增效率最高。荧光定量PCR显示转录因子GATA 1、NF E2、TXS、GPIIb和HPRT在第7天表达量最高,之后下降。凋亡转录因子APAF 1随培养天数的延长表达量增加。结论脐血CD34+细胞在体外可向巨核细胞诱导分化及扩增,其基因表达的变化也支持这一结论。     

GM-CSF体外促进多倍体巨核细胞的生成

在TPO IL-3的细胞因子组合中添加不同浓度GM-CSF，从脐血CD34^ 细胞定向诱导巨核细胞的形成，以此考察GM-CSF对巨核细胞体外扩增和成熟的作用。比较了TPO IL-3、TPO IL-3 GM-CSF(5、20、100μg／L)的4种细胞因子组合对巨核细胞扩增及形成多倍体的作用。结果发现：在TPO IL-3的细胞因子组合中添加GM-CSF有利于总细胞的扩增，对巨核细胞的纯度没有显著的影响。体外培养14d后，培养物巨核细胞中多倍体(≥8N)巨核细胞比例明显提高，从中可以看出GM-CSF能促进巨核细胞多倍体的形成。     

血小板生成素和白细胞介素-11对慢性特发性血小板减少性紫癜巨核细胞的影响

目的　探讨重组人血小板生成素 (rh TPO)及联用重组人白细胞介素 - 11(rh IL - 11)对慢性特发性血小板减少性紫瘢 (CITP)患者骨髓巨核祖细胞增殖和成熟的影响。方法　采用血浆凝块法对 2 1例 CITP患者骨髓巨核祖细胞进行体外培养 ,培养体系中加入不同浓度的 rh TPO,或同时加 rh IL - 11两者联用。培养 14天后经 SZ-2 1(GP a)单抗和 ABC试剂盒染色观察集落生长数 ,用 MCDS- 2 0 10型超清晰度骨髓细胞分析系统进行巨核细胞的面积和直径测定。结果　 CITP组骨髓巨核细胞面积及直径明显低于对照组 (P<0 .0 5 )。 rh TPO对 CITP患者的巨核细胞集落形成单位 (CFU - MK)总集落数、巨核细胞直径与面积均有促进作用 ,但无浓度依赖性。体外最适浓度为 10 ng/ ml;rh TPO与 rh IL - 11联用组较单用组的 CFU - MK、总集落数及面积、直径均显著增加。结论　 CITP患者骨髓巨核细胞存在成熟障碍 ,体外 rh TPO单用及与 rh IL - 11联用均可促进 CITP患者巨核祖细胞的增殖与成熟 ,其联用较单用促进作用更强     

条件培养液对脐血CD_(34)~+细胞扩增效应的实验研究

目的探讨并分析不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法利用 4种条件培养液 (胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞 )对脐血CD+ 34 细胞进行 2周的体外扩增 ,并和三细胞因子组合 :干细胞因子 (stemcellfactor ,SCF)、血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)、flt 3配基 (flt 3ligand ,FL) ,对脐血CD+ 3 4 细胞扩增结果进行了比较 ;利用ELISA方法检测 4种条件培养液中细胞因子 [白细胞介素 1(interleukin 1,IL 1)、白细胞介素 6 (interleukin 6 ,IL 6 )、FL、TPO]的浓度。结果脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD+ 3 4 细胞均有明显的扩增效应 ,脐血组优于细胞因子组合 ;4种条件培养液中 ,脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD+ 34 细胞有效而廉价的扩增剂 ;细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞体外扩增结果差异的主要因素     

脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究

目的研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.     

脐带血CD34+细胞体外诱导成为血管内皮细胞的观察

目的研究脐带血CD34^＋细胞在体外适宜的细胞因子作用下，不仅能够大量增殖分化为各系造血细胞，而且还可以向血管内皮细胞增殖分化的特性。方法采用CSF、FLT-3、TPO、IL-3、G-CSF细胞因子在无血清体系中进行不同的组合，分别在1、2周检测增殖后造血细胞的各项指标，同时用半固体培养研究造血细胞集落形成能力。2周后去除所有非贴壁细胞，更换含小牛血清和血管内皮细胞生长因子的培养基继续培养。分别于4、8周后收集液体培养和半固体培养后的贴壁细胞，检测细胞表面标志。结果CD34^＋细胞在适宜条件下，大量地向造血细胞及内皮细胞增殖分化，分别表达各系细胞分化抗原。结论脐带血CD34^＋细胞在体外可以被扩增、诱导分化为血管内皮细胞。     

条件培养液对脐血CD34^＋细胞扩增效应的实验研究

目的：探讨并分析不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法：利用4种条件培养液（胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞）对脐血CD34^ 细胞进行2周的体外扩增，并和三细胞因子组合：干细胞因子（stem cell factor,SCF)，血小板生成素（thrombopoietin,TPO),flt-3配基（flt-3 ligand,FL)，对脐血CD34^ 细胞扩增结果进行了比较；利用ELISA方法检测4种条件培养液中细胞因子[白细胞介素－1（interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、FL、TPO]的浓度。结果：脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD34^ 细胞均有明显的扩增效应，脐血组优于细胞因子组合；4种条件培养液中，脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论：脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD34^ 细胞有效而廉价的扩增剂；细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞体外扩增结果差异的主要因素。     

抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化和成熟过程中的作用

目的 研究抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化和成熟过程中的作用。方法采用PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化,RNA干扰阻断Bcl-xL在K562细胞向巨核细胞诱导分化中的表达,RT-PCR和流式细胞仪技术检测其改变。采用免疫磁珠从正常骨髓中富集CD34＋细胞,在无血清培养下用TPO诱导其向巨核细胞分化,免疫组织化学和流式细胞仪技术观察分化过程中Bcl-xL的表达改变。结果 PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化24h后,CD61＋细胞百分比迅速增加,并且在72h内维持较高的阳性率;用siBcl-xL干扰后72h内,CD61＋细胞百分比只有轻度增加,同时RT-PCR检测显示24h后Bcl-xLmRNA表达显著减少,流式细胞检测显示Bcl-xL蛋白的表达也相应降低。正常骨髓中CD34＋细胞经TPO诱导后,在培养5—20d间Bcl-xL蛋白表达阴性的巨核细胞随着培养时间延长逐渐增多,免疫组织化学检测显示未成熟的巨核细胞Bcl-xL蛋白表达呈强阳性,而在成熟的巨核细胞中表达为阴性。结论抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化过程中发挥重要作用,而在巨核细胞发育晚期Bcl-xL蛋白的表达下调可能是巨核细胞成熟的关键,并与成熟巨核细胞的特殊凋亡发生密切相关。     

Effects of Panaxadiol Saponins Component as A New Chinese Patent Medicine on Proliferation, Differentiation and Corresponding Gene Expression Profile of Megakaryocytes

Objective:To investigate the effects of panaxadiol saponins component(PDS-C) isolated from total saponins of panax ginseng on proliferation,differentiation and corresponding gene expression profile of megakaryocytes.Methods:Bone marrow culture of colony forming assay of megakaryocytic progenitor cells(CFU-MK) was observed for the promoting proliferation mediated by PDS-C,and differentiation of megakaryocytic blasts caused by PDS-C was analyzed with flow cytometry in CHRF-288 and Meg-01 cells,as well as proliferation,differentiation-related genes expression profile and protein expression levels were detected by human gene expression microarray and western blot.Results:In response to PDS-C 10,20 and 50 mg/L,CFU-MK from 10 human bone marrow samples was increased by 28.9%±2.7%,41.0%±3.2%and 40.5%±2.6%over untreated control,respectively(P0.01,each).Flow cytometry analysis showed that PDS-C treated CHRF-288 cells and Meg-01 cells significantly increased in CD42 b,CD41,TSP and CD36 positive ratio,respectively.PDS-C induced29 genes up-regulated more than two-fold commonly in both cells detected by human expression microarray representing 4000 known genes.The protein expression levels of ZNF91,c-Fos,BTF3 a,GATA-1,RGS2,NDRG2 and RUNX1 were increased with western blot in correspond to microarray results.Conclusion:PDS-C as an effective component for hematopoiesis,play the role to enhance proliferation and differentiation of megakaryocytes,also up-regulated expression of proliferation,differentiation-related genes and proteins in vitro.     

B7-CD28共刺激途径与慢性血小板减少性紫癜关系的探讨

目的　探讨B7 CD2 8共刺激途径与慢性血小板减少性紫癜 (CITP)发病的关系。方法　①应用流式细胞术 ,检测CITP的CD80 /CD2 8的表达水平 ;②通过巨核细胞体外培养观察CITP的巨核细胞生长和成熟 ,并观察CD80单抗对其的影响。结果　①CD80在CITP的B淋巴细胞有较高表达率 ,与对照组比较 (P <0 0 1) ,与SLE比较 (P >0 0 5 )。CITP的CD2 8表达与对照组比较 (P >0 0 5 ) ;②CITP各种集落数均低于对照组 (P <0 0 5 ) ,加入CD80单抗的CITP的巨核细胞集落生成数明显增多 (P <0 0 5 )。结论　CD80在CITP的表达增高及CD80单抗对CITP巨核祖细胞增殖能力的影响 ,均提示协同刺激因子异常可能与CITP发病有关。     

再生障碍性贫血患者血清抑制CFU-MK的增殖及调控

目的:探讨再生障碍性贫血(再障)患者血小板减少的原因,建立模型并寻找治疗对策。方法:应用甲基纤维素半固体体外培养法建立CFU-MK培养体系;混合再障血清进行培养建立再障患者血小板减少的模型;使用不同的造血细胞生长因子进行组合观察模型中CFU-MK集落生成情况和集落中巨核祖细胞的含量。结果:经过14d的培养,模型组CFU-MK集落、集簇数量明显低于正常对照组,以TPO/IL-3/IL-11/FL细胞因子组合使模型组CFU-MK的数量恢复及巨核细胞的扩增效果最好。结论:本实验建立了CFU-MK体外培养体系及再障血小板减少的模型,体外试验表明治疗再障血小板减少以TPO/IL-3/IL-11/FL为最佳组合。     

比较卡铂对乳腺癌细胞及血小板生成素作用下巨核细胞的影响

目的 研究化疗药物卡铂对乳腺癌细胞和使用血小板生成素(thrombopoietin,TPO) 的巨核细胞(MO7e) 的影响.方法 MTT 法测定不同浓度的TPO 对巨核细胞株MO7e 作用24h、48h、72h 的影响,作出增殖曲线.测定不同浓度卡铂对乳腺癌MDA-MB-453 细胞和使用TPO 的MO7e 细胞作用24h、48h 的抑制率,求出半数抑制浓度(IC50),比较两者的IC50.结果 MO7e 细胞增殖率随TPO 浓度增大而增大,TPO 浓度为256ng/ml 时进入平台期.卡铂对MO7e 细胞的IC50 约为对乳腺癌细胞IC50 的10 倍.结论 TPO 可促进巨核细胞增殖,卡铂对乳腺癌细胞的抑制作用明显高于对使用TPO 的巨核细胞的抑制作用.     

地榆总皂苷促造血细胞增殖效应研究

目的 观察地榆总皂苷对3种造血细胞Baf3/Mpl、UT-7和NSF-60的促增殖效应。方法 分别培养依赖血小板生成素（TPO）、红细胞生成素（EPO）和粒细胞集落生长因子（G-CSF）生长的Baf3/Mpl、UT-7和NSF-60细胞,在加或不加细胞因子条件下,用不同质量浓度地榆总皂苷处理细胞72 h后,采用MTT法检测3种细胞的增殖;采用RT-PCR法检测3种细胞因子受体表达水平的变化。结果 地榆总皂苷单独处理细胞72 h,明显促进Baf3/Mpl细胞和NSF-60细胞增殖,但不影响UT-7细胞生长;在TPO和G-CSF存在条件下,地榆总皂苷能分别增强两种细胞因子的促细胞增殖作用。此外,地榆总皂苷能明显增强Baf3/Mpl细胞TPO受体表达,对NSF-60细胞G-CSF受体表达没有影响。结论 地榆总皂苷具有单独或协同细胞因子的促造血细胞增殖作用,其促增殖作用与上调TPO受体的表达有关。     

L203对大鼠巨核细胞培养的影响

目的了解TPO模拟肽L203对骨髓抑制后大鼠的促血小板生成作用及对大鼠巨核细胞分化、增殖的影响.方法应用化疗药物卡铂造成大鼠骨髓抑制模型血小板下降到接近零时,开始应用L203、IL-3、IL-11、生理盐水腹腔注射,隔天1次,共用7次.血小板回升后全部动物活杀,然后分离提取大鼠股骨髓有核细胞,分别采用甲基纤维素法及琼脂法进行巨核细胞培养与诱导分化实验.结果L203组巨核细胞集落数明显多于其它组,几组在统计学上差别明显著(P＜0.01).结论L203具有类似TPO的促进巨核细胞增殖分化、增加血小板产生的作用.     

血小板生成素的研究新进展

血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是血小板产生过程中关键性的调节因子，又称巨核细胞生长衍生因子。TPO可与巨核细胞上的表面受体c-Mpl结合，然后再通过多种信号通路来活化巨核细胞，促使巨核细胞发生增殖和分化从而产生血小板，继而达到提高循环中血小板水平的目的。目前，国内外已经对TPO进行了分离和克隆，并对它的蛋白结构、表达调控、生物学活性及其在临床疾病中的治疗效果进行了大量研究。这些研究揭示了TPO的新来源及其与红细胞生成素(erythropoietin，EPO)结构的异同点、TPO在体内浓度的维持机制、各代TPO药物的优缺点；同时也报道了TPO不仅在常见的血小板减少性疾病中具有良好治疗效果，对除外血液系统的其他器官或细胞也有积极的保护作用，如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、肝硬化等疾病。这一系列的研究进展发对于TPO的临床应用具有重要的指导意义，本文就上述最新进展作一综述。