软骨脱细胞基质-Ⅱ型胶原纳米支架复合BMSC修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的 观察软骨脱细胞基质(Cartilage acellular extracellular matrix,CAEM)-Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,COLⅡ)纳米支架,复合骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)修复兔关节软骨缺损的效果。方法 CAEM和COLⅡ按质量比1∶1混合,通过静电纺丝技术制备组织工程纳米支架。将第二代BMSCs种植到该支架上,培养箱内静置2 h。12只日本大耳白兔随机分为实验组和对照组,将细胞支架复合物植入实验组兔膝关节软骨缺损处,对照组仅行膝关节软骨缺损建模。12周后实验动物取材,大体观察修复效果,并行HE染色、Ⅱ型胶原染色观察。结果 大体观察见实验组软骨缺损修复良好,对照组软骨缺损处由肉芽样组织充填。HE染色显示,实验组关节软骨缺损处可见软骨陷窝形成,对照组关节软骨缺损处仅有纤维组织充填。实验组修复区Ⅱ型胶原染色为阳性,对照组为阴性。结论 CAEM-COLⅡ纳米支架复合BMSC,对兔关节软骨缺损具有较好的修复能力,具有潜在的临床应用价值。     

利用脂肪干细胞构建软骨修复兔膝关节软骨缺损的初步研究

目的 利用兔同种异体软骨脱细胞基质支架和脂肪干细胞体外构建组织工程软骨,探讨其修复关节软骨损伤的可行性.方法 将新西兰大白兔的脂肪干细胞与软骨脱细胞基质支架复合,于软骨细胞方向诱导培养基中培养两周,构建组织工程软骨.兔24只随机分为A、B、C 3组, A组关节软骨缺损处置入经诱导的脂肪源干细胞复合软骨基质支架, B组缺损处只置入软骨基质支架, C组软骨缺损处不做任何处理.分别于术后第12周处死动物,修复处行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化染色和透射电镜检测.结果 A组软骨缺损处被类软骨组织填充,修复区表面光滑;Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色阳性;电镜下可见软骨陷窝内有细胞结构存在,且有大量均匀颗粒状细胞分泌基质成分存在,细胞周围大量胶原纤维.B组软骨缺损处为纤维组织状物填充,C组软骨缺损处无修复组织填充.结论 脂肪干细胞与软骨脱细胞基质复合并向软骨诱导后可良好地修复关节软骨缺损,具有替代正常软骨的潜力.     

自体骨髓基质干细胞辅助Mosaicplasty技术促进骨软骨缺损修复整合

目的探讨以基于骨髓基质干细胞(BMSCs)的组织工程技术与自体骨软骨柱镶嵌移植术(Mosaicplasty)相结合的方法修复骨软骨及促进缺损间隙的整合效果。方法12只中国山羊于术前2周抽取骨髓,体外培养自体BMSCs。术中以自制器械分别制造山羊双后肢股骨内髁负重区直径5 mm、深3 mm的复合骨软骨缺损各一处。在Mosaicplasty技术填充缺损后,即以动物自体BMSCs与透明质酸凝胶相复合,注射填充于左后肢骨软骨柱之间及与周围组织的间隙内,右后肢单纯自体骨软骨柱移植作为对照组。术后第4、8、16周分别取材进行组织学、组织化学及蛋白聚糖含量等检测。比较16周时两组的缺损区惨复软骨组织与正常软骨的蛋白聚糖含量。结果两组自体骨软骨柱移植软骨均以透明软骨存活,与周围正常软骨间无明显差异。实验组骨软骨柱的间隙内可见新生软骨修复,组织学表现与周围正常软骨相同。交界区整合良好,间隙消失;对照组各时间点软骨间的间隙为纤维组织或纤维软骨填充,仍有间隙存留。移植软骨的基质、实验组骨软骨柱间隙内的新生软骨基质及Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性。蛋白聚糖含量比较显示,对照组骨软骨柱间隙内新生组织的蛋白聚糖含量均低于正常软骨和实验组,差异有显著性意义(P< 0．05)。结论基于BMSCs的组织工程技术结合Mosaicplasty技术,可以有效地促进骨软骨缺损间隙的整合,改善修复效果好,有望成为一种理想的促进骨软骨缺损修复的方法。     

温敏性壳聚糖水凝胶支架联合骨髓间充质干细胞治疗兔膝关节软骨缺损

目的 制备壳聚糖/Ⅱ型胶原/聚乳酸复合水凝胶支架,以支架为骨髓间充质干细胞载体,评价修复兔膝关节软骨缺损的可行性.方法 将壳聚糖、Ⅱ型胶原、聚乳酸联合β-甘油磷酸钠盐制备复合水凝胶,检测凝胶形成时间、弹性模量及细胞相容性;制作新西兰兔关节软骨缺损模型,分为四组.空白组:正常软骨,未作任何处理;模型组:旷置骨软骨缺损作为...     

骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研究以多聚乙醇酸(PGA)为支架的骨髓基质干细胞(BMSCs)复合物修复兔膝关节软骨缺损的情况。方法体外培养扩增的自体BMSCs种植于PGA支架并培养72h,然后将支架-细胞复合物植入兔关节软骨缺损模型。术后12周处死动物,标本行大体观察、组织学检查及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果BMSCs-PGA复合物植入后形成丰富的透明软骨样修复组织,新生软骨无明显退变。对照组主要为纤维组织及软骨下骨修复。结论BMSCs-PGA复合物可修复关节软骨缺损。     

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。     

骨软骨复合体修复软骨及软骨下骨缺损

目的探讨以诱导的兔骨髓基质细胞与双层PLGA支架构建组织工程骨软骨复合体,修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺损的方法及结果。方法健康新西兰兔28只,分为三组。A组为常规培养MSCs(10只),B组为诱导培养MSCs(10只),C组为自体骨软骨块移植(8只)。密度梯度离心法获得骨髓基质干细胞(marrow-derivedstromalcells,MSCs),分别使用常规培养液和成软骨诱导条件培养液进行体外扩增传代。提取MSCs及关节软骨细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。扫描电镜观察MSCs在PLGA双层支架上的复合与分布情况。A、B组MSCs分别与PLGA双层支架构建直径3.5mm、高3.0mm的骨软骨复合体,植入股骨髁髌骨滑车同比例骨软骨缺损区,术后第4、8、16、24周取材,进行大体观察、组织学检查和评分。结果RT-PCR见常规培养MSCs表达Ⅰ型胶原,无Ⅱ型胶原表达;诱导后MSCs表达Ⅰ、Ⅱ型胶原。扫描电镜观察MSCs在PLGA支架黏附生长良好,孔隙深处可见细胞分布。B组标本术后24周大体观察与正常软骨无明显差别,组织学检查为成熟的类透明软骨组织(4/6),优于A组(1/4)。结论MSCs具有成骨和成软骨潜能,可在基于细胞的软骨修复中作为种子细胞与双层PLGA构建组织工程骨软骨复合体,该复合体在实验动物模型中可修复关节软骨和软骨下骨缺损。     

骨髓基质细胞体外增殖后移植修复关节软骨缺损的实验研究

目的 :用组织工程的方法将骨髓基质细胞体外培养增殖后植入软骨缺损 ,观察关节软骨缺损的修复效果。方法 :抽取兔骨髓基质细胞体外培养增殖后 ,将其与Ⅱ型胶原凝胶相结合 ,植入到兔膝关节实验性关节软骨缺损中 ,对照组的缺损分别置入与髓腔血混合的Ⅱ型胶原凝胶、单纯Ⅱ型胶原凝胶或不作任何处理 ,术后 4、8、12周取材观察及组织学检查。结果 :术后 4周 ,实验组的缺损由透明样软骨样组织充填 ,术后 12周 ,软骨及软骨下骨组织基本修复 ;在对照组缺损 ,软骨下骨在术后 12周亦基本修复 ,但表层软骨主要由纤维组织修复。结论 :骨髓基质细胞来源丰富 ,采集方便 ,经体外培养增殖后 ,足量的未分化细胞与Ⅱ型胶原凝胶载体相结合 ,修复关节软骨缺损的效果较好。     

Ⅰ型胶原负载骨髓基质细胞修复兔膝关节软骨缺损

目的探讨同种异体骨髓基质细胞(MSCs)-Ⅰ型胶原复合移植修复关节软骨缺损的疗效。方法构建Ⅰ型胶原支架,将体外培养的兔MSCs吸附于该支架上培养,检测支架对MSCs的吸附及增殖的影响,再移植于兔膝关节全层软骨缺损处,分批取材,进行大体、组织学观察。结果MSCs在Ⅰ型胶原支架内贴附良好,分泌胞外基质,MSCs-胶原复合移植组软骨缺损处在术后12周为透明软骨样修复,空白对照组为纤维瘢痕样修复。结论Ⅰ型胶原支架与MSCs相容性良好,MSCs-胶原复合移植可达到透明软骨样修复软骨缺损。     

补肾行气活血法在骨髓基质干细胞诱导软骨细胞修复兔关节软骨缺损中的作用

[目的]探讨补肾行气活血法在骨髓基质于细胞诱导软骨细胞修复兔关节软骨缺损中的作用. [方法]将胶原凝胶包埋的骨炎定含药血清培养的骨髓基质干细胞诱导的软骨细胞和异体软骨细胞接种CPPf/PLLA支架构建的复合物体外培养3周,行倒置显微镜和扫描电镜观察,并将复合物异体移植入兔关节软骨缺损,术后4、8、12周取材,从大体、组织学和Ⅱ型胶原免疫组织化学分别对再生软骨组织进行评价. [结果]诱导软骨细胞组在支架内分布均匀、透明软骨样组织的形成、表面光滑度、与周围组织整合程度及基质内有Ⅱ型胶原分布等方面明显优于软骨细胞组. [结论]补肾行气活血法在关节软骨缺损修复的作用中较传统的方法有其优越性.     

Uninduced adipose-derived stem cells repair the defect of full-thickness hyaline cartilage

Objective: To testify the effect of the stem cells derived from the widely distributed fat tissue on repairing full-thickness hyaline cartilage defects.Methods: Adipose-derived stem cells (ADSCs) were derived from adipose tissue and cultured in vitro.Twentyseven New Zealand white rabbits were divided into three groups randomly.The cultured ADSCs mixed with calcium alginate gel were used to fill the full-thickness hyaline cartilage defects created at the patellafemoral joint,and the defects repaired with gel or without treatment served as control groups.After 4,8 and 12 weeks,the reconstructed tissue was evaluated macroscopically and microscopically.Histological analysis and qualitative scoring were also performed to detect the outcome.Results: Full thickness hyaline cartilage defects were repaired completely with ADSCs-derived dssue.The result was better in ADSCs group than the control ones.The microstructure of reconstructed tissue with ADSCs was similar to that of hvaline cartilage and contained more cells and regular matrix fibers,being better than other groups.Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy.Statistical analysis revealed a significant difference in comparison with other groups at each time point(t=4.360,P＜0.01).Conclusion: Thcse results indicate that stem cells derived from mature adipose without induction possess the ability to repair cartilage defects     

非诱导脂肪源性干细胞对修复全层透明软骨创伤的可行性研究

目的探讨源自分布广泛的脂肪组织的干细胞的体内分化潜能及非诱导修复全层透明软骨缺损的效果。方法体外切取脂肪组织并分离培养脂肪源性干细胞（ADSCs）。随机将36只新西兰大白兔分为三组,混合有藻酸钙凝胶的ADSCs用来填充髌股关节的全层透明软骨损伤,凝胶修复或未做治疗组作为对照组。4周和12周后对重建组织进行大体和光镜、电镜下观察,组织学分析和定量计分也用于检测结果。结果ADSCs重建的组织白色质韧,完全充填缺损处,表面光整与周围软骨连接,修复组织的微观结构与软骨相似,含有更多的细胞和规则的基质纤维,基质有甲苯胺蓝异染性,优于其他各组。透射电镜可见大量胶原纤维环绕细胞周围。凝胶组和对照组修复组织为薄层纤维组织。修复效果评分的统计分析显示实验组在各时问点上与其他组相比有统计学差异（P〈0.01。结论这些结果表明源自成熟脂肪而未经诱导的干细胞拥有修复软骨创伤的能力,组织显示为透明样,产生生物学可行性结果。     

脱细胞软骨支架材料修复兔关节软骨缺损

目的 观察异种异体脱细胞软骨支架材料(ACM)复合同种异体兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果.方法 (1)密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSCs,选择第3代BMSCs作为种子细胞;(2)利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;(3)3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4 mm,深3 mm砌关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,Ⅰ ACM-BMSCs组:第3代BMSCs 1×106个/ml与ACM于37℃5%CO2饱和湿度复合48 h;Ⅱ ACM组;Ⅲ空白对照组.(4)移植6、12周后大体及组织学观察,免疫组织化学染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果.结果 (1)大体观察及组织学观察:6和12周Ⅰ组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨.Ⅱ组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞.Ⅲ组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;(2)Wakitani组织学评分可见在不同的时间段I组和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组间组织学评分差异无统计学意义(P>0.05).(3)免疫组织化学:ACM-BMSCs组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性.结论 以ACM为支架材料,同种异体BMSCs为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织.     

自体骨髓间充质干细胞藻酸钙载体复合物对兔膝关节软骨缺损修复影响的实验研究

目的：软骨组织多处于人体骨骼的重要部位,其缺损修复一直为临床急待解决的难题,用组织工程方法修复关节软骨缺损是近年来正在研究的新途径。其中绝大多数研究几乎均着重体外培养条件的研究[1,2],而忽略了对于改善局部微环境的探讨,为此,本实验试图在载体复合物植入软骨缺损微环境内时,增加能促进MSCs分裂、增殖、分化及血管新生的bFGF及参与和活跃成软骨细胞合成软骨基质及纤维的维生素C等,从而达到提高软骨缺损修复疗效的目的。方法从24只3月龄新西兰大耳白兔髂骨处抽取骨髓,以密度梯度离心法分离出骨髓间充质干细胞（MSCs）作为种子细胞进行扩增培养至第三代,制成细胞悬液,而后在自制模具中与藻酸钙制备成与兔膝关节软骨全层缺损（直径4mm、深度4mm）相一致的载体复合物同时加入bFGF和维生素C,将该载体复合物植入兔左膝关节软骨全层缺损处作为A组,而右膝关节的关节软骨全层缺损处则植入MSCs与藻酸钙的载体复合物作为B组。另取兔6只,左膝按上述方法作一缺损植入单纯藻酸钙载体作为C组;右膝缺损则作空白对照D组。待术后不同时间点（30 d,60 d及90 d）取材,常规石蜡包埋后制成切片,分别用于HE、Masson、番红O、透射电镜、免疫组化等指标以观察软骨缺损修复效果。结果 A,B,C三组软骨缺损均被透明软骨和纤维组织充填,只是A组的透明软骨组织较B组多,C组最少。随植入时间后移,A组几乎均被透明软骨样组织填平并且充填组织与周边正常关节软骨的交界逐渐分辨不出,并与深层软骨下骨相连接,软骨细胞间质的胶原纤维从表层向深层呈放射状排列于软骨细胞基质中。而B组的缺损处表面尚有较多的纤维组织且充填组织与周边正常关节软骨的分界较A组清晰,C组缺损处表面可见有较多纤维组织和?     

骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶修复全层半月板无血运区缺损

目的 观察骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶注射式修复全层半月板无血运区缺损的效果.方法 2008年6月至2009年2月制造成年山羊半月板前角无血运区全层缺损模型.以自体骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶修复半月板缺损(Ⅰ组),同时设立单纯载体组(Ⅱ组)和空白对照组(Ⅲ组).术后4、8、16周处死动物,行大体观察,组织学观察、电镜观察和MRI检查并比较修复效果.结果 Ⅰ组缺损完全被修复组织填充,结合紧密,与正常半月板组织相似,在4～16周效果逐渐改善,大体观察优于其他各组.光镜见细胞随凝胶纤维排列分布,载体纤维间隙大多为细胞分泌基质所充填,细胞排列密集,基质分布均匀.透射电镜见Ⅰ组细胞呈软骨细胞样形态,细胞突起较多,细胞器丰富,细胞为不同走向排列的纤维包绕.MRI检查发现Ⅰ组修复效果较好.结论 骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶注射可有效地修复全层半月板无血运区缺损.     

骨形态发生蛋白2和富血小板血浆凝胶对兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的影响

目的观察富血小板血浆(PRP)凝胶及腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的影响。方法取新西兰大白兔骨髓培养BMSCs,抽取静脉血制备PRP,以Ad-GFP-hBMP-2(BMP-2-BMSCs组)及Ad-GFP(对照组)转染的BMSCs分别与PRP凝胶复合,继续培养。用扫描电镜、MTT检测PRP凝胶的生物相容性,RT-PCR检测各组的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、蛋白聚糖、SOX-9表达。结果扫描电镜及MTT检测证实PRP凝胶具有良好的生物相容性。RT-PCR分析表明,单层培养的BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9的表达水平均高于对照组(P0.05),但Ⅰ型胶原表达水平较对照组明显下降(P0.05),同时Ⅹ型胶原表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P0.05);与PRP复合后,BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9表达水平较对照组升高(P0.05),而Ⅰ型胶原和Ⅹ型胶原表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论转染BMP-2的BMSCs在PRP凝胶中生长良好,BMP-2基因转染能促进BMSCs的体外成软骨分化。     

自体骨软骨移植与含富集骨髓干细胞松质骨移植修复兔关节软骨缺损

目的:评价自体骨软骨移植与含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植两种方法修复全层关节软骨缺损的生物学特征和效果。方法:采用新西兰大白兔制作左右后肢全层软骨缺损模型,分别进行自体骨软骨镶嵌移植、含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植修复,对照组不作任何修复,每组12只。术后第4、8、12周处死动物取材,分别进行膝关节活动度测定、大体观察、光镜观察与电镜观察。结果:移植实验组在第12周时均能以类透明软骨组织修复缺损,对照组为纤维肉芽组织。形态学检查表明,两种方法均能以类透明软骨组织覆盖缺损,骨软骨移植组无明显免疫排斥现象,随着时间延长,修复高度逐渐增加。骨软骨移植组同含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植组效果无显著差别。结论:骨软骨移植、含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植两种方法均能以类透明软骨组织修复全层关节软骨缺损,含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植更适用于较大面积软骨缺损的修复。     

三维动态诱导对自体组织工程软骨远期退变抑制效应的实验研究

目的体外诱导自体骨髓间充质干细胞（aMSC）向软骨细胞分化,验证三维动态诱导培养的软骨分化效率和远期修复效应。方法分离培养多样本aMSC,分别行转壁生物反应器内三维动态诱导（三维动态诱导组）培养和常规二维平面诱导（二维平面诱导组）培养,比较各自的软骨分化效率;收获细胞与注射型蛋白胶混合,修复动物关节软骨缺损。8、12、24、48周后分别取材,观察大体形态和组织学形态,进行组织学评分,比较长期修复效果。结果二维平面诱导时仅出现局部蛋白多糖沉积,只少数细胞表达Ⅱ型胶原;三维动态诱导培养时蛋白多糖沉积明显并广泛表达Ⅱ型胶原,其胶原产量和蛋白多糖含量明显高于二维平面诱导组。在体内实验中,三维动态诱导组：8、12周后缺损完全修复,表面光滑,质地坚硬,与周围软骨紧密结合,组织学表现为类透明软骨结构,24、48周后修复组织与周围界限消失,仍保持类透明软骨的结构。二维平面诱导组：8周后软骨缺损即可被类透明软骨修复,但12周后即开始出现退变,24周后退化明显,软骨组织骨化变薄,48周后则大部分骨性退化,表层残留菲薄纤维组织。结论三维动态诱导培养可提高aMSC的软骨分化效率和远期修复效果,可为深化自体软骨组织工程研究提出新思路。