丹参酮Ⅱ A抑制血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌肥大的机制

目的在原代培养的新生大鼠心肌细胞的基础上,观察丹参酮ⅡA磺酸钠盐(STS)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的影响,以探讨STS在钙调神经磷酸酶(CaN)依赖的信号通路心肌肥大中的作用. 方法以培养的原代心肌细胞为模型,用AngⅡ刺激细胞外Ca2+内流,丹参酮ⅡA及钙离子拮抗剂维拉帕米(Ver)进行干预,检测心肌细胞[Ca2+]i及钙调神经磷酸酶(CaN)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)活性;[3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率作为心肌细胞肥大的指标.结果AngⅡ刺激组[Ca2+]i水平及蛋白核酸合成速率明显增高,与对照组相比差异显著(P＜0.01),而STS能有效地降低由AngⅡ刺激引起的[Ca2+]i增高(P＜0.01 vs AngⅡ组),明显抑制AngⅡ诱导的蛋白质合成速率的增加(P＜0.01 vs AngⅡ组).AngⅡ刺激组CaN、PKC活性与对照组相比差异有显著性(P＜0.05、P＜0.01).STS及Ver抑制AngⅡ介导的心肌细胞CaN、PKC活性的增高.结论CaN通路在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用;STS具有Ca2+阻滞剂的特点,能有效地降低由AngⅡ刺激引起的[Ca2+]i增高,导致CaN活性降低阻滞心肌肥大的发生和发展.     

细胞内钙调控剂对心肌细胞生长的作用

目的 探讨干预细胞内钙（[Ca^2 ]i）对心肌细胞生长和钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）信号通路的作用。方法 原代乳鼠心肌细胞培养,应用免疫印迹（western blot)检测心肌细胞CaN蛋白表达,心肌细胞蛋白质,核酸合成速率分别用氘－亮氨酸（^3H-Leu),氘－胸腺啶（（^3H-TdR)掺入量测定：环孢素A（CsA)抑制CaN信号通路,血管紧张素II（Ang II),雷尼丁（RY）和三磷酸肌醇（IP3）干预心肌细胞[Ca^2 ]i。结果 Ang II ,RY和IP3明显增加心肌细胞CaN蛋白表达并提高^3H-Leu,^3H-TdR的掺入量,提高^3H-TdR掺入量在一定范围内呈量效和时间依赖关系,各刺激组与对照组相比差异有显性（P＜0．05或P＜0．01）,RY10^-6 mol/L刺激心肌细胞蛋白酸合成速率最高,环孢素A可抑制Ang II引起的^3H-Leu,^3H-TdR掺入量增加。结论 干预细胞[Ca^2 ]i对心肌细胞蛋白及酸合成有明显影响;心肌细胞CaN蛋白表达及生长似与细胞[Ca^2 ]i变化有明显关系而与其来源无关,阻断ＣaN能有效地抑制心肌细胞生长,表明ＣaN信号通路在心肌细胞生长中发挥重要作用。     

丹参酮ⅡA抑制血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌肥大的机制

目的 在原代培养的新生大鼠心肌细胞的基础上，观察丹参酮ⅡA磺酸钠盐（STS）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌细胞肥大的影响，以探讨STS在钙调神经磷酸酶（CaN）依赖的信号通路心肌肥大中的作用。方法 以培养的原代心肌细胞为模型，用AngⅡ刺激细胞外Ca^2＋内流，丹参酮ⅡA及钙离子拮抗剂维拉帕米（Ver）进行干预。检测心肌细胞[Ca^2＋]i及钙调神经磷酸酶（CaN）、丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶C（PKC）活性江。[^3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率作为心肌细胞肥大的指标。结果 AngⅡ刺激组[Ca^2＋]i水平及蛋白核酸合成速率明显增高，与对照组相比差异显著（P〈0．01），而STS能有效地降低南AngⅡ刺激引起的[Ca^2＋]i增高（P〈0．01VSAng1组）。明显抑制AngⅡ诱导的蛋白质合成速率的增加（P〈0．01 VS AngⅡ组）。AngⅡ刺激组CaN、PKC活性与对照组相比差异有显著性（P〈0．05、P〈0．01）。STS及Ver抑制AngⅡ介导的心肌细胞CaN、PKC活性的增高。结论 CaN通路在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用；STS具有Ca^2＋阻滞剂的特点，能有效地降低由AngⅡ刺激引起的[Ca^2＋]i增高，导致CaN活性降低阻滞心肌肥大的发生和发展。     

钙激动剂介导血管平滑肌细胞增殖的信号转导途径

为探讨钙调神经磷酸酶依赖的信号通路在雷尼丁刺激的大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用，以培养的大鼠血管平滑肌细胞为模型，用雷尼丁刺激其内贮Ca^2 释放入胞浆，环孢素A阻断钙调神经磷酸酶信号通路，维拉帕米阻断钙通道，检测血管平滑肌细胞钙调神经磷酸酶、丝裂素活化蛋白激酶和蛋白激酶C活性，用^3H-亮氨酸及^3H－胸腺嘧啶掺入量作为反应细胞增殖的指标。结果显示，雷尼丁刺激组蛋白核酸合成速率明显增高，与对照组相比差异显著（P＜0．01）；环孢素A及维拉帕米能明显抑制雷尼丁介导的平滑肌细胞蛋白核酸合成速率增高，与雷尼丁刺激组相比差异显著（P＜0．01）。同时发现雷尼丁刺激组钙神经磷酸酶、蛋白激酶C活性与对照组平滑肌细胞相比差异显著（P＜0．05或0．01）。环孢素A和维拉帕米抑制雷尼丁介导的平滑肌细胞钙调神经磷酸酶活性增高，维拉帕米抑制雷尼丁介导的平滑肌细胞蛋白激酶C活性的增高。提示钙调神经磷酸酶信号通路在雷尼丁刺激的平滑肌细胞增殖中起重要作用，但钙调神经磷酸酶信号通路不是雷尼丁介导平滑肌细胞增殖的唯一信号通路，以丝裂素活化蛋白激酶为核心的信号通路亦参与了雷尼丁刺激的平滑肌细胞增殖。     

丝裂素活化蛋白激酶参与钙激动剂介导的心肌肥大

目的 :探讨不同来源的细胞内钙 （[Ca2 +] i）对心肌细胞丝裂素活化蛋白激酶 （MAPK）介导的心肌细胞肥大反应的作用。方法 :以培养的大鼠心肌细胞为模型 ,用血管紧张素 （Ang ）刺激心肌细胞外 Ca2 +跨膜内流、三磷酸肌醇 （IP3 ）刺激胞内 Ca2 +释放 ,γ-3 2 P-ATP掺入法和免疫印迹 （western blot）测 MAPK活性及蛋白含量 ,氚 -亮氨酸（3 H-L eu）、氚 -胸腺嘧啶 （3 H-Td R）掺入量作为心肌细胞肥大的指标。结果 :Ang ,IP3 刺激 15 min均能显著增加心肌细胞 MAPK活性及蛋白含量 ,并提高 3 H-L eu,3 H-Td R掺入量 ,与对照组心肌细胞相比差异显著 （P<0 .0 1）。结论 :钙激动剂诱导的 MAPK活性及含量的增加参与了心肌细胞肥大 ,心肌细胞的肥大与 [Ca2 +] i 的来源无关     

PTEN抑制钙/钙调神经磷酸酶信号通路、负性调控血管紧张素Ⅱ所致心肌细胞肥大

目的 观察PTEN过度表达对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激所致钙／钙调神经磷酸酶（Ca^2＋／CaN）信号通路激活的影响,探讨PTEN负性调控心肌肥厚的作用机制。方法通过携带野生型PTEN基因的腺病毒（Ad-PTEN）感染构建过度表达PTEN的原代培养心肌细胞模型,用AngⅡ作为促心肌肥厚刺激剂,Fura-2／AM比率荧光成像系统检测细胞内Ca^2＋浓度（[Ca^2＋]i）,逆转录聚合酶链反应检测受感染细胞内心房利钠因子（ANF）、β-肌球蛋白重链（B-MHC）与CaNAβ的mRNA表达,Western blot检测CaNAβ的蛋白表达,同时测定CaN活性。结果 Ad-PTEN感染后,心肌细胞内过度表达PTEN的mRNA和蛋白。PTEN的过度表达能够明显抑制AngⅡ刺激所致的心肌细胞肥大标志基因表达。AngⅡ刺激使[Ca^2＋]i、CaNAβ mRNA与蛋白表达以及CaN活性明显增高,PTEN过度表达能够明显抑制AngⅡ引起的[Ca^2＋]i、CaNAβ mRNA与蛋白表达以及CaN活性增高。结论 PTEN过度表达可能通过抑制Ca^2＋／CaN信号通路,负性调控AngⅡ刺激所致的心肌细胞肥大。     

三磷酸肌醇受体/钙调神经磷酸酶信号通路激活致心肌肥厚的研究

目的 研究激活心肌细胞三磷酸肌醇受体（IP3R）是否触发钙调神经磷酸酶（CaN)介导的心肌肥厚信号通路。方法 培养Wistar乳鼠心肌细胞检测心肌细胞蛋白和核酸合成，细胞内钙变化，CaN，活化T细胞核因子3（NFAT3）及锌指转录因子（GATA4），胚胎基因（α-actin,β-MHC）及即刻早期基因（c-fos,c-myc)表达。结果 给予IP3能时间和剂量依赖性也增加心肌细胞蛋白和核酸合成，能明显致心肌细胞内钙增加；IP3刺激心肌细胞IP3受体，能明显激活心肌细胞CaN/NFAT3/GATA4信号通路，促使心肌细胞的早期即刻基因和胚胎基因表达。结论 激活IP3R介导的CaN/NFAT3/GATA4信号通路能显地促使心肌细胞肥大，这条信号通路不同于已知的G蛋白偶联受体介导的心肌肥厚信号转导途径。     

三磷酸肌醇受体参与心肌钙调神经磷酸酶信号通路的激活

目的:研究激活心肌细胞三磷酸肌醇受体（IP3R）是否触发钙调神经磷酸酶（CaN）介导的心肌肥厚信号通路。方法:培养的乳鼠心肌细胞检测心肌细胞蛋白合成,细胞内钙变化,CaN、活化T细胞核因子3（NFAT3）及锌指转录因子（GATA4）,胚胎基因（αskeletalactin,βMHC）及即刻早期基因（cfos,cmyc）蛋白表达。结果:三磷酸肌醇（IP3）能显著致原代培养的心肌细胞时间和剂量依赖性地增加心肌细胞蛋白合成,能显著致心肌细胞的早期即刻基因和胚胎基因表达,能显著增加心肌细胞内游离钙。IP3剌激IP3受体,能显著激活心肌细胞CaN/NFAT3/GATA4信号通路,使心肌细胞早期即刻基因（cfos、cmyc）及胚胎基因（αskeletalactin,βMHC）表达增加。结论:激活IP3R介导的CaN/NFAT3/GATA4信号通路能显著地促使心肌细胞肥大,这条信号通路不同于已知的G蛋白偶联受体介导的心肌肥厚信号转导途径。     

丹参酮ⅡA磺酸钠对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌细胞外信号调节激酶1/2的作用

目的研究丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大反应中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)是否有抑制作用。方法培养新生大鼠心肌细胞,考马斯亮蓝法测定心肌细胞蛋白含量、[3H]-亮氨酸掺入法测定蛋白合成速率作为心肌肥大指标;用免疫荧光标记法和Western-blot测定磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)表达。结果1)AngⅡ(1μmol/L)处理24h,心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率、蛋白含量明显增加,STS能明显抑制AngⅡ介导心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率、蛋白含量的增加;2)AngⅡ刺激心肌细胞可见胞核内出现磷酸化ERK1/2荧光染色,丹参酮ⅡA可阻断AngⅡ引起的ERK1/2活化、入核过程。3)用AngⅡ(1μmol/L)处理心肌细胞5min,磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)表达即开始增加,10min左右时最明显。4)STS剂量依赖性抑制AngⅡ诱导的心肌细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达。结论STS可以抑制AngⅡ诱导的心肌肥厚,其机制与抑制磷酸化ERK1/2表达有关。     

真核表达质粒pcDNA3-HERG转染抑制血管紧张素Ⅱ诱导乳兔心肌细胞肥大

目的 探讨HERG基因真核表达质粒pcDNA3-HERG(编码人快激活延迟整流钾通道α亚单位)转染抑制血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导乳兔心室肌细胞肥大的电生理机制.方法 培养乳兔心窜肌细胞,观察10~(-7)mol/L Ang Ⅱ作用6 h和48 h心肌肥大指标(细胞体积、总蛋白含量及膜电容)、动作电位时程(APD)及钙调神经磷酸酶(CaN)活性的变化.以真核表达质粒pcDNA3-HERG转染心窒肌细胞,观察转染细胞经Ang Ⅱ诱导48 h后上述指标的变化.结果 Ang Ⅱ作用6 h,心室肌细胞动作电位复极达90%时程(APD_(90))延长19.8%(P<0.01),而此时并无心肌肥大和CaN活性增加.Ang Ⅱ作用48 h,心窒肌细胞APD_(90)延长22.1%(P<0.01),细胞体积、总蛋白含量、膜电容以及CaN活性分别增加40.4%、40.4%、38.2%、114.7%(P均<0.01).pcDNA3-HERG转染可过度表达I_(HERG)其尾电流密度约为正常对照组快激活延迟整流钾电流(I_(Kr))尾电流密度的3.6倍(P<0.01),可促进复极,明显缩短AngⅡ引起的APD_(90)延长(P<0.01),显著抑制AngⅡ诱导心肌肥大和CaN活性增加.结论 AngⅡ诱导乳兔心室肌细胞肥大过程中,APD延长并非继发于而是早于心肌肥大.APD延长,继而导致Ca~(2+)内流和胞内Ca~(2+)增加,激活CaN信号通路可能在AngⅡ诱导心肌肥大中起重要作用.     

钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号传导通路对内皮祖细胞增殖作用的研究

目的研究钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子（CaN—NFAT）信号传导通路对内皮祖细胞（EPCs）增殖的作用。方法采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,贴壁培养获得EPCs。比色法测定EPCs增殖能力;免疫印迹法检测EPCs内钙调神经磷酸酶Ap（cnAp）蛋白质水平的表达;逆转录聚合酶链反应法检测EPCs内cnAB和NFAT4的表达。观察不同干预因素24h和48h后对EPCs增殖能力的作用,干预因素48h后对EPCs内CnAβ蛋白质水平表达的影响及对EPCs内CnAB和NFAT4表达的影响。结果苯肾上腺素（PE）使EPCs增殖能力增高;环孢素A（CsA）不仅直接使EPCs增殖能力下降,而且可抑制PE引起的EPCs增殖能力增高。结论EPCs内存在CaN—NFAT信号传导通路,该通路受促进因素及抑制因素的调节;CaN—NFAT信号传导通路对EPCs的增殖有明显作用。     

CaN-NFAT信号传导通路参与EPCs凋亡作用的研究

目的:研究钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子(CaN-NFAT)信号传导通路参与内皮祖细胞(EPCs)的凋亡过程。方法:采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,贴壁培养获得EPCs。实验分为4组:空白对照组、苯肾上腺素(PE)组、环孢素A(CsA)组、CsA+PE组。采用TUNEL染色测定EPCs凋亡状况。逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测Bax、Bcl-2、Caspase-3及NFAT4的mRNA的转录水平。免疫荧光染色检测NFAT4亚细胞水平定位。结果:(1)EPCs凋亡检测:与空白对照组及PE组比较,CsA组和CsA+PE组EPCs凋亡数明显增加[(3.41±0.89)比(4.39±1.92)比(23.68±1.14)比(25.92±2.62),P<0.05];(2)与空白对照组和PE组比较,CsA组和CsA+PE组的Bcl-2mRNA水平、Bcl-2/Bax mRNA比值明显下降(P均<0.05),Caspase-3mRNA水平明显升高(P<0.05)。NFAT4mRNA水平:与空白对照组比较,PE组的明显升高(P<0.05),CsA组的明显下降(P<0.05);与PE组比较,CsA组和CsA+PE组的NFAT4mRNA水平均明显下降(P<0.05)。四组之间Bax mRNA水平均无显著差异;(3)与空白对照组比较,PE组NFAT4核转移率明显增加[(25.33±2.08)%比(95±2)%,P<0.05];与空白对照组及PE组比较,CsA组和CsA+PE组NFAT4核转移率[(8.00±2.65)%、(7.00±1.73)%]明显下降(P均<0.05)。结论:CaN-NFAT信号传导通路参与EPCs凋亡的调节作用。     

Divergent differentiation of rat adrenocortical cells is associated with an interruption of angiotensin II-mediated signal transduction.

The zones of the adrenal cortex contain distinct populations of cells which share a common developmental origin and steroidogenic template. In the rat, zona glomerulosa cells respond to angiotensin II (Ang II) with increased steroidogenesis while zona fasciculata/reticularis cells do not. We have examined Ang II-mediated signal transduction in homogeneous cellular sub-populations derived from either the zona glomerulosa (GLOM) or the zona fasciculata (FASC). In both of these sub-populations Ang II treatment significantly increased the levels of 3H-labelled inositol phosphates as well as the total mass of inositol 1,4,5-triphosphate. In contrast, the two cell types exhibited very different Ang II-mediated changes in free intracellular calcium ([Ca2+]i). Ang II (10 nM), induced [Ca2+]i increases of > 50 nM in 90% of individual GLOM cells (53/58), but in only 28% of FASC cells (11/39). These [Ca2+]i responses occurred after a transient Ang II stimulation ( < 1 min), in the presence of verapamil and in the absence of extracellular calcium, indicating an intracellular release. In small groups of 10-30 cells, stimulation with 1, 10 and 100 nM Ang II induced [Ca2+]i increases of 78, 178 and 215 nM respectively in GLOM cultures compared to only 35, 64, and 65 nM in FASC cultures. Thapsigargin treatment, which releases intracellular calcium in an inositol phosphate independent manner, elicited [Ca2+]i increases in both populations. Importantly, a calcium ionophore induced elevation of [Ca2+]i increased steroidogenesis in both cell types. These results suggest that an interruption of the signaling cascade at the level of intracellular calcium release contributes to the lack of a steroidogenic response to Ang II by the FASC cells. Therefore, in the rat adrenal cortex, divergent differentiation of related cell types may involve alterations within signal transduction pathways distal to initial receptor-mediated events (i.e. inositol phosphate production) and proximal to downstream effector events (i.e. steroidogenesis).     

钙敏感受体对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌细胞肥大的作用

目的 观察钙敏感受体(CaSR)在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导心肌细胞肥大中的作用和可能机制.方法 用Ang Ⅱ处理原代新生大鼠心室肌细胞复制心肌肥大细胞模型;用CaSR激动剂氯化钆(GdCl3),GdCl3+蛋白激酶C(PKC)通路阻断剂(Ro318220)处理AngⅡ诱导的肥大心肌细胞分别作为GdCl3、Ro318220组.通过苏木素-伊红染色(HE)法测定细胞直径,考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量来评价细胞肥大的情况;利用激光共聚焦显微镜检测心肌细胞内钙浓度([Ca2+]i;Western blot法检测CaSR和PKC通路的蛋白表达.结果 ①与对照组(0.1263±0.0443)比较,Ang Ⅱ组(0.1963±0.0375)和GdCl3组(0.2778±0.0564)CaSR蛋白表达明显增加(P均＜ 0.05),且GdCl3组明显高于AngⅡ组(P＜0.05).②与对照组(222.70±22.09)比较,Ang Ⅱ组(392.16±36.85)和GdCl3组(502.60±44.21)心肌细胞内[Ca2+]i显著增加(P均＜0.05);与Ang Ⅱ组比较,GdCl3组[Ca2+]i显著增加(P＜0.05).③与对照组比较,Ang Ⅱ可诱导心肌细胞肥大,GdCl3可促进Ang Ⅱ的诱导作用,而Ro318220可抑制GdCl3的作用;④与对照组(0.27±0.07、0.69±0.06、0.87±0.04)比较,Ang Ⅱ组PKCα、PKCε和PKCδ蛋白表达明显增加(0.60±0.16、1.02±0.13、1.20±0.18,P均＜0.05),GdCl3组PKCα、PKCε蛋白表达明显增加(0.82±0.16、1.34±0.12,P均＜0.05);与Ang Ⅱ组比较,GdCl3组PKCα、PKCε蛋白表达明显增加(P均＜ 0.05);与GdCl3组比较,Ro318220组PKCα、PKCε蛋白表达(0.41±0.10、0.85±0.14)明显减少(P均＜ 0.05).结论 PKC通路参与CaSR激活促进心肌细胞肥大的信号转导.