多色流式细胞术检测人外周血BCG特异性效应型记忆γδT细胞的表型特征

目的检测卡介苗(BCG)刺激后,PPD+正常人外周血中分泌IFN-γ的TCRγδ亚群及其表型特征。方法分离PPD+正常人外周血单个核细胞(PBMCs),用多色流式细胞术检测TCRγδ亚群;BCG刺激PBMCs后检测γδT细胞IFN-γ分泌水平,并分析BCG特异性γδT细胞表型特征。结果依据PBMCs中TCRγδ和δ2的表达,可将γδT细胞分为3个亚群,即δ2high、δ2low和TCRγδ中非δ2T细胞(non-δ2-γδT)细胞。其中,δ2high和δ2lowT细胞几乎全部(>98%)为CD45RO+,而non-δ2-γδT细胞中只有少部分表达CD45RO,其余大部分不表达CD45RO。δ2high和δ2lowT细胞表型类似,主要为CD45RO+CD62L-CD27-,而non-δ2CD45RO+细胞主要为CD62L-CD27+,non-δ2CD45RO-细胞几乎全部为CD62L-CD27-。BCG刺激PBMCs后,可诱导γδT细胞分泌IFN-γ,且主要为δ2high和δ2low细胞,而non-δ2-γδT几乎不产生IFN-γ。进一步分析BCG特异性γδT细胞的表型特征,结果表明,δ2high-CD45RO+IFN-γ+和δ2lowCD45RO+IFN-γ+细胞主要为CD62L-CD27-和CD62L-CD27+,为效应型记忆细胞。结论 BCG刺激PPD+正常人外周血PBMCs后,主要诱导δ2T细胞分泌IFN-γ,且该细胞表现出CD45RO+CD62L-效应型记忆细胞特征,可能在预防结核早期感染中发挥重要作用。     

人脐带血与周围血中NKT细胞频率、亚群、表型及功能的比较

目的比较足月产新生儿脐带血和正常人周围血NKT细胞的频率、亚群、表型特征及功能。方法分离足月产新生儿脐带血CBMCs和正常成年人周围血PBMCs,流式细胞术检测TCRvβ11、CD4、CD8、CD45RA、CD62L、CCR7等表面分子的表达及细胞因子IL-4和IFN-γ的产生。结果 CBMCs和PBMCs中CD3+TCRvβ11+NKT细胞的平均频率分别为0.35%和0.33%,二者无显著差别。CBMCs中CD4+NKT细胞频率(67.39%)高于PBMCs中CD4+NKT细胞频率(54.08%),但CD8+NKT细胞,PBMCs明显高于CBMCs(22.35%对5.86%),CD4-CD8-NKT二者相差无统计学意义。CBMCs中CD3+TCRvβ11+CD45RA+NKT细胞的频率(88.37%)高于PBMCs(61.32%)。CBMCs中CD62L(56.66%对49.60%)和CCR7(22.64%对20.03%)的比例稍高于PBMCs,但其差别无显著性。未刺激CBMCs和PBMCs中CD3+TCRvβ11+NKT细胞均不产生IL-4和IFN-γ,PMA+Ionomycin刺激后,CBMCs中CD3+TCRvβ11+NKT细胞仍不能产生IL-4和IFN-γ,但PBMCs中CD3+TCRvβ11+NKT细胞却有6.74%产生IL-4、26.96%产生IFN-γ、1.26%同时分泌IL-4和IFN-γ,产生细胞因子的CD3+TCRvβ11+NKT细胞主要为记忆性NKT细胞。结论 CBMCs和PBMCs中CD3+TCRvβ11+NKT细胞的亚群、表型和功能均存在一定差别,记忆性NKT细胞可能与其再次免疫应答相关。     

人外周血中γδT细胞亚群、表型和细胞因子产生的研究

目的进一步比较人外周血中γδT细胞及Vδ1^+、Vδ2^+、Vδ1^-Vδ2^-细胞频率、表型及功能方面异同,进一步了解γδT细胞在免疫应答中的作用。方法分离人外周血单个核细胞(PBMCs),流式细胞术检测TCRγδ、Vδ1、Vδ2、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、Granzyme A。PMA+Ionomycin刺激前后检测细胞因子IFN-γ、IL-17A及转录因子T-bet、Ro Rγt水平。磁珠富集、流式分选和ELISA检测纯化细胞IFN-γ产生。结果根据γδT细胞受体(TCRγδ)δ链,将γδT细胞分为Vδ1^+,Vδ2^+,Vδ1^-Vδ2^-3群,TCRγδ高低表达与Vδ1、Vδ2表达相关。Vδ1^+、Vδ2^+细胞约有20%~40%细胞表达CD8,低表达CD4,而Vδ1^-Vδ2^-细胞约有60%表达CD8和20%表达CD4。约6%的Vδ1^+和30%的Vδ1^-Vδ2^-细胞表达CD45RO,而约有80%的Vδ2^+细胞表达CD45RO。刺激后,γδT细胞3个亚群均表达IFN-γ和IL-17,Vδ2^+细胞表达最高,3个亚群差异有显著性,与纯化细胞结果相符。3个亚群细胞均高表达转录因子T-bet和Ro Rγt,高表达颗粒酶A。结论人外周血中Vδ1^+、Vδ2^+及Vδ1^-Vδ2^-细胞在频率、表型及功能方面均有显著差异,均可产生高水平细胞因子IFN-γ,该结果将为γδT细胞进一步研究打下良好基础。     

人外周血中HMBPP特异性Vδ2T细胞细胞因子的产生和表型特征分析

目的研究人外周血单个核细胞中HMBPP特异性Vδ2 T细胞细胞因子的产生和表型特征。方法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)和Vδ2 T细胞,用不同剂量的HMBPP和抗人CD28联合刺激培养不同的时间。用酶联免疫吸附法和酶联免疫斑点法检测IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生,利用流式细胞术检测Vδ2 T细胞中IFN-γ、TNF-α和IL-2的百分比及表型特征。结果 HMBPP以剂量依赖和时间依赖的方式刺激PBMCs产生IFN-γ。流式细胞术从单个细胞水平证实PBMCs中有(2.27±0.50)%CD3+T细胞表达Vδ2,HMBPP特异性刺激Vδ2 T细胞表达IFN-γ[(38.84±2.62)%]和TNF-α[(26.65±2.05)%],其中(19.43±2.10)%Vδ2 T细胞共表达IFN-γ和TNF-α。表型分析显示,HMBPP特异性Vδ2 T细胞主要为效应型和中央型记忆细胞的表型特征,即CD45RO+CCR7+/-CD62L-。HMBPP刺激纯化的γδT细胞获得相同的结果。结论 HMBPP特异性诱导人PBMCs中Vδ2 T细胞产生细胞因子IFN-γ和TNF-α,表现为记忆细胞的表型特征,本研究为探究感染和炎症性疾病中Vδ2 T细胞的功能和免疫学特征提供了依据。     

人外周血NKT细胞亚群表型及生物学特征

目的:观察正常人周围血NKT细胞的频率、表型特征及功能,进一步了解NKT细胞在免疫应答中的作用。方法:分离正常成年人PBMCs,利用流式细胞术(FCM)检测TCRvβ11、CD4、CD8、CD45RA、CD62L、CCR7等表面分子的表达;PMA+Ionomycin刺激PBMCs后,检测细胞因子的产生。结果:正常成年人周围血CD3+TCRvβ11+NKT细胞的平均频率为0.35%,其范围为0.11%～1.20%。根据CD4和CD8分子的表达,可将CD3+TCRvβ11+NKT细胞分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-三个亚群,分别为56.24%、25.82%、16.47%。此外多数CD3+TCRvβ11+NKT细胞表达CD45RA,近半数细胞表达CD62L,少数细胞表达CCR7。细胞因子表达的结果显示,经PMA和Ionomycin刺激后,近30%的CD3+TCRvβ11+NKT细胞分泌IFN-γ,6.9%的细胞分泌IL-4。CD4+NKT细胞产生IL-4的量要明显高于CD8+NKT细胞,但IFN-γ的表达二者没有明显差别。重要的是初始和记忆性NKT细胞都能产生细胞因子,以记忆性NKT细胞为主。结论:正常人周围血中CD3+TCRvβ11+NKT细胞的频率很小,但其表型复杂,产生细胞因子IFN-γ和IL-4的频率高,参与免疫调节及免疫应答的过程。     

周围血中CD3~+ TCRvα24~+与CD3~+ TCRvβ11~+ NKT细胞之间的差异

目的:比较正常人周围血中CD3+TCRvβ11+NKT细胞和CD3+TCRvα24+NKT细胞在频率、亚群、表型特征及功能方面的异同,以进一步了解NKT细胞在免疫应答中的作用。方法:分离正常成年人PBMCs,利用流式细胞术(FCM)检测TCRvα24、TCRvβ11、CD4、CD8、CD45RA、CD62L和CCR7表面分子的表达;PMA+Ionomyc in刺激PBMCs后,检测CD3+TCRvα24+、CD3+TCRvβ11+NKT细胞产生细胞因子IL-4和IFN-γ的情况。结果:PBMCs中CD3+TCRvα24+和CD3+TCRvβ11+NKT细胞的平均频率分别为0.63%和0.43%,NKT细胞频率的个体差异较大,少数细胞同时表达TCRvα24和TCRvβ11;根据CD4和CD8分子的表达,PBMCs中CD3+TCRvα24+NKT细胞可分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-3个亚群,平均频率分别为64.35%、19.04%、17.18%,CD3+TCRvβ11+NKT细胞同样可分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-3个亚群,其平均频率分别为53.69%、18.99%、29.74%,相应各亚群之间无显著差异;CD45RA+CD3+TCRvβ11+NKT细胞的频率(71.14%)要高于CD45RA+CD3+TCRvα24+NKT细胞的频率(46.55%),二者之间差异有显著性,CD62L+CD3+TCRvα24+NKT(46.26%)对CD62L+CD3+TCRvβ11+NKT(42.36%)以及CCR7+CD3+TCRvα24+NKT(9.24%)对CCR7+CD3+TCRvβ11+NKT(8.22%)之间的差异均无统计学意义;细胞因子检测的结果表明CD3+TCRvα24+NKT细胞和CD3+TCRvβ11+NKT细胞产生的IL-4(13.01%对6.62%)和IFN-γ(38.12%对26.95%)的总体水平间无显著性差异,但是IFN-γ+IL-4+CD3+TCRvα24+NKT细胞的平均频率(12.65%)要高于IFN-γ+IL-4+CD3+TCRvβ11+NKT细胞的平均频率(3.02%),且二者之间的差异有统计学意义。结论:正常人周围血中CD3+TCRvα24+NKT细胞和CD3+TCRvβ11+NKT细胞在频率、表型及产生细胞因子方面均有一定差异,总体来看,二者频率虽小但表型复杂,产生细胞因子IFN-γ和IL-4的水平高,参与免疫调节及免疫应答的过程。     

周围血中CD3+TCRvα24+与CD3+TCRvβ1+NKT细胞之间的差异

目的:比较正常人周围血中CD3+ TCRvβ11+ NKT 细胞和CD3+ TCRvα24+ NKT细胞在频率、亚群、表型特征及功能方面的异同,以进一步了解NKT细胞在免疫应答中的作用.方法:分离正常成年人PBMCs,利用流式细胞术(FCM)检测TCRvα24、TCRv1β11、CD4、CD8、CD45RA、CD62L和CCR7表面分子的表达;PMA+ Ionomycin刺激PBMCs后,检测CD3+ TCRvα24+、CD3+ TCRvβ11+NKT细胞产生细胞因子IL-4和IFN-γ的情况.结果:PBMCs中CD3+ TCRvα24+和CD3+ TCRvβ11+NKT细胞的平均频率分别为0.63％和0.43％,NKT细胞频率的个体差异较大,少数细胞同时表达TCRvα24和TCRvβ11;根据CD4和CD8分子的表达,PBMCs 中CD3+ TCRvα24+ NKT细胞可分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-3个亚群,平均频率分别为64.35％、19.04％、17.18％,CD3+ TCRvβ311+ NKT细胞同样可分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-3个亚群,其平均频率分别为53.69％、18.99％、29.74％,相应各亚群之间无显著差异;CD45RA+ CD3+ TCRvβ11+ NKT细胞的频率(71.14％)要高于CIM5RA+ CD3+ TCRvα24+ NKT 细胞的频率(46.55％),二者之间差异有显著性,CD62L+CD3+ TCRvα24+ NKT (46.26％)对CD62L+ CD3+ TCRvβ11+NKT(42.36％)以及CCR7+ CD3+ TCRvα24+ NKT(9.24％)对CCR7+ CD3 +TCRvβ11+NKT(8.22％)之间的差异均无统计学意义;细胞因子检测的结果表明CD3 +TCRvα24+ NKT细胞和CD3+ TCRvβ11+NKT细胞产生的IL-4( 13.01％对6.62％)和IFN-γ(38.12％对26.95％)的总体水平间无显著性差异,但是IFN-γ+ IL-4+ CD3+ TCRvα24+NKT细胞的平均频率(12.65％)要高于IFN-γ+ IL-4+ CD3+ TCRvβ11+NKT细胞的平均频率(3.02％),且二者之间的差异有统计学意义.结论:正常人周围血中CD3+ TCRvα24+ NKT细胞和CD3+TrCRvβ11+NKT细胞在频率、表型及产生细胞因子方面均有一定差异,总体来看,二者频率虽小但表型复杂,产生细胞因子IFN-y和IL-4的水平高,参与免疫调节及免疫应答的过程.     

八色流式细胞术检测人外周血BCG特异性效应型记忆CD4+T细胞的表型特征

目的:检测BCG刺激后,PPD+正常人外周血中细胞因子产生及其亚群.方法:分离PPD+正常人外周血单个核细胞(PBMC),BCG刺激后检测CD4+和CD8+T细胞细胞因子分泌,并用八色流式细胞术分析BCG特异性T细胞亚群.结果:BCG刺激PBMC后,主要是CD4+T细胞分泌Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2和TNF-α),而CD8+T细胞几乎不产生细胞因子.进一步分析分泌细胞因子的细胞亚群,主要是CD4+CD45RO+ CD62L(-)CD27(-)和CD4+ CD45RO+ CD62L(-)CD27+分泌细胞因子.结论:BCG刺激PPD+正常人外周血PBMC后,主要诱导CD4+T细胞分泌细胞因子,且该细胞表现出CD4+CD45RO+ CD62L(-)效应型记忆细胞特征,可能在预防结核感染中发挥重要作用.     

结核分枝杆菌耐热抗原激活的人γδT细胞Th2极性分化特征以及T-bet/GATA-3对分化的调控作用

目的研究结核杆菌耐热抗原(MTB-HAg)激活的人外周血γδT细胞Th2极性分化特点和表达于T细胞中的T盒(T-bet)和GATA结合蛋白3(GATA-3)转录因子的调控作用。方法用MTB-HAg刺激人外周血单个核细胞(PBMC)获得MTB-HAg激活的T细胞(MTBAT),分别在中性条件和Th2极化条件培养后,再经10 ng/m L佛波醇酯(PMA)、500 ng/m L离子霉素(ionomycin)和2.5μmol/L莫能菌素(monensin)刺激6 h,四色荧光抗体染色流式细胞术检测γδT细胞和αβT细胞内细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的表达。流式细胞术分选28 d MTBAT中的γδT细胞和CD4+T细胞,反转录PCR(RT-PCR)检测T-bet和GATA-3 mRNA的表达。结果在中性条件和Th2极化条件下培养的MTBAT中,γδT细胞一直优势表达IFN-γ,而Th2极化条件下,随培养时间增加IFN-γ+αβT细胞百分率显著下降。与中性条件培养比较,Th2极化条件下MTBAT培养28 d,Th0型(IFN-γ+IL-4+)γδT细胞显著增加;而Th2型(IFN-γ-IL-4+)αβT细胞显著增加。RT-PCR结果显示,Th2极化的γδT细胞仍高表达T-bet mRNA,而在CD4+T细胞T-bet mRNA表达被显著下调;同时,GATA-3 mRNA在γδT细胞和CD4+T细胞的表达均显著上调。结论 Th2极化条件下,大部分γδT细胞仍为Th1型,仅部分极性分化为Th0型细胞;Th2极性分化的γδT细胞转录因子T-bet和GATA-3未表现出交互调节功能。     

肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究

目的研究特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原激活后,记忆性T细胞的分化情况,并明确其表型特征和免疫功能。方法密度梯度离心法分离PBMC,重组TCR腺病毒感染T细胞,流式细胞术检测外源TCR表达效率。AFP表位肽刺激T细胞,流式细胞术检测TCR基因转染T细胞经抗原刺激后,记忆性T细胞标志分子表达。MTT法检测T细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果重组腺病毒载体感染3 d后,外源TCR表达比例接近30%。特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化,CD45RO+细胞比例逐渐上升至接近50%。CD45RO+细胞以CD62L–CD44+表型为主。此后CD62L+细胞比例逐渐上升。最终出现分群明显的CD62L+CD44+TCM表型细胞。特异性TCR基因转染能够促进T细胞杀伤AFP+靶细胞,诱导靶细胞凋亡,并促进IFN-γ分泌。抗原预先刺激能够进一步增强TCR基因转染T细胞抗肿瘤免疫效应。结论 TCR基因转染能够有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化。经肿瘤抗原预先刺激的TCR基因转染T细胞将启动记忆性T细胞分化,在再次遭遇表达相同抗原的肿瘤细胞时发挥更为强烈的免疫效应。     

环孢素A抑制正常人外周血记忆CD4~＋T细胞产生IL-22的实验研究

目的探讨环孢素A（CsA）是否能够抑制正常人CD4＋T细胞产生白细胞介素22（IL-22）。方法使用密度梯度离心法制备正常人外周血单个核淋巴细胞（PBMCs）,加入PMA＋Inomycin刺激细胞后,做细胞内细胞因子染色,流式细胞仪检测正常人外周血PBMCs中产生IL-22的T细胞亚群,以及IL-17-IFN-γ-IL-22＋CD4＋T细胞亚群（Th22）;PMA＋Inomycin刺激正常人PBMCs,同时加或不加环孢素A（CsA）后,做细胞内细胞因子染色,流式细胞仪检测IL-22＋CD4＋T细胞和IFN-γ＋CD4＋T细胞的比例,以及IL-22＋CD4＋T细胞表达记忆表型分子CD45RO情况。结果正常人外周血中产生IL-22的T细胞以CD4＋T细胞为主,且存在仅分泌IL-22,不分泌IL-17和IFN-γ的Th22亚群;CsA以剂量依赖方式抑制CD4＋T细胞产生IL-22和IFN-γ;CsA抑制外周血PBMCs中记忆CD4＋T细胞产生IL-22。结论 CsA能抑制正常人外周血中记忆CD4＋T细胞产生IL-22。     

幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜CD8 T细胞的免疫表型及应答特征

目的探究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)感染后小鼠胃黏膜CD8 T细胞的表型特征及应答规律。方法建立H. pylori感染的小鼠模型,同时设立对照组。流式细胞仪检测胃黏膜CD8 T细胞的频率、表型、趋化因子受体及细胞因子。Real-time PCR检测胃黏膜H.pylori的定植量。结果实验组小鼠胃黏膜CD8 T细胞的频率显著高于对照组(P0.01)。胃黏膜CD8 T细胞高表达CD44、CD103、CD69,低表达CD62L、CCR7。与对照组相比,感染组胃黏膜CD8 T细胞上调表达趋化因子受体CCR3、CCR4、CCR5、CXCR5。非特异和特异刺激CD8 T细胞均分泌细胞因子IFN-γ。结论 H.pylori感染后,小鼠胃黏膜CD8 T细胞是一群通过趋化因子受体上调从而募集到胃黏膜的Trm细胞(常驻记忆型T细胞),主要通过分泌细胞因子IFN-γ进行免疫应答。     

人外周血CD4~+ IL-21~+记忆T细胞的特征

目的:探讨人外周血中白细胞介素21(IL-21)的产生细胞及其特征。方法:分离人外周血单个核细胞(PBMC),分为不刺激或anti-CD3(OKT3)、OKT3+anti-CD28、PMA+ionomycin刺激四个组,流式细胞术(FCM)检测产生IL-21的细胞亚群。PMA+ionomycin刺激PBMC、纯化CD4+、CD4+CD45RA-、CD4+CD45RA+细胞、脐带血单个核细胞(CB-MC),FCM分析产生IL-21细胞的表型特征和IL-21与Th1、Th2、Th17和Th22细胞因子之间的关系。结果:与OKT3、OKT3+anti-CD28相比,PMA+ionomycin能诱导最高量的IL-21产生。产生IL-21的主要细胞为CD4+T细胞,少数CD8+T细胞。CD4+IL-21+T细胞表达CD45RO,不表达CD45RA,其中部分细胞表达CCR6、CCR7或CXCR5。CD4+CD45RA-细胞表达IL-21远高于CD4+CD45RA+细胞。进一步研究表明,PBMC产生IL-21,而CBMC不产生。此外,大约24%的CD4+IL-21+细胞表达IFN-γ,小于10%CD4+IL-21+细胞表达IL-4、IL-17或IL-22。结论:人PBMC在多克隆刺激的条件下,可以诱导IL-21的产生。产生IL-21的主要细胞亚群具有记忆CD4+T细胞的表型。其中一部分CD4+IL-21+T细胞的表型独立于Th1、Th2、Th17和Th22细胞亚群。     

人初始和记忆CD4+T细胞信使RNA基因芯片检测结果分析

目的探讨健康成人外周血初始和记忆CD4~+T细胞静息状态下表面分子、趋化因子受体、细胞因子和转录因子mRNA表达的差异。方法抽取健康成年人外周血,分离PBMC,染色后流式分选出CD45RO-的初始和CD45RO+的记忆CD4~+T细胞,裂解细胞,进行mRNA表达谱芯片检测。结果相比初始T细胞,静息状态下记忆CD4~+T细胞表达高水平的表面分子CTLA-4、PD-1、FAS、CD25,趋化因子受体CCR4、CCR6、CXCR3、CXCR5,细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17和转录因子T-bet、EOMES、STAT4、GATA3和RORγt,并表达低水平的表面分子CD62L、CCR7、ICAM-I、CD40L,细胞因子IL-1β和转录因子NF-κB。结论静息状态下,与初始CD4~+T细胞相比,记忆CD4~+T细胞高表达某些活化分子、细胞因子、转录因子mRNA,可能是记忆CD4~+T细胞发生快速免疫应答的关键因素。     

CD154(CD40L)的表达与初始和记忆CD4+T细胞相关性的探讨

目的:探讨CD154 细胞的表型特征与初始和记忆CD4 T细胞以及与细胞因子表达之间的关系。方法:正常人外周血单个核细胞(PBMC),经抗CD3 抗CD28单克隆抗体(mAb)刺激培养后,利用多种抗细胞表面分子和抗细胞因子以及抗CD154抗体进行标记,用流式细胞术检测。结果:体外刺激PBMC6h后,CD154表达于CD4 T细胞,而不表达于CD8 T细胞。对比分析CD4 CD154 T和CD4 CD154- T细胞上CD45RA(初始)和CD45RO(记忆)表面分子的结果表明,大多数CD4 CD154 T细胞为记忆细胞。当利用抗CD3或抗CD3 抗CD28mAb刺激后,分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的CD4 T细胞均为CD4 CD154 T细胞,而且单个细胞可以同时分泌两种以上细胞因子。进一步研究表明,CD4 CD154 T细胞低表达或不表达CD25,不表达CD62L,50%左右的细胞表达CCR7。结论:体外短时间刺激PBMC,经过对细胞表型和细胞因子表达的研究,表明CD154分子结合其他表面标记或细胞因子的表达可以用于鉴别初始和记忆CD4 T细胞。     

正常人周围血初始和记忆T细胞亚群及细胞因子表达的探讨

目的：利用多色流式检测技术探讨初始和记忆T细胞亚群与细胞因子表达之间的关系。方法：自正常人静脉血中分离PBMC,经超抗原（SEB）刺激5h后,加入多种抗细胞表面标记和抗细胞因子抗体进行染色,利用流式细胞术检测,并利用Flow Jo软件分析结果。结果：根据CD45RO表达与否,将CD4^＋和CD8^＋T细胞分为初始和记忆T细胞,再根据归巢受体（CD62L）和趋化因子受体（CCR7）的表达与否,将初始和记忆T细胞进一步分为不同的亚群。当T细胞受到SEB激活后,CD45RO^＋和CD45RO^-的CD4^＋或CD8^＋T细胞均表达IL-2、IFN-γ和TNF-α。进一步分析结果表明,CD62L^hi和CD62L^hiCCR7^＋细胞不表达细胞因子,而CD62L^loCCR7^lo和CCR7^＋T细胞均表达细胞因子,其中CD62L^loCCR7^lo细胞表达细胞因子的阳性率明显高于CCR7^＋细胞亚群。结论：只利用CD45RO表达与否区分初始和记忆T细胞是不够准确的,同时检测CD62L的表达,可明显地提高其准确性。     

糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119对γδT细胞增殖及表型的影响

目的:观察糖原合酶激酶-3β抑制剂4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)对γδT细胞增殖和表型的影响。方法:从健康人外周血中分离单个核细胞,加入到γδT细胞完全培养基培养,分别于第1天和第8天时,加入TWS119(0~8.0μmol/L)诱导培养。培养到12 d后,用CCK-8法测定γδT细胞增殖能力;用流式细胞术检测γδT细胞纯度、CD45RA和CD62L的表达。结果:TWS119能够活化γδT细胞Wnt/β-catenin信号通路。在第1天加入TWS119诱导培养组中,随着TWS119浓度的增加,γδT细胞表面CD45RA和CD62L的阳性表达率逐渐升高,而对细胞的增殖及纯度呈抑制作用。在第8天加入TWS119诱导培养组中,TWS119能剂量依赖性促进CD62L的表达而对CD45RA表达无影响,同时在一定浓度范围能促进γδT细胞的增殖和提高纯度的作用。结论:TWS119在一定浓度范围内能促进γδT细胞增殖和提高γδT细胞纯度,并能活化γδT细胞Wnt/β-catenin信号通获得CD45RA+CD62L+γδT细胞和CD62L+γδT细胞。     

人外周血和扁桃体中Tfh细胞与其他Th细胞亚群之间的关系

目的比较观察人外周血和扁桃体Tfh细胞的表型以及与Th1、Th17、Th22细胞亚群之间的关系。方法分离正常人PBMC及扁桃体单个核细胞,利用anti-CD3+anti-CD28或PMA+ionomycin刺激后,采用ELISA和流式细胞术(FCM)检测其细胞因子的产生,分析Tfh与Th1、Th17、Th22细胞亚群之间的关系。结果与PBMC中CD4+T细胞不同,扁桃体CD4+T细胞高表达CXCR5和CD45RO,低表达CCR7和CD62L;与PBMC中CD4+T细胞相比,扁桃体CD4+T细胞IL-21和IL-17产生水平较高,IFN-γ产生水平较低,IL-22水平无显著差异;外周血和扁桃体CD4+T细胞中均存在一定比例的IL-21+IL-17+双阳性、IL-21+IL-22+双阳性、IL-21+IFN-γ+双阳性细胞,IL-21单阳性细胞在扁桃体CD4+T细胞中所占比例明显高于外周血;外周血和扁桃体CD4+CXCR5+细胞除表达IL-21外,还表达IL-17、IL-22和IFN-γ。结论扁桃体中存在较多数量的Tfh细胞,大多数Tfh细胞是不同于Th1、Th17和Th22的细胞亚群。     

C57BL/6小鼠γδT细胞的组织器官分布和功能特点

目的 比较C57BL/6小鼠肝脏、肺脏、脾脏和肠系膜淋巴结中γδT细胞占所分离的淋巴细胞及其CD3+T细胞的百分比、表型和功能的特点.方法 分离正常C57BL/6小鼠肝脏、肺脏、脾脏和肠系膜淋巴结的淋巴细胞,应用细胞表面分子染色的方法,使用流式细胞仪观察γδT细胞占从不同组织分离的淋巴细胞及CD3+T细胞的百分比及其表型的特点.细胞经PMA和离子霉素刺激后,应用细胞内细胞因子染色的方法,通过流式细胞仪观察γδT细胞产生IFN-γ、IL-4、IL-9和IL-17细胞因子的情况.结果 γδT细胞占分离淋巴细胞中的百分含量在肝脏明显高于肺脏、脾脏和肠系膜淋巴结(P＜0.05),而γδT细胞在肠系膜淋巴结CD3+T细胞的百分含量要显著的低于其他脏器(P＜0.05).不同组织器官中γδT细胞以CD4-CD8-表型为主,还存在少量CD8+ γδT细胞.在肠系膜淋巴结γδT细胞中CD4+细胞的量明显高于其他器官,且明显可见一群CD4+ CD8+细胞.不同组织中γδT细胞中IL-17+的细胞量要明显高于IFN-γ+和IL-4+细胞.γδT细胞基本不分泌IL-9.肺脏的γδT细胞分泌细胞因子的能力最强,其IL-17+细胞的量达到(26.6±12.1)％.IFN-γ+细胞的量在肝脏和肺脏中较高,分别为(1.36±0.37)％和(1.6±0.7)％.结论 C57BL/6小鼠肝脏、肺脏、脾脏和肠系膜淋巴结γδT细胞的含量、表型和功能方面存在显著性差异.     

人肠道正常粘膜组织与外周血中记忆性IL-22~+T淋巴细胞频率及表型的比较

目的比较人肠道正常粘膜组织与外周血中IL-22+T淋巴细胞的频率及其表型特征。方法分离人肠道正常粘膜与外周血中单个核细胞,anti-CD3+anti-CD28刺激后,采用流式细胞术(FACS)检测IL-22的产生及其与IFN-γ、IL-17的关系,分析IL-22+T淋巴细胞CD45RO,CD62L,CCR7,CCR6,CCR10,CCR4等表面分子的表达。结果与anti-CD3+anti-CD28刺激外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞产生少量的IL-22(0.6%;0.57%)相比,肠道粘膜CD4+T细胞产生大约3.15%的IL-22,CD8+T淋巴细胞产生4%左右的IL-22。此外,肠道粘膜CD4+和CD8+T细胞中存在一群产生IL-22并独立于Th1、Th17,Tc1、Tc17的细胞亚群。肠道粘膜IL-22+T细胞表达较高比例的CD45RO,其中部分细胞表达CCR7,而较少表达CD62L。进一步研究表明,肠道粘膜CD4+IL-22+和CD8+IL-22+T细胞表达较高水平的CCR10(55.3%;73.9%),部分细胞表达CCR6或CCR4。结论人肠道正常粘膜组织中IL-22主要由效应型或中央型记忆T细胞产生,部分IL-22+T细胞独立于Th1、Th17,Tc1、Tc17细胞亚群。