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20世纪80年代以来,结核病出现疫情回潮现象,卫生部今年公布的我国传染病发病率中,结核病居首位。早期诊断、早期治疗是控制传染源并使其有效治疗的关键。用PCR技术检测临床标本中的结核杆菌,为结核病的诊断提供了快速有效的方法。在实际工作中,我们发现由于某些干扰因素的存在,组织中结核杆菌-DNA的检测仍存在诸多问题[1],模板的有效提取直接影响扩增效率。从实际应用的角度出发,我们选取了4种方法进行结核杆菌-DNA提取的比较,现报道如下。1材料与方法1·1材料选取西安交通大学第二医院活检组织中病理诊断为结核的石蜡包埋组织标本11例,… 相似文献
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背景:由于在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中对DNA造成的损害,影响了后续的聚合酶链反应等研究.选择一种简便有效且经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法成为研究者们关注和亟待解决的问题.目的:比较甲醛固定石蜡包埋组织中4种提取DNA的方法对DNA质量的影响,探讨一种操作简便、污染少、经济实用的石蜡包埋组织中提取DNA的方法.方法:取手术切除的普通甲醛固定石蜡包埋的非小细胞肺癌组织标本20例,分别以二甲苯脱蜡-酚氯仿法、改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法、试剂盒法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法提取其DNA,然后进行电泳分析、紫外分光光度计测定A260/A280比值及PCR扩增.结果与结论:改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法可获得较大的DNA片段,且两种方法与试剂盒法所提取DNA的A260/A280值相比较,均有显著性意义(P<0.05),4种方法的提取效率差异无显著性意义(P>0.1),以改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法所得DNA为模板,扩增的目的条带亮度与阳性对照相当.结果证实改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法简便有效,所用试剂价格低廉,是一种经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法. 相似文献
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石蜡包埋淋巴组织三种微量DNA提取方法的比较 总被引:5,自引:0,他引:5
目的为寻找一种高效、简便、实用的石蜡组织中DNA提取方法,本研究比较了三种不同的DNA提取方法对DNA质量的影响。方法选取淋巴相关组织的蜡块21例。三种DNA提取方法分别是简单消化煮沸法,酚/氯仿提纯法和试剂盒法。通过提取DNA的浓度和纯度、PCR扩增保守序列pglobin等方法,比较三种DNA提取方法的优劣。结果试剂盒法提取样品OD260/OD280平均比值位于1.6~1.8之间;提纯法位于1.3—1.5之间;简单消化煮沸法位于1,2—1.3之间。三种方法中,试剂盒法提取的DNA最为稳定。以3种DNA提取方法所获取DNA为模板,PCR扩增阳性率无统计学差异。结论从实用、快速、经济的角度综合分析,简单消化煮沸法简单快速,需要的组织样品少,是一个值得推荐的石蜡组织DNA提取方法。 相似文献
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一种石蜡包埋组织DNA提取方法 总被引:10,自引:0,他引:10
刘德莉 《上海医学检验杂志》2000,15(2):128-128
从石蜡包埋组织中提取基因组DNA有一定的难度。Moerkerk证明福尔马林固定对DNA有降解作用[1]。传统的二甲苯脱蜡及苯酚氯仿抽提DNA,其弊端是过程长、对人有毒、得到的DNA量仅1~2ng。如何避免DNA分子损失,保持DNA相对完整和纯度值得探讨?本人经过5年摸索,建立了一种简便有效的石蜡包埋组织DNA的提取方法。其基本原理是:用蛋白酶K及SDS、TritonX-100在Tris、EDTA保护DNA的条件下,裂解细胞、消化蛋白质,使核蛋白解聚并使细胞内本身存在的DNA酶灭活,然后用NaI沉淀DNA,玻璃粉吸附DNA,离心去除杂质以及乙醇洗涤得到5~10μgD… 相似文献
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传统方法提取石蜡包埋组织DNA ,步骤繁琐耗时。本实验室以PCR方法检测结核菌为例 ,摸索出一种不经过脱蜡及酚—氯仿抽提 ,直接提取石蜡包埋组织DNA简捷而快速的方法。1 材料与方法1.1 主要仪器 :全电脑基因扩增仪NT116 9型 (北京新技术应用研究所 ) ;低温高速离心机UNIVERAL - 16R(德国 ) ;多功能紫外透射仪 (温洲市孚华分析仪器厂 )。1.2 试剂1.2 .1 裂解液 10mmol LTrisHCL(pH8.0 ) ;2mmol LEDTA(pH8 0 ) ;0 5 %Tween - 2 0 (v v) ;0 5 %NP - 40 (v v)。1.2 .2 2 0mg … 相似文献
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石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应影响因素的研究 总被引:3,自引:2,他引:3
目的 探讨石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。方法 应用从石蜡包埋组织中提取的DNA ,PCR反应扩增甲状腺髓样癌RET基因第 11外显子 ,分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。结果 10 .0 μm× 1组织切片组 ,PCR反应循环次数 4 0次组 ,PCR反应模板量 0 .0 5 μg组PCR反应取得高质量目的基因DNA。结论 减少提取组织用量有利于减少抑制PCR物质的量 ,有利于反应的成功 ;PCR反应循环次数一般应大于 4 0次 ;PCR反应时减少模板量有利于PCR反应成功。 相似文献
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背景:在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中会对DNA造成损害,提取的DNA在用于PCR扩增时部分结果并不理想。目的:比较分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。方法:从10.0μm×2、10.0μm×4和10.0μm×5石蜡包埋食管癌组织切片中提取DNA,以0.05,0.1,0.2μg模板DNA量扩增内参基因β-actin,PCR反应循环次数分别为35,40,45次,分析影响PCR反应的因素。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳结果显示以10.0μm×2组织切片量,PCR反应循环次数40次,PCR反应模板DNA量0.05μg扩增取得的目的基因DNA的质量最高。说明减少石蜡包埋组织用量和减少模板DNA量有助于获得高质量的PCR反应条带,且PCR反应循环次数应大于40次,小于45次,再增加循环次数,则意义不大。 相似文献
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目的 定量检测石蜡包埋的淋巴瘤组织中EB病毒(EBV)的表达,方法 对TES水浴DNA提取法进行了改良,从石蜡包埋的淋巴瘤组织中提取高质量的基因组DNA,以实时荧光定量PCR方法检测淋巴瘤组织EBV。结果在60例标本中平均提取DNA量为3.97ng(10/μm厚切片2片),86.7%(52/60)标本DNA的纯度(260nm/280nm)≥1.6,其中50%(30/60)淋巴瘤组织EBV呈阳性表达(10^0~10^6拷贝/ngDNA)。结论 采用改良TES水浴法能获取石蜡包埋组织中高质量基因组DNA,使用该新的实验技术可有效地利用现有的标本资源进行与疾病相关科学的研究。 相似文献
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PCR反应体系中Mg2+浓度对从石蜡包埋组织中提取DNA进行PCR反应的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨PCR反应体系中Mg2 浓度对从石蜡包埋组织中提取DNA进行PCR反应的影响。方法 从石蜡包埋组织中提取DNA ,PCR反应扩增甲状腺髓样癌RET基因第 13外显子 ,分析PCR反应体系中Mg2 浓度分别为1 5mmol L、2 0mmol L、2 5mmol L、3 0mmol L、4 0mmol L时PCR反应产物中目的基因含量及对PCR产物基因序列测定的影响。结果 5种条件扩增的目的基因经纯化后DNA含量分别为 4 8ng μl(1 5mmol L)、2 6 6ng μl(2 0mmol L)、4 0 2ng μl(2 5mmol L)、38 5ng μl(3 0mmol L)、4 4 5ng μl(4 0mmol L) ;Mg2 浓度为 4 0mmol L时PCR产物电泳图见到多条非特异性条带 ;Mg2 浓度为 2 5mmol L时PCR产物直接测序反应曲线峰图背景噪音 (噪峰 )减小 ,信噪比 (信号 噪音 )增高。结论 从石蜡包埋组织中提取DNA行PCR反应 ,Mg2 浓度为 2 5mmol L时反应特异性强 ,PCR产物质量高。较高的Mg2 浓度可以增加PCR反应产量 ,但降低反应的特异性 相似文献
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DNA from archived FFPE can be used for papillomavirus genotyping, but potential problems include paraffin as a physical barrier, DNA cross-linking, and PCR inhibitors. To address these complications, we combined a commercially available DNA isolation kit (Qiagen DNeasy) with a heat treatment and evaluated the resulting DNA with regards to HPV typing. DNA was extracted from 10-μm sections from 150 FFPE cancer samples. One protocol followed the manufacturer's recommendation, including paraffin removal by xylene and tissue lysis at 56°C. A second section was directly incubated at 120°C and subsequently lysed at 65°C. After spin-column purification, both extracts were tested with a linear array HPV genotyping assay. Additionally, cellular DNA yield, HPV16 DNA copies, and PCR inhibitors were assessed by real-time qPCR assays. Inadequate linear array HPV genotyping assay results were significantly more frequent (P = 0.0003) in xylene-treated (29/150, 19.3%) than in heat-treated extracts (8/150, 5.3%). HPV detection also differed, with 94/150 (62.7%) and 110/150 (73.3%) positive results, respectively (P = 0.0026). The heat method also yielded more PCR-amplifiable cellular DNA (8.2-fold; P < 0.001) and HPV16 copies (6.5-fold; P = 0.009), although PCR inhibitors also had a greater effect (P = 0.035). Aggressive heat treatment demonstrated an advantage over traditional xylene purification protocols, resulting in higher DNA yields and increased sensitivity for HPV testing. 相似文献
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Heideman DA Lurkin I Doeleman M Smit EF Verheul HM Meijer GA Snijders PJ Thunnissen E Zwarthoff EC 《The Journal of molecular diagnostics : JMD》2012,14(3):247-255
Accurate mutation detection assays are strongly needed for use in routine molecular pathology analyses to aid in the selection of patients with cancer for targeted therapy. The high-resolution melting (HRM) assay is an ideal prescreening tool, and SNaPshot analysis offers a straightforward genotyping system. Our present study was determined to compare these mutation testing methods on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumor-derived DNA. We compared the performance of HRM, followed by cycle sequencing (HRM-sequencing); multiplex PCR assay, followed by SNaPshot analysis (multiplex mutation assay); and a successor assay using HRM, followed by SNaPshot (HRM-SNaPshot) for mutation analysis of both KRAS (codon 12/13/61) and BRAF (codon 600/601). In a series of 195 FFPE-derived DNA specimens, a high genotypic concordance between HRM-sequencing and multiplex mutation assay was found (κ, 0.98; 95% CI, 0.94 to 1), underlining the potential of a combined HRM-SNaPshot approach. In reconstruction experiments, the analytical sensitivity of HRM-SNaPshot was twofold to fourfold higher than HRM-sequencing and multiplex mutation assay, respectively. In addition, HRM-SNaPshot had a good performance rate (99%) on FFPE tumor-derived DNA, and mutation detection was highly concordant with the predecessor assays (κ for both, 0.98). The occurrence of BRAF and KRAS mutations is mutually exclusive. HRM-SNaPshot is an attractive method for mutation analysis in pathology, given its good performance rate on FFPE-derived DNA, high analytical sensitivity, and prescreening approach. 相似文献
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优化甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取预处理对STR分型有效性的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的通过对甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)DNA提取进行优化处理,确定满足FFPET样本进行短片段重复序列(STR)完整分型的条件。方法改变石蜡切片厚度、离心速率和时间、组织用量和消化液体积等参数提取FFPETDNA,并对提取的DNA样本进行常规STR扩增检验。结果优化方法处理后可以提取到较高质量DNA(1000bp),经扩增均可以检出性别基因座(amelogenin)和15个以上STR基因座。结论 FFPET优化方法能够提高DNA提取的质量,适合STR分型研究。 相似文献