CXC趋化因子受体6在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义

目的 研究CXC趋化因子受体6(CXCR6)在同种异体小鼠心脏移植中的表达及CXC趋化因子配体16(CXCL16)与CXCR6相互作用对移植物存活时间的影响.方法 以野生型Balb/c小鼠(H-2d)为供者(同种移植组),或以野生型C57BL/6小鼠(H-2b)为供者(同系移植组),以野生型C57BL/6小鼠为受者分别行小鼠腹腔异位心脏移植.测定同系和同种移植组小鼠移植心脏CXCR6mRNA的表达,并测定受者脾脏CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达.另制作小鼠同种异位心脏移植模型(Balb/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者),将其分为实验组和对照组,实验组受者移植当天至发生排斥反应时腹腔注射抗CXCL16抗体,对照组受者同期注射对照抗体.记录两组移植心脏存活时间.进行CD8+T淋巴细胞的细胞毒试验,即用Balb/c小鼠脾细胞免疫C57BL/6小鼠后,获取C57BL/6小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞,将Balb/c小鼠脾细胞与C57BL/6小鼠CD8+T淋巴细胞混合培养,分别加入抗CXCL16抗体、小鼠IgG(对照抗体)和抗CD40L抗体.结果 同种移植组移植心脏中CXCR6 mRNA的表达以及脾脏CD8+T淋巴细胞上CXCR6的表达均高于同系移植组和正常对照组.抗CXCL16抗体对CD8+T淋巴细胞的细胞毒活性无影响.与对照组相比较,实验组小鼠移植心脏存活时间并未明显延长.结论 小鼠心脏移植排斥反应中CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达上升,阻断CXCL16/CXCR6相互作用并不能延长移植心脏的存活时间.     

CXC趋化因子受体6在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义

目的 研究CXC趋化因子受体6(CXCR6)在同种异体小鼠心脏移植中的表达及CXC趋化因子配体16(CXCL16)与CXCR6相互作用对移植物存活时间的影响.方法 以野生型Balb/c小鼠(H-2d)为供者(同种移植组),或以野生型C57BL/6小鼠(H-2b)为供者(同系移植组),以野生型C57BL/6小鼠为受者分别行小鼠腹腔异位心脏移植.测定同系和同种移植组小鼠移植心脏CXCR6mRNA的表达,并测定受者脾脏CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达.另制作小鼠同种异位心脏移植模型(Balb/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者),将其分为实验组和对照组,实验组受者移植当天至发生排斥反应时腹腔注射抗CXCL16抗体,对照组受者同期注射对照抗体.记录两组移植心脏存活时间.进行CD8+T淋巴细胞的细胞毒试验,即用Balb/c小鼠脾细胞免疫C57BL/6小鼠后,获取C57BL/6小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞,将Balb/c小鼠脾细胞与C57BL/6小鼠CD8+T淋巴细胞混合培养,分别加入抗CXCL16抗体、小鼠IgG(对照抗体)和抗CD40L抗体.结果 同种移植组移植心脏中CXCR6 mRNA的表达以及脾脏CD8+T淋巴细胞上CXCR6的表达均高于同系移植组和正常对照组.抗CXCL16抗体对CD8+T淋巴细胞的细胞毒活性无影响.与对照组相比较,实验组小鼠移植心脏存活时间并未明显延长.结论 小鼠心脏移植排斥反应中CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达上升,阻断CXCL16/CXCR6相互作用并不能延长移植心脏的存活时间.     

CXC趋化因子受体6在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义

目的 研究CXC趋化因子受体6(CXCR6)在同种异体小鼠心脏移植中的表达及CXC趋化因子配体16(CXCL16)与CXCR6相互作用对移植物存活时间的影响.方法 以野生型Balb/c小鼠(H-2d)为供者(同种移植组),或以野生型C57BL/6小鼠(H-2b)为供者(同系移植组),以野生型C57BL/6小鼠为受者分别行小鼠腹腔异位心脏移植.测定同系和同种移植组小鼠移植心脏CXCR6mRNA的表达,并测定受者脾脏CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达.另制作小鼠同种异位心脏移植模型(Balb/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者),将其分为实验组和对照组,实验组受者移植当天至发生排斥反应时腹腔注射抗CXCL16抗体,对照组受者同期注射对照抗体.记录两组移植心脏存活时间.进行CD8+T淋巴细胞的细胞毒试验,即用Balb/c小鼠脾细胞免疫C57BL/6小鼠后,获取C57BL/6小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞,将Balb/c小鼠脾细胞与C57BL/6小鼠CD8+T淋巴细胞混合培养,分别加入抗CXCL16抗体、小鼠IgG(对照抗体)和抗CD40L抗体.结果 同种移植组移植心脏中CXCR6 mRNA的表达以及脾脏CD8+T淋巴细胞上CXCR6的表达均高于同系移植组和正常对照组.抗CXCL16抗体对CD8+T淋巴细胞的细胞毒活性无影响.与对照组相比较,实验组小鼠移植心脏存活时间并未明显延长.结论 小鼠心脏移植排斥反应中CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达上升,阻断CXCL16/CXCR6相互作用并不能延长移植心脏的存活时间.     

门静脉输注供者脾细胞诱导的供者特异性免疫低反应性

目的 探讨经门静脉输注供者脾细胞能否诱导皮肤移植小鼠产生供者特异性的免疫低反应性及其可能机制.方法 取Balb/c小鼠,随机分为空白对照组(经小鼠门静脉输注RPMI 1640培养液)、受者脾细胞组(经小鼠门静脉输注Balb/c小鼠脾细胞)、供者脾细胞组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞)、空白移植对照组(经小鼠门静脉输注RPMI 1640培养液,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)、实验对照组(经小鼠门静脉输注Balb/c小鼠脾细胞,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)、实验组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)以及第三方移植组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞,7 d后移植C3H小鼠的皮肤).记录空白移植对照组、实验对照组、实验组和第三方移植组移植皮肤的存活时间,并观察移植皮肤的病理学变化;脾细胞输注后7 d,分别获取空白对照组、受者脾细胞组和供者脾细胞组小鼠的外周血、脾脏和肝脏,用流式细胞仪测定样本中CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞)的比例.结果 实验组移植皮肤的存活时间为(19.8±4.6)d,明显长于空白移植对照组、实验对照组和第三方移植组,但仍未达到长期存活.皮肤移植后7 d,空白移植对照组和实验对照组的移植皮肤呈现重度急性排斥反应的病理学改变,而实验组移植皮肤呈现中度急性排斥反应的病理学改变.供者脾细胞组外周血、肝脏和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例明显高于空白对照组和受者脾细胞组.结论 门静脉输注供者脾细胞可特异性地延长供者皮肤移植物的存活时间,减轻移植物的排斥反应,该效应可能与受者体内的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增加有关.     

混合培养的供、受者骨髓细胞过继回输延长小鼠移植心脏存活时间

目的 将供、受者骨髓细胞经混合培养后过继回输,以观察其对同种异体移植心脏存活时间和受者免疫功能的影响.方法 取Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠的骨髓细胞,进行混合培养.配制含Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠脾淋巴细胞的混合淋巴细胞反应体系(MLR)以及含Balb/c小鼠和C3H小鼠脾淋巴细胞的MLR,分别加入混合培养的骨髓细胞,观察其对MLR中细胞增殖的影响.以C57BL/6J小鼠为供者,Balb/c小鼠为受者行腹腔异位心脏移植,实验分为4组:(1)移植对照组,受者仅进行心脏移植,不作其他处理;(2)实验对照组,心脏移植后给予西罗莫司灌胃;(3)实验组,移植手术结束前注射混合培养的骨髓细胞1×10~7个,术后给予西罗莫司;(4)第三方对照组,受者接受C3H小鼠的移植心脏,手术结束前注射混合培养的骨髓细胞1×10~7个,术后给予西罗莫司.记录移植心脏存活时间;移植心脏停跳当日,取受者外周血,检测CD4~+ CD25~+ T淋巴细胞的比例及供者来源的H-2K~b细胞的比例.结果 加入混合培养的骨髓细胞后,Balb/c和C57BL/6J的MLR的淋巴细胞增殖率低于Balb/c和C3H的MLR.实验组移植心脏的存活时间长于其他3组(P<0.05).实验组CD4~+CD25~+T淋巴细胞的百分率高于其他3组(P<0.05).实验组外周血中H-2K~b细胞的比例高于其他3组(P<0.05).结论 受者输注混合培养的供、受者骨髓细胞可在一定程度上调节免疫应答,延长小鼠移植心脏的存活时间,该作用具有供者抗原特异性.     

酶联免疫斑点技术在心脏移植术后早期诊断急性排斥反应中的作用

目的 探讨酶联免疫斑点技术(ELISPOT)在心脏移植术后早期诊断急性排斥反应中的作用及在供者评估方面的应用价值.方法 采用小鼠腹部心脏移植模型,将实验小鼠分为3组,每组25对.(1)移植排斥组:供者为C57BL/6小鼠,受者为BALB/c小鼠,移植后无特殊处理;(2)实验处理组:供者为C57BL/6小鼠,受者为BALB/c小鼠,受者在移植术前1天经尾静脉输注特异性供者脾细胞,术前1 d及术后1周按每克体重应用环孢素A 5 μg;(3)同系移植组:供、受者均为BALB/c小鼠,移植术后无特殊处理.术后观察移植心存活时间及病理改变;应用ELISPOT技术检测受者脾细胞悬液中供者γ干扰素(IFN-γ)活性分泌细胞频数.结果 移植排斥组和实验处理组移植心平均存活时间分别为(7.8±0.77)d和(14.80±1.01)d,同系移植组存活时间均超过28 d,各组之间的差异有统计学意义(P＜0.05).移植排斥组与实验处理组和同系移植组相比较,移植心的心肌细胞变性坏死严重,并有大量炎性细胞浸润.移植术后第4天,移植排斥组、实验处理组和同系移植组受者脾细胞悬液中供者特异性IFN-γ活性分泌细胞频数分别为(288±16)个/2×105、(32±10)个/2×105和(6±2)个/2x105;第7天为(416±19)个/2×105、(44±8)个/2×105和(7±2)个/2×105;其与相应的移植心存活时间存在明显负相关,而与术后第7天病理分级存在明显正相关.结论 应用ELISPOT技术检测受者术后早期供者特异性IFN-γ活性分泌细胞频数可作为急性排斥反应的一个早期诊断指标.此技术具有较高的灵敏性与特异性,可用于术前供者配型.     

供者特异性抗原静脉输注联合抗γ链单克隆抗体诱导小鼠皮肤移植物免疫耐受

目的　探讨静脉输注供者特异性抗原联合抗白细胞介素2受体(IL 2R)γ链单克隆抗体诱导移植免疫耐受的可行性。方法　在C57BL/6小鼠建立H Y皮肤移植模型,术前7 d给予5×106个供者脾细胞静脉输注,并分别于术前6 d和4 d给予抗白细胞介素2受体γ链单克隆抗体(4G3、3E12及TUGm2各0.5 mg)和抗IL 2Rβ单克隆抗体(TM β1,0.5 mg)混合液2.0 mg腹腔注射,以单纯行H Y皮肤移植模型和静脉输注供者特异性抗原的H Y皮肤移植模型为对照,观察皮肤移植物的存活时间。结果　联合给予抗白细胞介素2受体γ链单克隆抗体和供者特异性抗原输注组的皮肤移植物存活时间均超过100 d,显著长于单纯H Y皮肤移植组的33.42 d(P<0.01)及仅输注供者特异性抗原H Y皮肤移植组的14.71 d(P<0.01)。结论　在H Y皮肤移植模型中,静脉输注供者特异性抗原联合抗白细胞介素2受体γ链单克隆抗体可以成功地诱导受者对皮肤移植物的免疫耐受。     

记忆性CD4+T淋巴细胞对小鼠腹腔移植心脏排斥反应的影响

目的 探讨记忆性CD4+T淋巴细胞对来自同一抗原特异性移植心脏急性排斥反应的影响.方法 将C57BL/6小鼠的皮肤移植给Balb/c小鼠,使其致敏,3个月后,取受者的脾脏,应用小鼠记忆性CD4+T淋巴细胞纯化试剂盒纯化记忆性CD4+T淋巴细胞.同时取未进行皮肤移植的Balb/c小鼠,同法获取非致敏CD4+T淋巴细胞.以C57BL/6小鼠为供者,正常Balb/c小鼠为受者,行腹腔心脏移植,移植前3周,实验组受者经阴茎背静脉注射记忆性CD4+T淋巴细胞;非致敏对照组受者经阴茎背静脉注射非致敏CD4+T淋巴细胞;空白对照组不注射任何T淋巴细胞.各组均于移植前1 d、移植当天及移植后1 d给予环孢素A.术后记录移植心脏存活时间;取移植心脏,进行病理学观察.结果 实验组、非致敏对照组和空白对照组移植心脏存活时间分别为(8.5±1.5)d、(25.7±5.5)d和(21.2±9.2)d,实验组明显短于另两组(P<0.05).移植心脏急性排斥反应的病理学分级,实验组为3.43±0.68,非致敏对照组为1.29±0.46,空白对照组为1.31±0.49,实验组病理学分级明显高于非致敏对照组和空白对照组(P<(0.05).结论 当记忆性CIN+T淋巴细胞再次接触同一抗原特异性的移植心脏时,可促进急性排斥反应的发生,且对常规剂量的环孢素A不敏感.     

CXC趋化因子受体6在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义

目的 研究CXC趋化因子受体6(CXCR6)在同种异体小鼠心脏移植中的表达及CXC趋化因子配体16(CXCL16)与CXCR6相互作用对移植物存活时间的影响.方法 以野生型Balb/c小鼠(H-2d)为供者(同种移植组),或以野生型C57BL/6小鼠(H-2b)为供者(同系移植组),以野生型C57BL/6小鼠为受者分别行小鼠腹腔异位心脏移植.测定同系和同种移植组小鼠移植心脏CXCR6mRNA的表达,并测定受者脾脏CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达.另制作小鼠同种异位心脏移植模型(Balb/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者),将其分为实验组和对照组,实验组受者移植当天至发生排斥反应时腹腔注射抗CXCL16抗体,对照组受者同期注射对照抗体.记录两组移植心脏存活时间.进行CD8+T淋巴细胞的细胞毒试验,即用Balb/c小鼠脾细胞免疫C57BL/6小鼠后,获取C57BL/6小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞,将Balb/c小鼠脾细胞与C57BL/6小鼠CD8+T淋巴细胞混合培养,分别加入抗CXCL16抗体、小鼠IgG(对照抗体)和抗CD40L抗体.结果 同种移植组移植心脏中CXCR6 mRNA的表达以及脾脏CD8+T淋巴细胞上CXCR6的表达均高于同系移植组和正常对照组.抗CXCL16抗体对CD8+T淋巴细胞的细胞毒活性无影响.与对照组相比较,实验组小鼠移植心脏存活时间并未明显延长.结论 小鼠心脏移植排斥反应中CD8+T淋巴细胞CXCR6的表达上升,阻断CXCL16/CXCR6相互作用并不能延长移植心脏的存活时间.

Abstract：

Objective To investigate the expression of CXCR6 in allograft rejection and effect of CXCL16/CXCR6 interaction on allograft survival Methods Intra-abdominal heterotopic heart transplantation was performed using wild type (WT) Balb/c mice (H-2d) (allogeneic) as donors or WT C57BL/6 mice (B6, H-2b) (syngeneic) as donors, and using WT B6 mice as recipients. The intragraft expression of CXCR6 and expression of CXCR6 in CD8+ T cells of the spleens from syngeneic and allogeneic recipients were examined. The allogeneic recipients were further divided into the experimental group (n = 5) and control group (n = 6) randomly. The experiment group and control group were injected with anti-CXCL16 mAb or control mAb respectively until rejection occurred. The cardiac allograft survival in experimental group and control group was evaluated. Results Rejected allografts showed higher expression of CXCR6 than syngeneic cardiac grafts. More importantly,expression of CXCR6 in CD8+ T cells was also up-regulated by allograft rejection. However, injection of anti-CXCL16 mAb could not inhibit cytotoxic activity of CD8+ T cells. Moreover, experimental group could not prolong the cardiac graft survival time as compared with control group. Conclusion Expression of CXCR6 in CD8+ T cells is up-regulated in allograft rejection.     

术前输注供者脾细胞联合应用西罗莫司延长小鼠移植心存活时间的机理

目的探讨移植术前输注供者脾细胞(DST)联合应用西罗莫司(SRL)延长小鼠移植心存活时间的机理。方法单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞及静脉输注的脾细胞均采用经丝裂霉素C处理后失去增殖活性的Balb/c(H-2~d)小鼠脾细胞(包括体外实验和体内实验)。(1)体外实验:分为3组,空白对照组:取正常C57BL/6(H-2~b)小鼠(B6小鼠)的脾细胞作为反应细胞;SRL组:取用SRL(1.5μl·g~(-1)·d~(-1))灌胃7 d后的B6小鼠脾细胞作为反应细胞;DST SRL组:取行脾细胞静脉输注8 d、次日予SRL(1.5μl·g~(-1)·d~(-1))灌胃7 d后的B6小鼠的脾细胞作为反应细胞。观察各组在单向混合培养中的脾细胞增殖能力。(2)体内实验:Balb/c小鼠为供者,B6小鼠为受者,建立颈部异位心脏移植模型。实验分为3组,空白对照组:单纯行心脏移植;DST组:受者移植前8 d给予供者脾细胞静脉输注;DST SRL组:受者移植前8 d给予供者脾细胞静脉输注,次日予以SRL灌胃7d(1.5μl·g~(-1)·d~(-1))。术后观察各组移植心的存活时间、病理表现、受者淋巴细胞中CD4~ CD25~ 调节性T细胞(Tr细胞)和凋亡细胞比例的改变及同种抗原刺激后增殖活性变化。结果体外实验中,DST SRL组反应细胞增殖活性平均为(13.76±2.81)%,明显低于空白对照组(28.14%±5.53%,P<0.05)。体内实验中,空白对照组、DST SRL组以及DST组移植心平均存活时间分别为(8.6±0.48)d、(35±14.4)d和(4.83±0.52)d,DST SRL组存活时间显著延长(P<0.05);流式细胞术(FACS)分析显示DST SRL组脾细胞中CD4~ CD25~ Tr细胞比例平均为(3.39±0.21)%,明显高于空白对照组(1.57%±0.3%,P<0.05)。结论移植术前输注供者脾细胞联合应用西罗莫司可通过清除同种反应性T细胞克隆,增加受者体内CD4~ CD25~ Tr细胞的比例,减低对同种抗原的应答能力,从而延长同种小鼠移植心存活时间。     

探讨抗γ公共链单抗诱导移植免疫耐受的作用机制

目的探讨抗γ公共链单抗在诱导移植免疫耐受中的作用机制。方法将实验动物分为2组,每组20只。实验组:在Balb/c裸小鼠(H-2d)体内用CFSE标记的Balb/c小鼠(H-2d)T细胞(3×107个)重建其免疫系统,同时给予经丝裂霉素C处理的供者C57BL/6小鼠(H-2b)脾细胞(5×106个)静脉输注,24h后实验组受鼠经腹腔注射抗γc单克隆抗体(4G3,3E12,TUGm2,各0.5mg)和抗白细胞介素2受体(IL-2R)β链单克隆抗体(TM-β1,0.5mg)混合液;对照组:以IgG2a2.0mg作为同型对照代替抗体腹腔注射,余处理与实验组相同。经上述处理后12h和48h后处死受鼠,取其脾细胞及外周血,利用流式细胞技术检测T细胞的增殖及凋亡。结果经抗体处理12h和48h后,实验组T细胞未发生明显增殖;而对照组两时间点均可观察到CFSE标记细胞荧光强度明显地减低,表明T细胞发生了分裂增殖。同时AnnexinV法可见,实验组标记有CD3-PE单抗的T细胞12h发生了明显的凋亡,但48h却几乎无明显的凋亡细胞;而对照组两时间点则均未检测到明显的细胞凋亡。两组间12h结果差异有统计学意义(P<0.01),但48h差异无统计学意义(P>0.05)。结论移植术前给予抗γ公共链单抗联合供者细胞特异性输注,通过有效抑制针对供者抗原发生效应的T细胞增殖,可进一步促使其发生凋亡而被有效清除,从而最终实现免疫耐受,且此种耐受具有抗原特异性。     

输注负载胎盘滋养层细胞抗原的受者aaDC延长小鼠移植心的存活时间

目的 探讨输注负载供者胎盘滋养层细胞抗原的受者耐受性选择性激活树突状细胞(aaDC)对小鼠移植心存活时间的影响.方法 雌性Balb/c小鼠和雄性C57BL/6小鼠合笼后,获取雌鼠胎盘滋养层细胞,并提取其抗原.体外制备Balb/c小鼠的aaDC,分别与滋养层细胞抗原或者C57BL/6小鼠脾细胞抗原共培养,获得负载滋养层细胞抗原或者C57BL/6小鼠脾细胞抗原的aaDC,测定培养液中白细胞介素10(IL-10)和IL-12的含量以及aaDC表面CD40、CD80、CD86和主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子的表达.取Balb/c小鼠,分别接受负载滋养层细胞抗原或者C57BL/6小鼠脾细胞抗原的aaDC输注(滋养层细胞抗原组和脾细胞抗原组),7 d后接受C57BL/6小鼠心脏异位移植,以注射生理盐水者为对照组,输注负载滋养层细胞抗原aaDC后接受昆明小鼠心脏移植者为第三供者对照组.术后记录移植心存活时间,并检测受者脾脏和移植心组织中IL-2、IL-10和γ干扰素(IFN-7)mRNA的表达.结果 负载脾细胞抗原的aaDC,CD86和MHCⅡ类分子的表达明显升高,而负载滋养层细胞抗原的aaDC,仅MHCⅡ类分子表达升高.滋养层细胞抗原aalDC的培养液中,IL-10为(122.6±15.4)ng/L,IL-12为(232.8±25.4)ng/L,空白对照aaDC的IL-10和IL-12分别为(35.4±8.5)ng/L和(267.3±12.5)ng/L,二者间IL-10的差异有统计学意义(P<0.05),而IL-12的差异无统计学意义(P>0.05).脾细胞抗原aaDC培养液中的IL-10和IL-12与空白对照aaDC相近,差异均无统计学意义(P>0.05).对照组移植心存活时间为(6.73±0.58)d,脾细胞抗原组为(12.28±0.76)d,滋养层细胞抗原组为(38.83±2.79)d,第三供者对照组为(6.68±0.62)d.滋养层细胞抗原组移植心存活时间明显长于脾细胞抗原组和对照组(P<0.01),而第三供者对照组和对照组间移植心存活时间的差异无统计学意义(P>0.05).结论 预先输注负载供者胎盘滋养层细胞抗原的受者aaDC,可延长小鼠移植心的存活时间.     

基因工程Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和GVL效应的影响

目的 探讨输注慢病毒载体介导的小鼠基因工程调节性T淋巴细胞(Treg细胞)对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)及移植物抗白血病(GVL)效应的影响.方法 利用慢病毒载体介导,将小鼠叉状头螺旋转录因子(Foxp3)基因转导入Balb/c小鼠的CD4+CD25-T淋巴细胞,即为基因工程Treg细胞.以Balb/c小鼠为供者.C57BL/6小鼠为受者,进行异基因骨髓移植,移植当天受者接受X线直线加速器全身照射.用随机数字表法将受者分为5组,每组10只.(1)单纯照射组:经受者尾静脉输注RPMI 1640培养液0.2 ml;(2)白血病对照组:经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个+C57BL/6小鼠T淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞株(EL4细胞)500个;(3)移植对照组:经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个+脾细胞5×106个+EL4细胞500个;(4)工程Treg组:经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个+脾细胞5×106个+EL4细胞500个+基因工程Treg细胞5×106个;(5)空载体对照组:经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个+脾细胞5×106个+EL4细胞500个+空载体转导的CD4+CD25-T淋巴细胞5×106个.每天观察受者存活情况;记录GVHD及白血病的发生情况;各组均于小鼠濒死前取其肝脏、小肠、皮肤、脾脏等组织,进行病理学观察;取长期存活(超过60 d)受者的骨髓细胞,检测嵌合情况.结果 单纯照射组、白血病对照组、移植对照组、工程Treg组和空载体对照组小鼠存活时间分别为(10.3±1.5)d、(20.7±1.9)d、(26.0±4.3)d、(49.0±17.7)d和(24.4±4.1)d,工程Treg组小鼠存活时间明显长于其他各组,差异有统计学意义(P＜0.05).白血病对照组小鼠肝、脾组织病理切片均存在白血病细胞浸润表现,移植对照组及空载体对照组小鼠肝脏、皮肤和小肠病理切片存在GVHD病理改变,而工程Treg组长期存活小鼠各组织病理切片结构基本正常,未见GVHD及白血病细胞浸润病理表现,该组GVHD评分明显低于移植对照组及空载体对照组.结论 小鼠异基因骨髓移植时联合输注基因工程Treg细胞可有效减少GVHD的发生并保留GVL效应.     

凋亡抑制蛋白Survivin在移植物内T淋巴细胞中的表达及意义

目的 观察T淋巴细胞在体内和体外接受同种抗原刺激后凋亡抑制蛋白Survivin的表达规律并探讨其意义.方法 实验分三个部分.(1)体外实验中以刀豆素A(ConA)10 mg/L刺激C57BL/6小鼠脾细胞并进行培养,然后加入抗白细胞介素2(IL-2)受体的单克隆抗体阻断细胞增殖,最后检测脾细胞中Survivin表达的情况.(2)通过对Balb/c×C57BL/6杂交F1代小鼠输注C57BL/6小鼠脾细胞建立移植物抗宿主反应(GVHR)模型;并于不同时间点检测供者淋巴细胞中Survivin的表达.(3)选取临床移植肾穿刺活检标本73例,按移植肾Banff 97活检病理学诊断和分级标准对标本进行病理诊断和分级,并检测Survivin表达.结果 ConA刺激后脾细胞中CD3阳性细胞表达Survivin,第3天阳性细胞数目达到峰值,随后逐渐减少.GVHR小鼠于输注脾细胞后第4天,肝脏门静脉周围和汇管区出现淋巴细胞浸润并表达Survivin,可维持到第12天;第14天即不能检测到浸润淋巴细胞表达Survivin.对移植肾穿刺活检标本的检测发现,未诊断为急性细胞性排斥反应的13例标本淋巴细胞Survivin表达均呈阴性;而诊断为急性细胞性排斥反应的60例标本中有44例Survivin表达阳性(73%),两者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 T淋巴细胞激活后可表达Survivin,且表达具有时间依赖性.鉴于T淋巴细胞表达Survivin的特性,移植物内T淋巴细胞表达Survivin可用于鉴别是否存在排斥反应,以及排斥反应所处的阶段.     

HSV-sr39TK-GCv/ACV系统抑制小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病

目的 研究突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶一更昔洛韦/阿昔洛韦(HSV-sr39TK-GCV/ACV)系统对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响.方法 采用改良的磷酸钙沉淀法,以携带HSv-sr39TK基因的慢病毒感染C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞.制得sr39TK+T淋巴细胞.以C57BL/6小鼠为供者,Balb/c小鼠为受者进行骨髓移植,受者移植前接受60>Coγ射线照射.实验分6组进行:(1)GCV组共30只小鼠,均于骨髓移植的同时输注sr39TK+T淋巴细胞.其中10只于骨髓移植当天至第6天腹腔注射GCV 0.5 mg/d,10只于骨髓移植后第7～13天腹腔注射GCV0.5 mg/d,10只于骨髓移植后第12～18天腹腔注射GCV 0.5 nag/d;(2)ACV组共30只小鼠,骨髓移植与sr9TK+T淋巴细胞输注同GCV组,其中10只于骨髓移植当天至第6天腹腔注射ACV 0.5mg/d,10只于骨髓移植后第7～13天腹腔注射ACV 0.5 mg/d,10只于骨髓移植后第12～18天腹腔注射ACV 0.5 mg/d;(3)移植对照组仅行骨髓移植;(4)脾细胞对照组行骨髓移植和脾淋巴细胞输注;(5)GCV对照组在脾细胞对照组的基础上于骨髓移植后第7～13天腹腔注射GCV 0.5 mg/d.(6)sr39TK对照组行骨髓移植和sr9TK+T淋巴细胞输注.观察各组受者的存活时间、GVHD的发生情况及程度.结果 GCV对照组、sr9TK对照组、睥细胞对照组和移植对照组小鼠均于骨髓移植后19 d内死亡.GCV组移植当天用药者、第7天用药者和第12天用药者的存活时间分别为(36.70±5.20)d、(40.30±4.69)d和(27.10±4.85)d.ACV组移植当天用药者、第7天用药者和第12天用药者的存活时间分别为(36.50±5.26)d、(46.20±3.61)d和(30.90±5.21)d.GCV组和ACV组受者的存活时间均长于4个对照组(P<0.01),GCV组和ACV组中第7天用药者的存活时间和5(1 d存活率优于其它各时间用药者,差异有统计学意义(P<0.05),而ACV组第7天用药者又明显优于GCV组第7天用药者(P<0.05).4个对照组小鼠移植后10～12 d均开始出现Ⅲ～Ⅳ级GVHD.GCV组和ACV组死亡小鼠可见Ⅱ～Ⅳ级GVHD.而该两组中长期存活受者仅有Ⅰ～Ⅱ级GVHD.结论 HSV-sr9TK-GCV/ACV系统对小鼠异基因骨髓移植后的GVHD有一定的抑制作用;ACV的效果优于GCV;移植后7 d时应用ACV的效果较佳.     

阻断T细胞生长因子信号通路治疗移植物抗宿主病

目的探讨通过抗γ公共链单克隆抗体封闭T细胞生长因子受体治疗小鼠移植物抗宿主病(GVHD)的效果。方法通过混合淋巴细胞培养观察抗γ公共链抗体在体外对T细胞的抑制作用。经静脉输注C57BL／6(H-2b)脾细胞给F1代小鼠(C57BL／6×Balb／cH-2b/d),建立移植物抗宿主病模型。对GVHD模型小鼠短期内给予抗γ公共链抗体,一共3次,并观察其治疗效果。结果抗γ公共链抗体可抑制T细胞增殖,使凋亡细胞数增加及M期细胞数下降。输注同种脾细胞能成功建立急性GVHD模型,主要引起肝脏损伤的病理改变。单次注射抗γ公共链抗体可使GVHD小鼠肝内浸润的淋巴细胞发生凋亡;短期内连续3次注射抗γ公共链抗体可使丙氨酸转氨酶、天冬氮酸转氨酶明显低于对照组(P<0．05),但肝内仍然可观察到淋巴细胞浸润。结论体外阻断T细胞生长因子受体途径可以完全清除反应性T细胞,亦适用于GVHD治疗;但短期治疗不能完全清除反应性T细胞。     

输注转染FasL基因的供者树突状细胞减轻小鼠心脏移植排斥反应

目的 探讨转染FasL基因的供者树突状细胞(DC)对小鼠心脏移植排斥反应的影响.方法 分离并培养C57BL/6小鼠骨髓DC,然后采用脂质体法以自行构建的pTracer-FasL真核表达质粒转染DC.以C57BL/6小鼠为供者,Balb/c小鼠为受者,将其分为转染组(n=12)、未转染组(n=12)及移植对照组(n=12).转染组小鼠心脏移植前7 d经阴茎背静脉注射1×106个转染FasL基因的供者DC;未转染组小鼠心脏移植前7 d经阴茎背静脉注射1×106个未转染的供者DC;移植对照组仅行心脏移植,不接受供者DC输注.供心均移植于受者腹腔内.各组中,6只小鼠用于观察移植心脏存活时间,另6只于术后7 d处死,取移植心脏,进行组织学观察及移植心脏排斥反应病理分级.结果 转染组、未转染组和移植对照组小鼠移植心脏存活时间的中位数分别为20 d、8.5 d和9 d,转染组移植心脏的存活时间明显长于未转染组和移植对照组(P＜0.01).转染组中,2只排斥反应的病理分级为0级,4只为1级;未转染组中,2只为2级,4只为3级;移植对照组中,1只为2级,5只为3级.转染组排斥反应的病理分级明显低于移植对照组(P＜0.01).结论 受者于心脏移植前输注转染FasL基因的供者DC,可有效延长移植心脏的存活时间,并减轻排斥反应的程度.     

MyD88及Trif对心脏移植小鼠体内供者特异性抗体及记忆性T淋巴细胞的影响

目的 探讨髓样分化因子88( MyD88)及Trif对皮肤移植预致敏的心脏移植小鼠体内供者特异性抗体(DSA)及记忆性T淋巴细胞的影响.方法 实验分为空白组(C57BL/6野生型小鼠,不行移植手术)、对照组(C3H小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者)和实验组(C3H小鼠为供者,MyD88及Trif基因敲除的C57BL/6小鼠为受者).将C3H小鼠皮片移植给受鼠,进行预致敏,2周后检测受鼠血清中 DSA的水平,并且将C3H小鼠心脏移植给相应受鼠,观察移植心脏存活时间.在观察终点时,再次检测受鼠血清中DSA水平,同时检测受鼠脾脏中记忆性T淋巴细胞的比例.结果 皮肤移植2周后,实验组受鼠DSA IgG2水平低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),DSA IgG1和IgG3的水平亦低于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05).心脏移植3d后,与对照组相比较,实验组受鼠DSA IgG2水平明显降低(P＜0.01),受鼠脾脏中CD4+和CD8+记忆性T淋巴细胞的比例低于对照组(P＜0.01,P＜0.05).两组受鼠心脏移植后平均存活时间的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 敲除小鼠MyD88及Trif基因虽然不能延长预致敏小鼠移植心脏的存活时间,但是能显著降低受鼠血清中DSA的水平及脾脏中记忆性T淋巴细胞的比例.     

Ly49A转基因淋巴细胞对异基因骨髓移植后GVHD和GVL的影响

目的　观察Ly49A基因转染淋巴细胞对异基因骨髓移植后移植物抗宿主病 (GVHD)和移植物抗白血病效应 (GVL)的影响。方法　经逆转录病毒介导将Ly49A基因转染至C57BL/ 6小鼠的淋巴细胞 ,以C57BL/ 6(H 2 b)小鼠为供者 ,以接种EL961 1红白血病细胞的BALB/c(H 2 d)小鼠为受者 ,进行脾淋巴细胞和骨髓细胞联合移植 ,建立异基因急性GVHD模型 ,观察Ly49A基因转染的淋巴细胞对GVHD和GVL的影响。结果　在未进行移植的单纯照射组 ,小鼠的存活时间为 (6 .50±2 .41 )d ;仅以环磷酰胺治疗的小鼠存活时间为 (2 0 .90± 2 .88)d ;非转染淋巴细胞和骨髓细胞联合移植组的存活时间为 (1 7.1 0± 4 .65)d ;空载体转染淋巴细胞和骨髓细胞联合移植组的存活时间为(1 7.40± 5 .32 )d ;Ly49A转染淋巴细胞与骨髓细胞联合移植组的存活时间为 (35 .2 0± 1 2 .52 )d ,较上述各组明显延长 (P =0 .0 0 0 )。结论　Ly49A基因转染的淋巴细胞在异基因骨髓移植模型上具有一定程度的降低GVHD并保留GVL的作用     

非清除性异基因骨髓移植后输注供者淋巴细胞诱导的GVHD和GVL效应

目的　探讨非清除性异基因骨髓移植后输注逐渐增量的异基因供者淋巴细胞 ,是否能在减轻移植物抗宿主病 (GVHD)的同时保留移植物抗白血病效应 (GVL)。方法　L6 15白血病小鼠(H 2 k)为受者 ,于接种白血病细胞后的第 3d接受60 Coγ射线全身照射 ,总剂量 5Gy ,照射当天移植BALB/c小鼠 (H 2 d)的骨髓细胞 (3× 10 7个 )和脾细胞 (1× 10 7个 ) ,移植后 2d腹腔注射环磷酰胺 2 0 0mg/kg ,并分别于移植后 14d或 14、2 1、2 8d输注 2× 10 7个和 1× 10 7、2× 10 7、4× 10 7个供鼠脾细胞。结果　未处理的对照组受鼠平均存活时间为 (14 .1± 1.1)d ,均死于白血病 ;移植后未接受供鼠脾细胞组的小鼠平均存活 (2 6 .2± 3.6 )d ,均死于白血病复发 ;移植后 14d接受供鼠脾细胞输注的小鼠平均存活 (2 9.3± 3.7)d ,均死于GVHD ;移植后输注逐渐增量的供鼠脾细胞者 ,平均存活 (5 9.4± 5 .6 )d ,6 0 %的受者存活超过 5 0d ,均未发生GVHD。结论　非清除性异基因骨髓移植后输注逐渐增量的异基因供者淋巴细胞可在减轻GVHD的同时保留抗白血病效应。