早期分泌性靶抗原6在结核性脑膜炎患者诊断中的意义

目的:探讨早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)在结核性脑膜炎(TBM)诊断中的意义。方法:选择32例结核性脑膜炎患者为研究组,同期30例非结核性脑膜炎患者为对照组,分别检测比较两组患者脑脊液腺苷脱氨酶(ADA)及ESAT-6水平。结果:研究组患者ESAT-6阳性率84.38%,ADA阳性率63.33%;对照组患者的ESAT-6阳性率6.25%,ADA阳性率10%,研究组患者的EAST-6及ADA阳性率高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:检测脑脊液EAST-6阳性对结核性脑膜炎诊断具有较高临床参考价值。     

结核分枝杆菌ESAT-6诊断抗原基因的克隆及同源性分析

目的 获得结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,进行DNA测序、同源性分析,为筛选结核病候选诊断抗原基因奠定基础.方法 以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析.结果 成功扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由288bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为90%.结论 成功克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,测序结果表明该片段阅读框完整.     

ESAT-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ在结核性脑膜炎辅助诊断中的意义

目的 分析临床辅助诊断结核性脑膜炎患者中ESAT-6(早期分泌靶抗原6)、IL-10(白细胞介素-10)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IFN-γ(干扰素-γ)的应用意义.方法 选取2018年12月至2020年6月本院接收的114疑似颅神经疾病患者作为研究对象,根据临床诊断结果分为研究组(结核性脑膜炎患者,n=57)...     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用

【目的】研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）分泌蛋白ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kD）对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机理。【方法】应用流式细胞仪分析稳定表达ESAT-6和经重组ESAT-6蛋白作用的小鼠RAW264.7细胞的凋亡;应用Caspase-3检测试剂盒检测caspase-3活性变化;进一步应用Western blotting分析稳转细胞系ESAT-6表达情况。【结果】RAW-EGFP-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和RAW-EGFP细胞系（P〈0.05）;RAW-flag-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和相应对照细胞系（P〈0.01）。10μg/ml重组ESAT-6可显著诱导RAW264.7细胞凋亡,而5μg/ml重组ESAT-6无明显诱导细胞凋亡效果。稳转细胞系RAW-flag-ESAT-6细胞内flag-ESAT-6浓度大约只有500 ng/ml。【结论】胞内低水平表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡。     

脑脊液单核细胞内结核抗原检测对结核性脑膜炎早期诊断的意义

目的：研究脑脊液单核细胞内结核抗原检测对于结核性脑膜炎的早期诊断价值。方法选择58例结核性脑膜炎患者作为观察组,选择本院同期非结核性脑膜炎患者58例作为对照组,取2组的脑脊液标本进行脑脊液细胞学检查,比较2组的检查结果。结果观察组的中性粒细胞、激活单核细胞以及淋巴样细胞均较对照组显著升高（P<0.05）;观察组的脑脊液单核细胞中具有结核菌素抗原,检查阳性率为82.8%（48/58）,显著高于对照组的1.7%（1/58）（P<0.05）。结论脑脊液单核细胞中结核抗原的检测有利于早期诊断结核性脑膜炎。     

结核性脑膜炎早期实验诊断的研究

应用免疫印迹方法证实兔抗卡介苗与其它细菌抗原(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌)间的交叉反应,并以亲和吸附方法将金葡萄交叉反应抗体从市售抗卡介苗中加以去除而提高其特异性,建立了竞争抑制的ELISA方法,可以检测10ng水平的结核杆菌抗原。     

重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌ESAT-6。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序。将esat-6基因亚克隆至pET-28a,构建pET-esat-6重组质粒,转化入大肠杆菌BL21感受态,PCR和双酶切鉴定阳性克隆,经IPTG诱导表达,用His-bindTM亲和层析柱纯化ESAT-6,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:PCR扩增出esat-6基因的特异片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,并在BL21获得表达,纯化的ESAT-6能被结核病人血清所识别。结论:成功克隆和表达获得重组蛋白ESAT-6。     

小儿结核性脑膜炎的早期诊断

<正> 1983年4月至1992年6月我院收治67例小儿结核性脑膜炎(以下简称结脑)。现就其早期诊断讨论如下: 临床资料一、一般情况本组男40例,女27例;年龄3月～14岁;春季发病34例(50.7％);县以下农村病例64例(95.5％)。67例中43.3％有结核接触史,其中3岁以下患儿66.7％有结核接触史,年龄与阳性接触史问差异显著(X~2=12.44,P<0.001),家庭接触史占阳性接触史的72.4％。80.6％患儿未接种过卡介苗。二、临床表现发热、厌食、呕吐、头痛和精神改变(嗜睡或     

ESAT-6诱导的外周血单个核细胞γ-干扰素反应对结核性脑膜炎的诊断价值

目的 探讨6-kDa早期分泌靶抗原(ESAT-6)刺激的外周血单个核细胞(PBMC) γ-干扰素(IFN-γ)反应对结核性脑膜炎的诊断价值.方法 研究对象共82例,其中结核性脑膜炎组20例,病毒性脑膜炎组25例,一般细菌性脑膜炎组17例,并设健康对照组20例.Ficoll法分离PBMC并培养,分别以ESAT-6、纯化结核菌素(PPD)、植物血凝素(PHA)和生理盐水处理.ELISA法测定各组上清IFN-γ浓度.结果 ESAT-6处理引起结核性脑膜炎组显著的IFN-γ反应(与生理盐水处理相比P＜0.01).PPD刺激在结核性脑膜炎组亦均引起IFN-γ升高反应(与生理盐水处理相比P＜0.01),但程度低于ESAT-6处理,差异有统计学意义(P＜0.01).ROC曲线分析显示,ESAT-6处理曲线下面积为0.918(P＜0.01),95%CI 0.831～1.0;PPD处理曲线下面积为0.725(P＜0.05),95% CI 0.56～0.89.结论 ESAT-6诱导的PBMCIFN-γ反应对结核性脑膜炎的诊断具有良好的敏感度和特异度,且具有较高的临床易行性.     

结核性脑膜炎早期诊断新进展

<正>结核性脑膜炎(结脑)是结核病中最严重的病型,病死率高,后遗症严重,甚至造成永久性残疾。早期结脑时间以不超过1周为宜,因为脑脊液(CSF)的典型变化发生在病后平均12天左右。早期正确诊断,综合分析是降低病死率和致残率的关键所在。特别是近几年CT、免疫学及分子生物学的进步,CSF检测在生化、免疫、细胞、病原菌诸方面均有进展,为结脑早期诊断提供了更多的科学依据。     

ESAT-6 在结核性腹膜炎中的检测及其诊断应用

目的 研究ESAT-6在结核性腹膜炎中的检测及其诊断应用价值。方法 选择2017年1月至2020年1月我院接诊的62例疑似结核性腹膜炎患者作为本研究对象。按照最终的诊断结果分为结核性腹膜炎组50例和肿瘤性腹水组12例。比较两组患者外周血中ESAT-6的阳性检出率、腹腔积液中ESAT-6的阳性检出率;对ESAT-6在结核性腹膜炎检测中的敏感度、特异度、阳性预测率、阴性预测率、阳性似然比、阴性似然比、约登指数进行比较。结果 结核性腹膜炎组患者外周血中ESAT-6的阳性率明显高于肿瘤性腹水组,差异有统计学意义(P0.05)。结核性腹膜炎组患者腹腔积液中ESAT-6的阳性率明显高于肿瘤性腹水组,差异有统计学意义(P0.05)。外周血T淋巴细胞中ESAT-6的敏感度、特异度、阳性预测率、阴性预测率、阳性似然比、阴性似然比、约登指数与腹腔积液T淋巴细胞中ESAT-6比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 ESAT-6在结核性腹膜炎的检测中有较高的应用价值,可以作为评估患者的重要的指标。     

生物信息学技术在结核分支杆菌ESAT-6重组抗原研究中的应用

目的 应用生物信息学分析软件预测分析结核分支杆菌ESAT-6基因及相关蛋白的特性.方法 应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及DNAstar、Rasmol等软件包分析ESAT-6并进行同源比对;预测二级、三级结构,以及预测主要抗原表位等.结果 结核分支杆菌重组抗原ESAT-6与已发表氨基酸序列同源性为90%.预测该蛋白分子质量约为9885.7Da,PI为4.6,4个抗原表位,其结构域位于56-87位.结论 生物信息学技术在结核分支杆菌ESAT-6重组抗原研究中有一定的理论和应用价值.     

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用

目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10基因,构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109。结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD／-Ade／-His／-Leu／-Trp培养基上生长,β-半乳糖苷酶活性实验阳性。结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用。     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.     

结核杆菌ESAT-6抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达flt3配体(flt3-ligand,FL)和结核杆菌6kD早期分泌蛋白(ESAT-6)的重组pIRES质粒,并在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中表达,为进一步研究结核杆菌DNA疫苗提供实验基础.方法:采用PCR方法将FL和ESAT-6基因分别定向克隆入真核双表达载体pIRES.在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至GMC细胞,Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,该重组质粒在体外GMC细胞中能表达FL和ESAT-6两种蛋白.结论:成功构建了结核杆菌FL和ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达.     

Early diagnosis of tuberculous meningitis by an indirect ELISA protocol based on the detection of the antigen ESAT-6 in cerebrospinal fluid

Background

Early diagnosis of tuberculous meningitis (TBM) is still a challenge; the present study aimed to establish a method of detecting the antigen early secreted antigenic target 6 (ESAT-6) in cerebrospinal fluid (CSF) by an indirect enzyme-linked immunosorbance assay (ELISA) protocol and to study the value of detecting ESAT-6 in CSF in the early diagnosis of TBM.

Methods

An indirect ELISA protocol was used, employing a monoclonal antibody (mAb) against ESAT-6, which was used to demonstrate ESAT-6 in the CSF from TBM patients and non-TBM controls. CSF was obtained from 100 patients: confirmed TBM, clinically diagnosed TBM, disease controls, and healthy controls (n = 10). Pure recombinant ESAT-6 (standard product) was used in serial dilutions to detect the absorbance and to establish a standard curve from the data; the concentration was on the X axis vs. absorbance on the Y axis, and the standard curve was used to interpolate the concentration of ESAT-6 in samples.

Results

The indirect ELISA method provided 88 % sensitivity and 92 % specificity for the diagnosis of TBM using a mAb to ESAT-6. The mean concentration of ESAT-6 in TBM patients was significantly higher than that of the non-TBM groups. There was also a significant difference in the mean ESAT-6 expression between the confirmed TBM patients and the clinically diagnosed TBM patients (p < 0.01).

Conclusions

Detection of ESAT-6 in the CSF of TBM patients by indirect ELISA protocol gives a reliable early diagnosis and can be used to develop an immunodiagnostic assay with increased sensitivity and specificity.     

含结核分枝杆菌ESAT6和CFP10基因的重组腺病毒表达载体的构建

目的克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建能同时表达两基因的重组腺病毒活载体,为研制能有效防治结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法首先利用PCR技术克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,将两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。该穿梭质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAdeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。PacI酶切线性化该质粒,转染AD293细胞进行病毒包装。结果ESAT-6和CFP-10基因成功克隆,其序列与GenBank公布的一致。两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体,获得的重组穿梭质粒经同源重组,成功获得复制缺陷型重组腺病毒质粒Adeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10,转染该质粒的AD293细胞出现细胞病变效应。结论成功克隆了分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建了含IRES串连的ESAT-6和CFP-10基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。