一种从培养细胞中快速制备病毒PCR模板的方法

目的建立一种快速、简单的从培养细胞中制备病毒PCR模板的方法。方法分别用裂解液煮沸法、苯酚法及基因组DNA提取试剂盒提取F81细胞中的犬细小病毒的DNA,分析3种方法提取的病毒DNA纯度、浓度及操作所需时间,并作巢式PCR检测,比较其PCR检测的阳性率。结果以裂解液煮沸法提取的犬细小病毒DNA为模板进行巢式PCR检测后的阳性率与两种对照方法之间的差异无统计学意义（P〉0.05）,3种方法提取的病毒DNA纯度及浓度未见差异,但裂解液煮沸法操作所需时间最短。结论裂解液煮沸法是一种快速而简单的从培养细胞中制备病毒PCR模板的方法。     

一种从血清标本中快速提取HBVDNA方法的建立

目的:建立一种快速提取血清标本中HBVDNA的方法,即裂解液煮沸法。方法:以碱裂解法和经典的苯酚法为对照,比较3种方法提取的HBVDNA纯度和半巢式PCR后的阳性率。结果:用裂解液煮沸法提取的HBVDNA进行半巢式PCR的阳性率最高,与两种对照方法之间的差异有极显著意义(P<0.01)。结论:裂解液煮沸法是一种快速、简单、高效的提取血清中HBVDNA的方法。     

外周血单个核细胞DNA不同抽提方法比较

用经典酚醇法、盐析法、碘化钾法、煮沸法提取外周血单个核细胞DNA ,比较这四种方法所获得的DNA模板对PCR检测肿瘤坏死因子 (TNF)的影响 ,结果显示除了煮沸法 ,其余三种方法提取的DNA均有较高的纯度和浓度 ,其中以碘化钾法操作最为简便可靠 ,适合临床推广应用。     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的　改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法　石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55　℃消化3　h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果　以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论　改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

全血基因组DNA的提取和纯化方法比较

目的探讨全血基因组DNA的快速纯化方法。方法分别采用表面活性剂裂解法、传统酚抽提法、加热法分别制备DNA，分析各种方法提取DNA的产量、纯度，以及方法本身的优缺点、费用等，同时我们进行RAPD标记实验以比较纯化的DNA在PCR上应用的效果。结果表面活性剂裂解法简单快速，其制备的DNA产率、纯度明显高于传统酚抽提法，但其完整性不如后者。加热法快速制备的全血基因组DNA作为模板虽然纯度差，但仍可用于PCR，并得到满意的检测结果。同一份标本采用不同方法提取的DNA作为模板进行的RAPD标记实验，其多重PCR产物进行分离产生的DNA图谱基本一致。结论3种全血DNA纯化方法均可满足不同的实验要求。     

模式小鼠总DNA三种提取方法比较研究

目的: 建立简便、快捷、经济的模式小鼠基因型鉴定中总DNA提取方法,达到快速鉴定大批量模式小鼠的实验目的。方法：采用苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法提取同种模式小鼠总DNA,对比DNA纯度和得率并通过PCR方法比较其鉴定结果。结果：DNA得率方面苯酚抽提法最好,异丙醇沉淀法最差;纯度则按照苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法顺序呈现依次递减的趋势。三种总DNA均可作为PCR反应模板,进行基因型鉴定。鼠耳煮沸法实验时间明显低于另两种方法,且所得总DNA常规-20℃保存7天、30天后依然可作为PCR反应模板使用。结论：鼠耳煮沸法操作简单且成本最低,是一种切实可行的模式小鼠基因型鉴定中总DNA提取方法。     

改良碱裂解法和煮沸法提取金黄色葡萄球菌DNA效果的比较

目的: 建立一种简便经济的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法。方法: 选取10株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,预先以终浓度2 mg/mL溶菌酶处理6 h,再以改良碱裂解法提取细菌基因组DNA。同时以常规煮沸法制备上述细菌基因组DNA。采用PCR法扩增两种模板中金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和femB基因,比较两种方法提取DNA的效果。结果： 以改良碱裂解法制备DNA为模板,所有10株标本均可扩增出spa基因和mecA基因,4个标本扩增出femB基因;以直接煮沸法制备DNA为模板,仅1个标本扩增出spa基因,2个标本扩增出mecA基因,所有标本未扩增出femB基因。 结论： 改良碱裂解法提取基因组DNA效果优于直接煮沸法,所提取基因组DNA可以满足PCR扩增的要求。     

荧光定量PCR法和巢式PCR法检测新生儿脐血人巨细胞病毒DNA的比较

目的 比较荧光定量PCR法和巢式PCR法在检测新生儿人巨细胞病毒(HCMV)先天性感染中的灵敏度,为HCMV先天性感染的快速特异性检测提供实验依据.方法 随机收集36例脐血标本,分离单核细胞,提取总DNA,进行巢式PCR和荧光定量PCR检测.结果 巢式PCR法检测HCMV糖蛋白(gB) DNA的阳性率为22.2%(7/...     

猫肾F81传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法

目的　建立在猫肾F81 细胞中犬细小病毒原位PCR的检测方法。方法　在猫肾F81 细胞上感染犬细小病毒 ,设计特异性引物 ,用直接原位PCR法在染毒 12h ,2 4h ,48h细胞片上检测出犬细小病毒 ,并与常规免疫组化的方法进行了比较。结果　在染毒 48h的细胞片上 ,用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进行统计比较 ,差异极显著 (P <0 .0 0 1) ,用原位PCR法所得出的阳性率高。结论　原位PCR法检测犬细小病毒具有敏感性高和组织定位的优点     

犬细小病毒核酸诊断方法的建立和应用

目的建立犬细小病毒的核酸诊断方法（PCR方法）并应用于临床诊断。方法根据犬细小病毒VP2基因序列设计引物，以犬细小病毒标准株、犬传染性肝炎病毒和正常增殖细胞DNA为模板，犬细小病毒扩增出221bp的特异带，将PCR产物连接到pMD18-T Vecter，转化大肠杆菌JM109菌株。重组质粒经测序并经blast比较，与GenBank中已登录的犬细小病毒VP2基因序列进行比较。同时将建立的PCR方法应用于30份犬粪便和病犬组织的检测，并测序。结果PCR产物测得的序列与GenBank的基因序列同源性为100％，粪便检测均无犬细小病毒的特异带，从病犬组织中有6份样品扩增出221bp的特异带，经测序比较，同源率为100％。结论建立了犬细小病毒的PCR检测方法，并能应用于临床诊断。     

用子聚合酶链反应的新鲜组织DAN快速提取法研究

结合本室实验,从人新鲜大肠癌组织中提取DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增检测癌基因突变。根据PCR对模板DNA要求不高的特点,本文在常规生化法提取DNA的基础上,采用了快速提取DNA方法,并从DNA含量、纯度及PCR扩增结果三个方面进行比较,获得满意结果。该法操作简单、省时、价廉。     

比较全血DNA提取法适用单核苷酸多态性分析

目的 比较两种提取冰冻全血基因组DNA的方法，即分离白细胞法和裂解红细胞法所获得基因组DNA的质量。方法 分别测定所获DNA的效率和纯度，同时，笔者用PCR／SNP敏感性分子开关技术。对两种方法获得的模板DNA进行单核苷酸多态性（single—nucleotide polymorphism，SNP）分析。结果 结果显示分离白细胞法DNA产量与纯度均高，裂解红细胞法获得的DNA产量、纯度相对较低；PCR／SNP敏感性分子开关检测表明：分离白细胞法和裂解红细胞法制备的DNA模板，均可在体外进行有效的PCR扩增。但分离白细胞法获得的目的DNA带特异性凸显，而裂解红细胞法获得的目的带特异性相对较差。结论 预先分离纯化白细胞是从冰冻全血中获得较高纯度DNA和有效提高DNA产量的重要操作步骤。     

模式小鼠总DNA三种提取方法比较

目的建立简便、快捷、经济的模式小鼠总DNA提取方法,以快速鉴定大批量模式小鼠基因型。方法采用苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法提取同种模式小鼠总DNA,对比DNA纯度、得率、耗费时间,并比较基因型鉴定结果。结果苯酚抽提法得率最高,异丙醇沉淀法最低;而纯度则按照苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法顺序递减;在耗时上鼠耳煮沸法最短。三种方法提取的DNA均可做模版用于基因型鉴定。结论鼠耳煮沸法操作简单、成本最低,快速、基因型鉴定结果可靠,可用于规模化的基因型鉴定实验中。     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

四种腺病毒核酸提取方法的比较

目的通过蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种腺病毒核酸提取方法的比较,为进一步研究腺病毒的分子生物学特性选择合适的方法提供参考。方法以腺病毒感染的A549细胞为样品,分别以蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸,核酸经紫外分光光度计检测A260/A280的比值后,用荧光定量PCR方法检测核酸中腺病毒拷贝数浓度,并记录四种腺病毒核酸提取方法所需的操作时间。结果蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸的A260/A280的比值依次为1.85532、1.7377、1.81474和1.43934,核酸中腺病毒拷贝数浓度依次为4.9×105copies/mL、3.94×103copies/mL、2.66×106copies/mL和6.15×106copies/mL,提取核酸所需的时间分别为1.5、15、0.5和0.5h。结论四种腺病毒核酸提取方法中,蛋白酶K法简单快捷、成本低廉,适合一般实验室使用;苯酚法适合用于提取细胞培养上清中病毒的核酸;病毒DNA/RNA试剂盒...     

改良盐析法提取全血基因组DNA的影响因素研究

目的 观察红细胞裂解时间、DNA纯化方式以及DNA干燥时间对改良盐析法提取全血基因组DNA的影响.方法 改良盐析法提取全血基因组DNA时,分别采用不同的红细胞裂解时间、DNA纯化方式以及DNA干燥时间.使用流式细胞术检测红细胞裂解后的细胞总数及死细胞比例,紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物.结果 红细胞裂解时间从10 min延长至120 min,死细胞比例随时间延长而增加,但细胞总数、DNA产量与纯度无明显变化;采用异丙醇沉淀法纯化DNA得到的DNA产量与纯度均显著高于使用DNA分离柱纯化的DNA; DNA干燥时间从120 min缩短至30 min,既不影响DNA的产量与纯度,也不影响后续PCR扩增实验.结论 改良盐析法提取全血基因组DNA时,红细胞裂解时间可延长至120 min,DNA干燥时间可缩短至30 min,异丙醇沉淀法优于DNA分离柱纯化的DNA.     

两种肠道腺病毒基因型分型方法的比较

目的研究简便快速肠道腺病毒基因型分型方法。方法采集137例非腹泻人群的粪便样本,在A549细胞中培养,提取病变细胞的基因组DNA进行PCR扩增或直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型。结果137份样本中,两种方法均有17份样本检出腺病毒,阳性率为12．4％（17／137）。序列分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致。这17份样本分别属于人腺病毒5型（5份）、7型（3份）、12型（3份）及48型（6份）。结论两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,无需方法一需进行3次体外细胞感染实验后从病变细胞中提取基因组DNA进行PCR扩增,节省实验的时间及成本,特别是避免体外细胞感染过程中可能出现的污染,值得推荐。     

几种miniprep提取质粒DNA方法的比较与改良

目的 比较并建立一种简单的、稳定的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值.方法 采用琼脂糖凝胶电泳对质粒DNA提取的试剂盒法、煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法四种方法进行比较.结果 试剂盒法的电泳谱带亮度最高且无RNA条带,煮沸法、碱裂解法、碱裂解结合酚氯仿法的电泳谱带亮度依次增高.结论 试剂盒法制备DNA纯度最高,且操作简便省时.     

不同检材微量血间日疟原虫PCR检测模板制备方法的研究

目的 探寻不同检材微量血间日疟原虫PRC检测模板制备的方法.方法 全血标本采用酚/氯仿抽提法、洗涤沉淀法、Chelex煮沸法和洗涤水煮法;滤纸干血滴及厚血膜标本以Chelex煮沸法和洗涤沉淀法制备模板.以间日疟原虫特异性引物作PCR扩增检测模板制备的效果.结果 采用上述4种不同的方法制备的全血间日疟原虫DNA模板与采用Chelex法和洗涤沉淀法制备的滤纸干血滴以及厚血膜疟原虫DNA模板均可被扩增出1条341bp的间日疟原虫特异性DNA条带,与预期的扩增片断大小一致;不同方法制备的10份间日疟患者血样DNA模板用于PCR扩增检测,结果无明显差异.其中,Chelex煮沸法和洗涤沉淀法对不同检材的疟原虫感染血样DNA模板均能有效制备,且可在同一离心管中进行,减少了交叉污染的机会.结论 Chelex法和洗涤沉淀法简便、实用,适用于不同检材微量血疟原虫PRC模板的制备.     

乳糜血清对聚合酶链反应DNA模板制备的影响

目的探讨乳糜血清对聚合酶链反应DNA模板制各的影响。方法对29例具有乳糜血清的慢性乙型肝炎患血清，分别进行两种方法处理。A法按照常规试剂集盒方法裂解提取DNA，B法在提取DNA前用异丙醇抽提甘油三酯，弃去抽提液加裂解液100pl，沉淀用70％的乙醇100μl漂洗两次。结果A法裂解提取DNA后发现10例HBVDNA阳性。B法提取DNA后发现26例HBVDNA阳性。结论乳糜血清可能会影响HBVDNA模板的制备。在模板制备前抽提甘油三酯，并用乙醇多次洗涤模板DNA可避免从乳糜血清中检测HBVDNA造成的假阴性．