商陆抗病毒蛋白不同结构域的抗乙型肝炎病毒活性

目的 比较全长和不同片段缺失型商陆抗病毒蛋白(PAP)基因真核表达质粒体外抗HBV作用及其细胞毒性作用.方法 将全长和不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒用脂质体转染HepG2.2.15细胞,收获生长良好的HepG2.2.15细胞,转染前1 d,接种于24孔培养细胞板,培养20 h后,待细胞密度达到40%～50%时进行转染.细胞随机分为4组:pXF3H组,转染空质粒pXF3H作为对照;pXF3H-PAP_(12)组,转染全长PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP_(12);pXF3H-PAP_(14)组,转染C端缺失25个氨基酸的PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP_(14);pXF3H-PAP3_(34)组,转染既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP的真核表达质粒pXF3H-PAP_(34).转染的质粒剂量为每孔1.0μg,终浓度为2.0μg/ml,质粒DNA(μg)和脂质体(μl)的比例为1:2.5,转染72 h后收集细胞及培养上清液.酶联免疫吸附法检测培养上清液HBsAg和HBeAg,荧光定量PCR检测HBV DNA水平,四甲基偶氮唑盐比色法检测各质粒对转染细胞的毒性作用.应用SPSS12.0软件包处理数据,两样本均数的比较采用t检验,率的比较采用χ~2检验.结果 对HBsAg、HBeAg、HBVDNA的抑制率,pXF3H-PAP_(14)组分别为56.3%、75.8%和61.7%,pXF3H-PAP_(12)组分别为61.4%、84.2%和63.2%,两组间差异无统计学意义.但pXF3H-PAP_(14)组细胞毒性 (抑制率为10.2%)明显低于pXF3H-PAP_(12)组(抑制率为27.1%),χ~2=7.7,P<0.01.pXF3H-PAP_(34)组无细胞毒性,但其抗HBV作用也丧失,对HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制率分别为7.8%、11.0%、20.5%.结论 PAP的C端25个氨基酸与细胞毒性相关,与抗HBV活性无关;PAP的N端69个氨基酸与抗HBV活性相关.     

乙型肝炎病毒感染的育龄妇女抗病毒药物应用策略

HBV感染的育龄妇女抗病毒问题一直困扰着临床医生.现根据近年来抗病毒药物在妊娠妇女中应用安全性的研究及临床经验,提出了HBV感染的育龄妇女不同时期抗病毒药物治疗的策略,供临床参考.     

乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗48周的临床疗效

目的 观察核苷类药物对乙型肝炎肝硬化患者的抗病毒疗效及安全性.方法 采用队列研究,将143例乙型肝炎肝硬化患者分为治疗组73例和对照组70例,两组患者的基线情况相当.治疗组在常规治疗的基础上加用核苷类药物抗病毒治疗48周,其中恩替卡韦30例、阿德福韦酯25例、拉米夫定16例、替比夫定2例;对照组给予常规治疗.两组间率的比较采用χ~2检验或Fisher确切概率法检验,均数比较采用t检验.结果 治疗48周后,治疗组与对照组相比,AST、ALT,TBil明显下降,Alb及胆碱酯酶明显上升,差异有统计学意义(t=4.020、2.410、2.067、-5.369、-3.713,均P<0.05).治疗组HBV DNA转阴率为93.2%,高于对照组的2.9%,差异有统计学意义(t=116.6,P=0.001).治疗组及对照组的HBeAg转阴率分别为65.4%及19.0%,差异有统计学意义(t=10.091,P=0.001).治疗组腹膜炎发生率低于对照组(1.37%比11.43%,P=0.016).治疗组无肝细胞癌发生,对照组有4例,差异无统计学意义(P=0.055).治疗组消化道出血5例,占6.85%,对照组8例,占11.43%,差异无统计学意义(χ~2=0.907,P=0.341).治疗组中1例采用拉米夫定治疗的患者在42周出现病毒学反弹.HBeAg由阴性转为阳性,肝功能恶化死亡,对照组2例死亡,两组病死率比较差异无统计学意义(P=0.614).结论 核苷类药物能改善乙型肝炎肝硬化患者的肝功能,降低HBV复制,提高HBeAg转阴率.治疗过程中须密切观察病毒变异耐药情况,防止肝功能恶化.     

慢性乙型肝炎抗病毒治疗的进展

慢性乙型肝炎是世界上最常见的传染病之一,据统计全世界有3.5亿人患此病,慢性乙型肝炎易发生肝硬变及肝癌,预后极差.抗病毒药物直接作用于病毒复制的不同环节上,抑制其复制,以致消除感染.目前抗病毒药物包括两类一是干扰素类,天然的或基因重组的α或β干扰素.另一类是核酸类似物如阿糖腺苷Famciclovir,Lamivudine等.慢性乙型肝炎联合治疗有两种联合方案一是不同抗病毒药物联合,一是与免疫调节药物联合.对这些治疗方法的评价值得注意及研究.近年来Lamivudine在我国临床应用,取得了良好的开端,单用Lamivudine治疗或联合治疗的持久疗效如何是令人感兴趣的.     

献血员隐匿性乙型肝炎病毒感染的分子流行病学

目的 了解献血员中隐匿性HBV感染的发生率,从S基因变异角度探讨隐匿性HBV感染可能的分子机制.方法 收集经血站筛查HBsAg阴性的合格献血员血浆594份,ELISA法检测HBV血清学标志物,套式PCR检测血清HBV DNA.对筛查出的隐匿性HBV感染者再次用雅培试剂定量检测HBV血清学标志物,并对其S区进行测序,发现可能与HBV隐匿性感染有关的变异位点.随机收集11例HBsAg阳性的HBV感染者作为阳性对照,对其S区进行测序,比较其与隐匿性HBV感染之间的关系.结果 在594例献血员中有15例为隐匿性HBV感染,隐匿性HBV感染的发生率为2.5％.未发现HBV血清学标志物检测结果与隐匿性HBV感染有相关性.15例隐匿性HBV感染者中有10例进行了S区测序,结果HBV均有不同程度的变异,其中3例在“a”决定簇内出现氨基酸突变,分别为1126T(1例)、T140I(2例).与隐匿性HBV感染者相比,阳性对照在“a”决定簇内仅出现了1例T131N变异.结论 常规检测HBsAg阴性的献血员中存在隐匿性HBV感染,且这些病毒可能存在变异.     

乙型肝炎肝硬化失代偿期抗病毒治疗的研究进展

乙型肝炎肝硬化失代偿期是慢性乙型肝炎、肝纤维化发展的最终结局之一。大量的研究证明抗病毒治疗可以延缓病情进展,明显改善临床结局,减少并发症的发生,延缓失代偿肝硬化进程,最终提高生存期。核苷和核苷酸类药物是目前失代偿期乙型肝炎肝硬化的主要抗病毒药物。介绍了适用于乙型肝炎肝硬化失代偿期的抗病毒药物,针对治疗中的一些问题进行探讨,指出在临床工作中,在规范化抗病毒的前提下应遵循个体化治疗的原则。     

密切关注慢性乙型肝炎抗病毒治疗的动向

近年不断有关于慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治疗的共识、指南、指导意见、新策略问世。密切关注CHB抗病毒治疗的研究进展和动向，有助于解决临床治疗中所面临的问题，使患者得到最适当的治疗。本文结合近年国内外重要共识、指南，对干扰素和核苷（酸）类似物用于CHB抗病毒治疗的用法、疗程、治疗终点、疗效，以及病毒耐药的类型、相关因素及其预防和处理进行评述，同时提出了我国目前在CHB抗病毒治疗中存在的问题及其解决途径。     

慢性乙型肝炎病毒感染特殊人群抗病毒治疗的几个问题

对于慢性乙型肝炎患者,抗病毒治疗目的 是阻断肝炎-肝硬化-肝癌"三部曲"进程,减低和防止终末期肝病的发生.抗病毒治疗的有效性及可行性已勿容置疑,但其是否可改变慢性HBV感染者的最终结局,影响疾病长期转归还需更多循证医学证据支持.     

乙肝病毒核心蛋白的结构与功能及其在抗病毒治疗中的应用

目前，干扰素和5种核苷（酸）类似物被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于慢性乙型肝炎（CHB）的治疗。但干扰素的低应答率和多种不良反应限制了其使用，核苷（酸）类似物的长期应用又具有明显的耐药性。     

乙型肝炎研究及我国防治现状

HBV感染及其相关疾病对我国的人民健康和经济发展造成了巨大危害,我国在HBV感染防治方面做出了巨大努力,然而,乙型肝炎抗病毒治疗仍面临巨大挑战。本文就乙型肝炎研究及我国防治现状进行综述。     

Inhibition of hepatitis B virus replication by pokeweed antiviral protein in vitro

AIM： To explore the inhibitory effects of pokeweed antiviral protein seed （PAP-S） and PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid on hepatitis B virus （HBV） replication in vitro. METHODS： HepG2 2.2.15 cells in cultured medium were treated with different concentrations of PAP-S. HBsAg, HBeAg and HBV DNA in supernatants were determined by ELISA and fluorescent quantitative PCR respectively. MTT method was used to assay for cytotoxicity. HepG2 were cotransfected with various amounts of PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid and replication competent wild-type HBV 1.3 fold overlength plasmid. On d 3 after transfection, HBsAg and HBeAg were determined by using ELISA. Levels of HBV core-associated DNA and RNA were detected by using Southern and Northern blot, respectively. RESULTS： The inhibitory effects of PAP-S on HBsAg, HBeAg and HBV DNA were gradually enhanced with the increase of PAP concentration. When the concentration of PAP-S was 10 μg/mL, the inhibition rates of HBsAg, HBeAg and HBV DNA were 20.9%, 30.2% and 50%, respectively. After transfection of 1.0 μg and 2.0 μg plasmid pXF3H-PAP, the levels of HBV nucleocapside- associated DNA were reduced by 38.0% and 74.0% respectively, the levels of HBsAg in the media by 76.8% and 99.7% respectively, and the levels of HBeAg by 72.7% and 99.3% respectively as compared with controls. Transfection with 2 μg plasmid pXF3H-PAP reduced the levels of HBV nucleocapside-associated RNA by 69.0%.CONCLUSION： Both PAP-S and PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid could effectively inhibit HBV replication and antigen expression in vitro, and the inhibitory effects were dose-dependent.     

小干扰RNA有效抑制乙型肝炎病毒的动物实验

目的 以乙型肝炎病毒（HBV）S区为靶位，观察小干扰RNA（siRNA）在动物体内抗HBV的效果。方法 以流体动力学法建立HBV感染的动物模型，将pcDNA3．1-HBV和细胞体外实验证明有效的siRNA尾静脉共注射Balb／c小鼠，用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA）检测小鼠血清中HBsAg，用定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测血清HBV DNA，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HBV S-mRNA，用免疫组织化学法检测肝组织HBsAg和HBcAg。结果 在小鼠体内，siRNA能有效抑制HBsAg的分泌，降低HBVDNA的滴度，免疫组织化学结果也证实HBsAg、HBcAg刚性细胞数明显减少，干扰效果至少持续3d，而无关siRNA则无抑制作用。结论 在动物体内靶向HBV S区的siRNA能有效特异抑制HBV。     

商陆抗病毒蛋白体外对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响

目的　探讨商陆抗病毒蛋白 (pokeweedantiviralprotein ,PAP)体外抗乙型肝炎病毒 (HBV)的活性。方法　以不同浓度的PAP S作用于培养的HepG2 .2 .15细胞 ,采用ELISA、荧光定量PCR法分别检测细胞上清液中的HBsAg、HBeAg及HBVDNA水平的变化 ,并用MTT比色法检测细胞成活率。结果　随着PAP S浓度的增加 ,对HBsAg、HBVDNA的抑制作用亦逐渐增强 ,不同药物剂量组之间差异十分显著 (P <0 .0 1)。PAP S处理后 96h ,PAP S对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度 (ID50 )分别为 6.9μg/ml和 3 .2 μg/ml ,半数中毒浓度 (CD50 )为 2 9.3 μg/ml,治疗指数 (TI) =ID50 /CD50 分别为 4.3和9.3。MTT试验结果显示 ,药物的细胞毒性也呈剂量依赖型 ,倒置显微镜下观察在 5 0 μg/ml～ 10 0 μg/ml剂量组出现部分细胞脱壁和死亡现象。结论　PAP S在体外有直接的抗HBV作用。。     

金丝桃素体外抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究金丝桃素对HBV复制的影响.方法 以拉米夫定为对照,浓度梯度金丝桃素作用于HepG2.2.15细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,Southern印迹法检测细胞培养上清液中HBV DNA水平,并计算金丝桃素的半数细胞抑制浓度(IC50)和半数有效浓度(EC50).以32P标记的脱氧核糖核苷三磷酸为底物,测定金丝桃素和拉米夫定对HBV DNA聚合酶(反转录酶)活性.采用独立样本t检验和单因素方差分析进行两组及多组数据间比较.结果 随金丝桃素浓度的升高,对HBsAg和HBeAg的抑制率也逐步提高,且＞0.5 μmol/L各组抑制率均高于拉米夫定,差异有统计学意义(t=-0.127,P＜0.05).金丝桃素具有比拉米夫定更强的抑制HBV DNA作用,EC50为0.2μmol/L,差异有统计学意义(t =-0.058,P＜0.05).EC50(0.2 μmol/L)及IC50(200 μmol/L)结果显示,在实验范围内金丝桃素对HepG2.2.15无毒性作用.与拉米夫定不同,金丝桃素对DNA聚合酶(反转录酶)无影响.结论 金丝桃素能有效抑制HBV复制及抗原合成,在实验范围内对HepG2.2.15无明显毒性作用,且与传统核苷类化合物具有不同的抗HBV靶点.     

突变乙型肝炎病毒核心蛋白的克隆及表达

目的 克隆并表达发生长片段缺失的HBV核心蛋白(HBV-C)基因,并对其进行DNA序列、蛋白质结构和抗原性分析.方法 采用PCR方法从1株野生型HBV基因组中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,克隆至pUCm-T质粒,进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析;再将基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a,构建含HBV-C基因的重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达并检测其抗原性.结果 PCR扩增出的HBV-C基因长度经序列分析表明,其核苷酸序列缺失了220 bp至317 bp之间的98个碱基,造成从第74个氨基酸起发生移码突变并失去了抗原性.结论 成功克隆和表达了发生长片段缺失的HBV-C基因.     

乙型肝炎病毒核心抗原在慢性乙型肝炎病毒感染者肝细胞内的分布及临床意义

目的 探讨HBcAg在慢性HBV感染者肝细胞内的分布情况及其临床意义.方法 对41例慢性HBV感染者进行肝组织穿刺,用免疫荧光组织化学技术在激光共聚焦显微镜下观察肝细胞内HBcAg的分布情况.计量资料采用Kruskal Wallis检验,计数资料采用卡方检验.结果 41例慢性HBV感染者中,36例肝细胞内HBcAg阳性表达,阳性率为87.8%,其中23例肝功能中度异常,10例肝功能轻度异常,3例肝功能正常.HBcAg有膜、胞质与核三种形式表达.在23例肝功能中度异常者中,6例呈明显膜型表达,无明显胞质型及核型,17例以胞质型与膜型混合表达,未发现核型表达.在10例肝功能轻度异常者中,以单纯胞质型为主,未见膜型与核型表达.在3例肝功能正常者中,以胞质型表达与少许核型表达为主,未见膜型表达.HBcAg表达类型与肝功能之间差异有统计学意义(χ2=10.60,P＜0.01).结论 慢性HBV感染者肝组织损伤与HBcAg的表达有直接联系,提示膜型表达的HBcAg是肝脏免疫损伤过程中的靶抗原.

Abstract：

Objective To explore the distribution and clinical significance of hepatitis B core antigen( HBcAg) in the hepatocytes of chronic hepatitis B virus infected patients. Methods Paraffin sections were made from 41 liver biopsy samples obtained from chronic hepatitis B virus infected patients. The immuno-fluorescence confocal technique was utilized to analyze the expression level and localization of HBcAg in hepatocytes. The data were analyzed by using Kruskal Wallis test and chisquare test. Results HBcAg expression were detected in 36 (87. 8%) patients, among whom 23 cases had moderate abnormal liver function, 10 with mild abnormal liver function and 3 with normal liver function. Among the cases with moderate abnormal liver function, 6 cases showed the simple membrane-type HBcAg expression, 17 cases showed mixed cytosolic-type and membrane-type HBcAg expression without the nuclear-type expression. Twelve cases with mild abnormal liver function only showed simple cytosolic-type HBcAg expression without membrane-type or nuclear-type expression. In the three patients with normal liver function, HBcAg was expressed in cytoplasm and nuclear but not on membrane. The correlation between HBcAg expression pattern and liver function was statistically significant (χ2 =10. 60, P＜0.01). Conclusion HBcAg expression is directly correlated with liver injury in chronic hepatitis B virus infected patients, which indicates that membrane expressed HBcAg is the target antigen during the immuno-attack of liver.     

胡黄连总苷抑制乙型肝炎病毒复制作用的体外研究

目的 观察胡黄连总苷抑制HepG 2.2.15细胞内HBV共价闭合环状DNA(HBVeeeDNA)的作用效果及特点.方法 分别用50 mg/L胡黄连总苷或5 mg/L阿德福韦酯的细胞培养液作用于HepG 2.2.15细胞,加药后2 d、5 d收集细胞及培养上清液,实时荧光定量PCR方法检测上清液和细胞内HBV DNA、细胞内HBV cccDNA和前基因组RNA(pgRNA)水平,分别计算抑制率.均值比较用t检验.结果 胡黄连总苷作用2 d和5 d后,上清液HBV DNA抑制率为49.74%(t=4.723,P<0.05)和79.48%(t=7.512,P<0.05);细胞内HBV cccDNA抑制率为43.55%(t=5.216,P<0.05)和56.43%(t=7.262,P<0.05),总DNA抑制率为43.39%(t=4.137,P<0.05)和63.86%(t=7.861,P<0.05),pgRNA抑制率为54.72%(t=4.532,P<0.05)和56.08%(t=4.833,P<0.05).阿德福韦酯作用2 d和5 d后,上清液HBV DNA抑制率为25.56%(t=2.874,P<0.05)和92.44%(t=10.276,P<0.05);细胞内HBV cccDNA抑制率为18.54%(t=2.736,P<0.05)和47.19%(t=6.852,P<0.05),总DNA抑制率为21.20%(t=3.206,P<0.05)和71.47%(t=8.332,P<0.05),pgRNA抑制率为11.14%(t=1.761,P>0.05)和37.61%(t=3.632,P<0.05).结论 胡黄连总苷能明显抑制HepG 2.2.15细胞内HBV复制,尤其对cccDNA具有抑制作用,在作用时相上早于阿德福韦酯,可能存在不同的作用机制.     

HepG2.2.15细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测

目的　建立一种细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测方法。方法　消化收集处于对数生长期的HepG2.2.15细胞,取1×106 个细胞用小量质粒抽提试剂盒抽提细胞内的cccDNA,抽提产物用绿豆核酸酶酶切纯化,所得酶切产物用特异的引物和探针进行选择性荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测。用对数生长期前的细胞培养上清液、4 份HBV DNA阳性和2 份HBV DNA阴性的慢性乙型肝炎(轻度)患者血清验证荧光定量PCR法的特异性,并用不同浓度的质粒标准品检测该方法的敏感性。结果　证实HepG2.2.15细胞内存在cccDNA,其含量约为每个细胞18 拷贝。对数生长期前培养上清液和慢性乙型肝炎(轻度)患者血清均未检测到荧光信号,本实验条件下用该方法可检测低至103 拷贝/ml的cccDNA分子。结论　该方法操作方便,特异性高,敏感性较好,可用于定量检测细胞内的cccDNA及抗病毒药物的筛选和评价等。     

Inhibition of hepatitis B virus replication by APOBEC3G in vitro and in vivo

AIM: To investigate the effect of APOBEC3G mediated antiviral activity against hepatitis B virus (HBV) in cell cultures and replication competent HBV vector-based mouse model. METHODS: The mammalian hepatoma cells Huh7 and HepG2 were cotransfected with various amounts of CMV-driven expression vector encoding APOBEC3G and replication competent 1.3 fold over-length HBV. Levels of HBsAg and HBeAg in the media of the transfected cells were determined by ELISA. The expression of HBcAg in transfected cells was detected by western blot. HBV DNA and RNA from intracellular core particles were examined by Northern and Southern blot analyses. To assess activity of the APOBEC3G in vivo, an HBV vector-based model was used in which APOBEC3G and the HBV vector were co-delivered via high-volume tail vein injection. Levels of HBsAg and HBV DNA in the sera of mice as well as HBV core-associated RNA in the liver of mice were determined by ELISA and quantitative PCR analysis respectively. RESULTS: There was a dose dependent decrease in the levels of intracellular core-associated HBV DNA and extracellular production of HBsAg and HBeAg. The levels of intracellular core-associated viral RNA also decreased, but the expression of HBcAg in transfected cells showed almost no change. Consistent with In vitro results, levels of HBsAg in the sera of mice were dramatically decreased. More than 1.5 log 10 decrease in levels of serum HBV DNA and liver HBV RNA were observed in the APOBEC3G-treated groups compared with the control groups. CONCLUSION: These findings indicate that APOBEC3G could suppress HBV replication and antigen expression both in vivo and in vitro, promising an advance in treatment of HBV infection.     

载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3G抑制乙型肝炎病毒和鸭乙型肝炎病毒复制

目的了解载脂蛋白质BmRNA编辑酶催化多肽3G（APOBEC3G）对乙型肝炎病毒（HBV）和鸭乙型肝炎炎病毒（DHBV）复制的抑制作用。方法从健康人外周血单个核细胞提取RNA，逆转录聚合酶链反应扩增APOBEC3G，将产物克隆到pXF3H载体的EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点以构建真核表达质粒；以ayw亚型HBV全长质粒构建具有复制能力的1．3倍HBV质粒（pHBV1．3）。不同剂量的APOBEC3G真核表达质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞；酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液的乙型肝炎表面抗原和e抗原水平，Southernblot和Northernblot分析HBV核衣壳相关DNA和RNA的水平变化。不同剂量APOBEC3G真核表达质粒与头尾相接的2倍DHBV质粒共转染LMH鸡肝癌细胞，Southernblot分析DHBV核衣壳相关DNA水平变化。结果成功构建APOBEC3G真核表达质粒和具有复制能力的1．3倍HBV质粒。APOBEC3G抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌，转染细胞内HBV核衣壳相关RNA表达水平下降，而对核心蛋白质的表达没有影响；APOBEC3G对转染细胞内HBV和DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应。结论APOBEC3G对HBV和DHBV复制具有抑制作用。