P-选择素凝集素样结构域和红色荧光蛋白融合基因的构建

目的：构建P－选择素凝集素样结构域与红色荧光蛋白融合基因（pDsRed1-N1/L），以进一步明确P－选择素不同表位与功能间的关系，为阐明P－选择素生理病理意义奠定基础。方法：应用PCR技术扩增质粒pCDM1/cDNA凝集素样区，用T4连接酶其插载体pDsRed1-N1；经酶切和测序对插入片段进行分析、鉴定。结果：通过酶切和序列分析确定重，组pDsRed1/N1的片段为目的基因的核苷酸序列。结论：应用基因工程技术构建pDsRde1-N1/L融合基因成功，为红色荧光蛋白作为生物标记分子来研究P－选择素分子的构效关系打下基础。     

增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1—3区域（KDRn3）的融合基因真核表达载体，为研究KDRn3在抑制视网膜新生血管性疾病中的作用奠定基础。方法以质粒pcDNA3．1／KDRn3为模板，PCR扩增KDRn3基因，将目的片段克隆至pMD18-T载体，其产物双酶切后连接到质粒pEGFP-N1。结果酶切及琼脂糖电泳分析表明提取及纯化的重组质粒含有目的基因片段，大小正确。结论成功构建了EGFP与人KDRn3的融合基因真核表达载体pEGFP-N1／KDRn3。     

构建具有突变铜-锌超氧化物歧化酶绿色荧光真核表达载体

目的:构建一个具有特殊临床表型的肌萎缩侧索硬化症家系的突变铜-锌超氧化物歧化酶与有增强绿色荧光蛋白基因的pEGFP-N1融合的真核表达载体。方法:实验于2003-09/2005-01在第三军医大学全军免疫学研究所完成。通过RT-聚合酶链扩增突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA,应用基因重组技术,将得到的突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N1中,转化DH5α感受态细胞,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切分析、测序鉴定。结果:提取到纯度较高的总RNA,通过RT-聚合酶链和基因重组得到重组质粒,应用EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切重组质粒,得到长约130bp和4.6Kb的两条带,前者为插入片段的长度,后者为pEGFP-N1载体本身的长度。测序也最终证实重组载体的方向及序列正确。结论:突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA成功地亚克隆至荧光真核表达载体pEGFP-N1中,获得突变铜-锌超氧化物歧化酶/pEGFP-N1重组质粒,从而为实时监测突变铜-锌超氧化物歧化酶基因在体内的表达和蛋白定位提供一个有用的工具载体。     

重组pEGFP-C1-Smad4表达载体的构建及在SGC7901细胞中的表达

目的：构建pEGFP-C1-Smad4表达载体,并观察其在人胃癌SGC7901细胞中的表达。方法： 应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白与Smad4的融合表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析,用基因转染技术将其转入人胃癌SGC7901细胞,荧光显微镜、Western blot检测其表达。结果： 酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,在转染的人胃癌SGC7901细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到Smad4在蛋白水平的表达。结论：pEGFP-C1-Smad4表达载体便于观察转染细胞中EGFP-C1-Smad4融合蛋白的表达情况,为进一步研究Smad4在胃癌发生中的作用奠定基础。     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

构建重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒

目的:构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1-IGF-1),为基因治疗脊髓损伤提供前提。方法:实验于2005-04/06在上海基康生物公司实验室完成。应用反转录-聚合酶链反应方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,以构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1。结果:实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以反转录-聚合酶链反应方法获取编码胰岛素样生长因子1基因的全序列cDNA。构建胰岛素样生长因子1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论:构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1成功,实验中将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因的3'端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,即保留了胰岛素样生长因子1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

可溶性血管内皮细胞生长因子受体1真核表达载体pEGFP-N1/sflt-1构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达

背景:研究表明,可溶性血管内皮生长因子受体Flt-1(sflt-1)基因在多种组织中表达,但其在内皮细胞中的表达尚待证实.目的:获取人sflt-1基因,构建sflt-l基因真核表达载体pEGFP-N1/sflt-1重组质粒,检测其在人脐静脉内皮细胞中的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-05/12在南昌大学第二附属医院分子中心完成.材料:pEGFP-N1真核表达载体为南昌大学第二附属医院分子中心保存,人脐静脉内皮细胞株购至南京基凯生物技术公司.方法:从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用酶切的方法获得目的基因,将目的载体进行酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,PCR鉴定为阳性的克隆,证明目的基因已经定向连入目的载体.再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体.用脂质体法将pEGFP-N1/sflt-1重组质粒转染人脐静脉内皮细胞.主要观察指标:①重组质粒的酶切鉴定结果.②重组质粒的测序鉴定结果.⑧荧光显微镜及蛋白免疫印迹检测sflt-1基因在人脐静脉内皮细胞中的表达.结果:①对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,与sflt-1基因片段全长2 063 bp理论值相符,证实pEGFP-N1/sflt-1重组质粒构建成功.②重组质粒送至上海捷瑞生物技术公司进行通测,测序结果证实插入片段序列与理论值完全一致.③荧光显微镜下可见重组质粒转染人脐静脉内皮细胞发绿色荧光,蛋白免疫印迹检测表明sflt-1基因能在人脐静脉内皮细胞中表达.结论:实验成功构建了携带人血管内皮生长因子受体Flt-1的重组pEGFP-N1/sflt-1真核表达质粒,并证实其在人脐静脉内皮细胞中的表达.     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Veto细胞中的表达

目的 构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体，并将其置于Vero细胞中表达。方法 设计1对PCR引物，在其下游引入Flag序列。通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出s蛋白编码基因，PCR产物经酶切后，插入表达载体peDNA3．1（＋）中，构建重组表达质粒peDNA3．1（＋）-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞，用抗Flag单克隆抗体通过Westernblot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果 酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确；Western blot证实重组S蛋白片段能够在Veto细胞表达。结论 融合Flag序列的SAPS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

目的在大肠杆菌中克隆表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因,即腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因,所得片段与pGEX-4t-1(+)载体连接,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白作鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783bp,始于ATG,止于TAG,预测的等电点和相对分子质量分别为7.75和29×103,目的基因与Genbank腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55×103见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因。     

pEGFP-BMI-1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

本研究构建真核表达载体pEGFP-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pEGFP-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFP-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFP-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFP。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。     

Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定

目的：构建Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体,为后期转染肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及激发机体有效的特异性抗肿瘤免疫应答提供重要的实验材料。方法：应用RT-PCR从Jurkat细胞中获得Survivin cDNA片段,反向插入pIRES2-DsRed2质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的Survivin反义RNA表达载体是否成功;应用RT-PCR从HepG2细胞中获得的HSP70 cDNA片段,定向插入到pIRES2-DsRed2质粒载体中;经菌落PCR、酶切和测序鉴定所构建的HSP70表达载体是否正确。结果：经酶切和测序鉴定证明Survivin反义RNA表达载体已成功构建;经菌落PCR、限制性酶切和测序鉴定证明HSP70表达载体已成功构建。结论：本实验已成功构建了Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体,为进一步研究提供了实验基础。     

人Toll样受体4胞浆内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的：构建人Toll样受体4胞浆内段（hTLR4C)His融合蛋白表达载体并在原核表达与纯化，以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法：采用PCR方法扩增hTLR4基因编码区的胞浆内段，并将其重组于pET-DsbA2.0载体中。重组质粒经酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：用异丙基β－D硫代半乳糖（IPTG）诱导产生hTLR4胞浆内段的His-DsbA融合蛋白，继而纯化获得了分子量约42kd的融合蛋白。结论：本研究成功地构建了hTLR4胞浆内段融合蛋白表达载体并获得高效表达，为进一步研究提供了重要的实验材料。     

嗜麦芽窄食单胞菌Smqnr耐药基因的序列分析及原核表达

目的:对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch770(SMgzch770)携带的喹诺酮耐药基因Smqnr进行扩增、测序及原核表达,为研究Smqnr蛋白的功能奠定基础。方法:提取SMgzch770基因组染色体,PCR扩增Smqnr全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将Smqnr基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果:以染色体DNA为模板,成功扩增660bpSmqnr基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%以上;SMgzch770Smqnr序列已登录GenBank(登录号:HQ315851);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白约为50kDa,其中Smqnr蛋白约为24kDa。结论:从SMgzch770中成功克隆及表达了Smqnr基因,为进一步进行Smqnr蛋白高级结构测定的结晶试验提供了必须材料。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

MDR1 shRNA表达质粒的构建

目的构建由pSIREN—RetroQ-ZsGreeen载体介导、表达MDR1短发卡RNA（shorthairpinRNA,shRNA）的重组质粒。方法分别针对MDR1基因的两个不同位点,按BamHI＋Sense＋Loop＋Antisense＋终止信号＋EcoRI结构合成编码shRNA的DNA序列及其反义序列,退火连接及磷酸化形成双链后,将其依次导入pSIREN—RetroQ—ZsGreeen载体,构建成能产生MDR1shRNA的质粒,并进行序列分析。结果重组质粒（pSIREN—RetroQ-ZsGreeen—A和pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—B）经酶切与测序证实两段寡核苷酸片段成功插入到预计位点,序列完全一致,无任何碱基突变。结论MDR1shRNA的表达载体pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—A和pSIREN—Ret—roQ—ZsGreeen-B成功构建,为进一步研究肿瘤多药耐药逆转奠定了实验基础。     

含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品的制备及应用

目的建立一个含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品,用于PML/RARαL型）的定量检测。方法从NB4细胞中提取总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板,设计PML/RARα（L型）与ABL基因特异性引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收、PCMV4载体克隆后转化DH5α工程菌,提取质粒进行酶切、测序鉴定,提取质粒用于制作荧光定量PCR标准曲线,同时对质粒的稳定性能进行评价。结果结果NB4细胞提取的总RNA完整性良好,构建的质粒经酶切鉴定后与目的条带一致,测序结果与目的片段几乎完全一致,且质粒的原始浓度为9×1012copies/ml,倍比稀释至9×104copies/ml,均能得到良好的标准曲线（R2≈1）,且质粒的稳定性好,提示含PML/RARa（L型）与ABL双基因荧光定量PCR质粒标准品构建成功。结论本研究建立了制备含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品方法,并成功制备出稳定的含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品。     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescen ceprotein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—HPV16 E6。方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP—HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位，用Western blot方法验证其蛋白的表达。结果 表明在空载体pEGFP—C2转染组中，Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP—HPV16 E6转染组中，绿色荧光集中在细胞核中。Western blot的结果确证了pEGFP—HPV16 E6融合蛋白的表达。结论 提示pEGFP—HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及业细胞定位，为HPV16 E6的功能研究提供了线索。