HPLC法测定末梢血中苯丙氨酸与酪氨酸及在苯丙酮尿症中的应用

目的 建立一种简单、快速的反相高效液相色谱法测定末梢血液中的苯丙氨酸(Phe)与酪氨酸(Tyr)并用于苯丙酮尿症(PKU)的筛查.方法 末梢血标本与等量5%(v/v)高氯酸溶液混合处理去除蛋白后离心取上清液20 μl直接进样分析.用Hypersil C8色谱柱(6.0mm×300mm,10μm)分离,流动相为乙腈-水(体积比5:95),流速1.5 ml/min,紫外检测波长210 nm,室温下测定.结果 末梢血中Tyr和Phe均分离良好,保留时间分别为5.88 min和8.43 min.102例健康儿童指血Phe浓度67.7±15.4/μmol/L,Tyr浓度为62.2±13.9μmol/L,Phe/Tyr比值为1.15±0.27.32例正常新生儿足跟血Phe浓度为66.2±20.5 μmol/L,Tyr浓度为59.5±18.8/μmol/L,Phe/Tyr比值为1.12±0.24.结论 该法灵敏度高,特异性好,方法 简便快速,成本低康,适合于末梢血中Phe和Tyr的同时测定及PKU的筛查与监控.     

两种血清苯丙氨酸高效液相色谱测定法的比较

目的对两种血清苯丙氨酸高效液相色谱测定法进行比较。方法对高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)和高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD),从线性范围,检测限,精密度等参数上进行比较,用两种方法分别测定了正常儿童和一组PKU患儿血清phe值,对结果进行统计分析。结果HPLC-UV法和HPLC-FLD法的线性范围分别为6~1512μmol/L和12~1220μmol/L,最低检测限分别为0.75μmol/L和3μmol/L,平均回收率分别为98.6%和102.5%,批内CV均<5%,批间CV分别为4.01%和7.17%,正常儿童血清phe值分别为63.2±11.6μmol/L和92.8±21.3μmol/L(-x±s);两种方法同时测定PKU血清phe结果之间的差异有显著性的意义(P=0.019),HPLC-FLD法值较高但与HPLC-UV法值呈正相关(r=0.783)。结论两种HPLC方法均能灵敏,特异地测定血清phe,满足对pku筛查的需要,HPLC-UV法在精密度及缩短分析检测时间上略优于HPLC-FLD法。     

串联质谱法和荧光分析法检测滤纸干血片苯丙氨酸的比较

目的比较荧光分析法和串联质谱法检测滤纸干血片上苯丙氨酸(Phe)水平的分布和差异,为实验室开展新生儿高苯丙氨酸血症(HPA)的筛查提供方法学依据。方法选择进行遗传代谢病筛查的滤纸干血片样本62 510例。采用荧光分析法和串联质谱法同步检测新生儿滤纸干血片的Phe浓度,同时还用串联质谱法检测酪氨酸(Tyr)浓度。采用配对Wilcoxon检验和等级相关分析评价2种方法间的差异和相关性,采用Bland-Altman一致性分析评价2种方法间的一致性。结果荧光分析法和串联质谱法均在62 510例新生儿滤纸干血片样本中检出3例HPA,敏感性均为100%。荧光分析法的阳性预期值为33.3%,串联质谱法的阳性预期值为18.8%,若联合Phe/Tyr比值,串联质谱法的阳性预期值可达100%。正常新生儿Phe浓度呈偏态分布,荧光分析法和串联质谱法检测结果60μmol/L者分别占96.31%和95.08%,≥120μmol/L者仅占0.01%和0.03%。荧光分析法的测定值先低于串联质谱法,至97%位点(Phe≈63μmol/L)处基本持平,然后逐渐高于串联质谱法,2种方法的测定值呈正相关(r=0.43,P0.01)。以不同浓度的Phe测定值作Bland-Altman分析,Phe浓度越高,2种方法的偏移越小,Phe120μmol/L的19个样本点全部落在95%的一致性限内,2种方法有很好的一致性,检测结果有可替代性。结论荧光分析法和串联质谱法检测Phe在低浓度时有差异,高浓度时一致性好。2种方法对于HPA的临床判断无影响,均能用于新生儿筛查。串联质谱法可同时检测Phe和Tyr浓度,若联合Phe/Tyr比值,检出HPA的阳性预期值很高。     

PHE/TYR比值在新生儿苯丙酮尿症筛查中的应用

目的 分析Phe/Tyr比值在新生儿苯丙酮尿症筛查中的作用.方法 采用API-300 SPOTCHECK连续流动荧光分析系统检测1103例正常新生儿的筛查血片和27例已经确诊的PKU阳性患儿血片的Phe和Tyr值,并进行分析.结果 API-300 SPOTCHECK连续流动荧光分析法的阳性复合率为103.7%,阴性复合率为99.9%.结论 Phe/Tyr 比值是提高PKU筛查准确度的重要参数.     

新生儿苯丙酮尿症两种实验室筛查方法的质量评价

目的比较筛查新生儿苯丙酮尿症(PKU)的2种检测苯丙氨酸(Phe)的方法——细菌抑制法(B IA)和荧光法。方法参加美国疾病控制中心(CDC)质量评价,分析B IA和荧光法的批内、批间误差及相对偏差,比较2种方法的结果。结果用CDC质控品测得BIA批内变异系数(CV)为14.29%,荧光法为5.85%;用不同浓度质控品测得B IA批间CV分别为25.34%、20.86%、34.78%和25.72%,荧光法为16.46%、13.22%、19.53%和15.41%;B IA的PKU阳性检出率为5.04/10万,荧光法为7.79/10万。结论荧光法较B IA具有更灵敏、准确、可定量、费时少的优点,国内今后应顺应其发展趋势,普及推广运用荧光法筛查新生儿PKU。     

血清肌酐二步酶法检测新技术研究

目的探讨二步酶法测定肌酐的实验方法。方法以肌酐酰氨基水解酶为试剂Ⅱ,以N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)和4-氨基安替比林(4-AAP)色原物作为试剂Ⅰ,建立二步酶法测定血清肌酐。通过内空白法消除内源性肌酸和改变光谱吸收方法消除脂血、溶血、黄疸干扰。采用二步酶法测定36例患者血清肌酐,并与高效液相色谱(HPLC)法和一步酶法比较;同时测定200名健康体检者血清肌酐,以建立参考范围。结果患者组肌酐二步酶法结果[(84.2±26.6)μmol/L]明显低于一步酶法[(116.6±29.6)μmol/L,t=32.12,P<0.01];与HPLC法测定结果[(83.9±26.8)μmol/L]差异无统计学意义(t=0.541 6,P>0.05),且呈良好相关性(Y二步酶法=1.042XHPLC法-0.182 1,r2=0.982 4)。二步酶法测定血清肌酐的线性范围达4 500μmol/L,平均回收率为100.8%,批内和批间变异系数(CV)分别为2.91%～4.20%和3.20%～4.60%,应用二步酶法每天测定室内质控定值血清[低(78.0μmol/L)、中(206.0μmol/L)、高(900.0μmol/L)],共测定180 d,其日间总CV分别为4.46%、5.27%、7.24%。二步酶法试剂至少能稳定180 d。健康人群血清肌酐的参考范围男性为56～132μmol/L,女性为41～109μmol/L。结论以肌酐酰氨基水解酶为试剂Ⅱ和以HDAOS、4-AAP为色原物(试剂Ⅰ)的二步酶法可以消除肌酸和脂血、溶血、黄疸血的干扰,可用于临床肌酐常规测定。     

切值重设定在串联质谱法筛查新生儿高苯丙氨酸血症中的临床价值

目的对中山市85 323例新生儿行串联质谱法筛查高苯丙氨酸血症(HPA)的结果进行回顾性分析,评价重设定苯丙氨酸(Phe)、Phe/酪氨酸(Tyr)切值在新生儿HPA筛查中的临床价值。方法选取2014年2月至2018年9月行串联质谱法筛查HPA的新生儿为研究对象,分析切值重设定前后的初筛和确诊情况,了解切值重设定的临床意义。结果切值重设定前后新生儿HPA的筛查阳性率分别为4.57%(1 716/37 527)、0.47%(223/47 796),分别确诊HPA 2、3例,该市新生儿HPA发病率约为1/17 064(5/85 323)。Phe与Phe/Tyr新切值联用对全部新筛结果、切值设定前后及男女新筛结果进行分析,筛查阳性率分别为0.02%、0.01%、0.02%、0.02%、0.02%,均明显低于分别使用Phe原新切值、Phe与Phe/Tyr原切值及HPA诊断"金标准"(120μmol/L)对其进行新筛的阳性率,进一步验证新切值筛查性能结果显示无漏筛,且随访未发现假阴性案例,表明Phe、Phe/Tyr新切值联用在保持筛查敏感性的同时,可提高新生儿HPA的筛查特异度;新生儿性别对Phe、Phe/Tyr切值的影响差异无统计学意义(P0.05)。结论串联质谱法筛查新生儿HPA在实验室积累一定样本量情况下,应重设定本实验室的参考值,以获得更高的筛查特异性,指导临床早期确诊和治疗新生儿HPA。     

酶联荧光分析法测定肌钙蛋白I的临床应用

目的 探讨酶联荧光分析(ELFA)法测定肌钙蛋白I(cTnI)的临床应用。方法 分别采用ELFA法和化学发光免疫分析(CLIA)法测定血清样品中cTnI的浓度,对ELFA法进行精密度试验、线性试验、回收试验和干扰试验;并对ELFA法与CLIA法测定cTnI的结果进行相关性分析。结果 ELFA法测定cTnI浓度,高值(30.00μg/L cTnI)和低值(0.12μg/L cTnI)的批内变异系数(CV)分别为2.81%和1.62%,批间CV分别为5.67%和3.52%。ELFA法检测cTnI的可信检测范围为0.00~30.00μg/L。当总胆红素浓度小于450μmol/L,血红蛋白浓度小于1.5g/L,三酰甘油浓度小于7.0mmol/L时,ELFA法测定cTnI无干扰。ELFA法与CLIA法测定cTnI浓度具有良好的相关性(r=0.971)。结论 ELFA法具有较好的精密度、回收率和线性范围,与CLIA法具有较好的相关性,且检测快速简便,适用于急诊检验,能满足临床要求。     

硫酸肼还原法测定血清中硝酸盐浓度

目的 建立一种简便可靠的血清硝酸盐浓度测定方法.方法 在碱性介质中用硫酸肼将去蛋白血清中的硝酸盐还原为亚硝酸盐,再用Griess试剂测定亚硝酸盐的浓度.结果 在NaOH介质(pH13.2)中,硫酸肼有最佳的还原率,56℃水浴10min,反应即可完成.该法批内CV3.58%(41.6±1.49μmol/L,n=15),批间CV6.40%(79.8±5.11μmoL/L,n=10);平均还原率94.7%;平均回收率95.1%;线性范围10～200μmol/L;参考范围32.7±15.0(±s,μmol/L).结论 该法还原反应快速、高效,重复性好,且操作简便,试剂价格低廉.     

高通量检测戈谢病和尼曼匹克病A/B型的超高效液相色谱-串联质谱法的建立

目的建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术测定干血滤纸片中酸性葡萄糖脑苷脂酶(ABG)和酸性鞘磷脂酶(ASM)活性的方法。方法将干血滤纸片样本提取液与酶作用底物和内标的混合溶液孵育过夜,反应液经萃取、氮气吹干及复溶后采用UPLC-MS/MS检测产物浓度及内标,计算酶活性。评价该方法的线性、精密度和准确性。结果 UPLC-MS/MS测定ABG和ASM活性的批内、批间精密度为3.6%~8.4%,批内、批间准确度为101%~115%。正常新生儿中ABG和ASM活性呈偏态分布(P0.01),以第0.5~99.5百分位数法确定ABG及ASM活性的参考区间分别为5.52~49.50和2.02~15.44μmol·L~(-1)·h~(-1)。经临床验证,UPLC-MS/MS能有效检出戈谢病(GD)或尼曼匹克病A/B型(NPA/B)患儿,检出率为100%。结论UPLC-MS/MS能同时测定干血滤纸片中ABG、ASM活性。该法快速、特异,可用于新生儿中GD、NPA/B的高通量筛查及临床检测。     

UPLC MS/MS method for quantification of mycophenolic acid and metabolites in human plasma: Application to pharmacokinetic study

BackgroundWe described the development and full validation of a rapid, high throughput sensible and accurate UPLC method using tandem mass spectrometry detection for mycophenolate acid (MPA) and its metabolites, MPA glucuronide (MPAG) and acyl MPA glucuronide (AcMPAG) concentration determination with MPA-D3 as internal standard in human plasma.MethodsPlasma pretreatment involved a one-step protein precipitation with acetonitrile. The separation was performed by reverse-phase chromatography on a Waters BEH HSST3 100 mm*2.1 mm*1.8 μm column. The multiple reaction monitoring transitions used for quantification were m/z 321.04 → 303.02 for MPA, 524.09 → 303.02 for AcMPAG and MPAG and 324.03 → 306.04 for MPA-D3 in the electrospray positive ionization mode.ResultsThe method was linear over the concentration range of 0.1–20 mg/L for MPA and AcMPAG and 1–200 mg/L for MPAG respectively. The intra- and inter-day precision values were below 14% and accuracy was from 94.0 to 103.3% at all quality control levels. The lower LOQ was 0.1 mg/L for MPA and AcMPAG, 1 mg/L for MPAG.ConclusionSample analysis time was reduced to 7 min including sample preparation. The present method was successfully applied to a pharmacokinetic study following oral administration of enterocoated sodium mycophenolate in de novo renal transplantation.     

液相色谱-串联质谱法检测人血浆中碘帕醇

目的建立一种稳定的检测人血浆碘帕醇的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),并对该方法进行性能评价。方法以氘代同位素作为内标,人血浆样品经直接沉淀法前处理后进样,用XSelect^TM HSS PFP色谱柱进行分离,用含0.1%甲酸-5mmol/L九氟戊酸-10%乙腈的水溶液等度洗脱;正离子电喷雾离子化扫描检测,多反应监测(MRM)扫描分析,建立检测血浆碘帕醇的LC-MS/MS方法。根据CLSI EP10-A和CLSI C62-A,评价该方法的线性范围、正确度、精密度、选择性、基质效应、稳定性。结果 LC-MS/MS检测血浆碘帕醇的线性范围为1～1 000μgI/mL(以含碘量计算);低、中、高浓度(3、50、800μgI/mL)血浆质控品检测结果与理论靶值的偏移为-6.1%～7.5%,重复性以不精密度表示,CV<6.6%(4.6%～6.6%),期间精密度CV<8.5%(6.6%～8.5%),方法回收率为92.5%～95.9%,基质效应为88.8%～95.2%;方法选择性良好,溶血和脂血因素均不影响检测结果。血浆样品在室温下放置最好不要超过48 h,在-80℃下反复冻融不超过2次,经前处理后的血浆样品4℃自动进样器中放置不超过72 h,碘帕醇可稳定检测。结论建立并评价了一种可靠的检测人血浆碘帕醇的LC-MS/MS方法。     

LC-MS/MS法测定人血浆中丙戊酸的浓度

目的建立快速、灵敏的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定人血浆中丙戊酸的浓度。方法采用乙腈沉淀蛋白法处理人血浆样本,选用Shimpack VP-ODS色谱柱(150mm×2.0mm I.D,5μm),以甲醇:5mmol/L乙酸铵(55∶45,v/v)为流动相,流速为0.4mL/min,采用API3200型三重四极杆串联质谱仪的多重反应监测(MRM)扫描方式进行监测,电喷雾离子化源,负离子方式,选择监测离子反应分别为m/z 142.9→m/z 142.9(丙戊酸)和m/z 179.0→m/z 179.0(1-庚烷磺酸)。结果丙戊酸和内标1-庚烷磺酸的保留时间分别为3.03、2.38min;血浆中丙戊酸的线性范围为0.800~80.0μg/mL(r0.99),定量下限为0.800μg/mL;批内、批间精密度(RSD)均小于15%;准确度(RE)均在±15%的范围以内;平均提取回收率为(84.1±2.4)%;平均基质效应因子为(104.3±2.0)%。稳定性试验中,在各种贮存条件下的血浆中,丙戊酸均较稳定。结论该方法适用于人血浆中丙戊酸浓度的测定及丙戊酸半钠缓释片的人体药代动力学研究。