组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

CD24基因调控根尖牙乳头干细胞的成骨分化功能

目的 研究干细胞表面标记CD24基因对根尖牙乳头干细胞成骨分化能力的影响。方法 利用CD24 shRNA基因敲除CD24进行丧失性功能研究;实时定量RT-PCR检测CD24的基因敲除效果;通过ALP活性检测、茜素红染色及钙离子定量分析明确根尖牙乳头干细胞体外成骨分化能力的变化;实时荧光定量RT-PCR检测成骨分化相关基因-I型胶原蛋白1A、I型胶原蛋白1B、骨涎蛋白、骨桥蛋白和成骨相关转录因子RUNX2的表达分析研究根尖牙乳头干细胞基因表达改变。结果 实时定量RT-PCR结果显示CD24可以在根尖牙乳头干细胞有效的被敲除;碱性磷酸酶活性结果显示敲除CD24抑制根尖牙乳头干细胞碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示敲除CD24明显抑制根尖牙乳头干细胞体外矿化能力;实时定量RT-PCR结果显示敲除CD24明显抑制I型胶原蛋白A、型胶原蛋白B、骨涎蛋白、骨桥蛋白和RUNX2的表达。结论 基因沉默CD24可以通过抑制转录因子RUNX2及成骨分化基因的表达,从而抑制根尖牙乳头干细胞体外成骨分化功能。     

组蛋白去甲基化酶KDM6A促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM6A对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法构建Flag-KDM6A慢病毒表达质粒。利用慢病毒转染构建稳定过表达KDM6A的骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶活性实验检测成骨分化早期指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力。实时：毫量RT-PCR检测成骨分化相关基因．骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果过表达KDM6A促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性、骨髓间充质干细胞体外矿化能力以及骨桥蛋白和骨钙素的表达。结论组蛋白去甲基化酶KDM6A具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的靶基因用于骨组织工程技术,促进骨组织再生。．     

丹参注射液促进人脱落乳牙牙髓干细胞成骨/成牙分化的实验研究

目的 探讨中药丹参对人脱落乳牙牙髓干细胞(SHEDs)成骨/成牙分化功能的影响.方法 利用50mg/ml的丹参注射液作用于SHEDs细胞,利用成骨/成牙分化诱导培养基诱导SHEDs定向分化.通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨/成牙分化相关基因的表达研究 SHEDs 体外成骨/成牙分化能力.Western Blot检测AKT信号分子的表达.结果 50mg/ml的丹参注射液促进SHEDs细胞ALP活性,体外矿化能力及成骨/成牙分化相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达.50mg/ml的丹参注射液促进磷酸化AKT的表达.结论 50mg/ml的丹参注射液具有促进SHEDs细胞体外成骨/成牙分化的潜能,其作用可能与激活AKT信号通路相关.     

硝苯地平作用下miR-4651对牙龈间充质干细胞成骨分化功能的影响

目的 研究miR-4651在硝苯地平作用下对牙龈间充质干细胞(GMSCs)成骨分化的影响。方法 利用miR-4651mimics及miR-4651inhibitor在GMSCs进行丧失性及获得性功能研究。定量RT-PCR检测miR-4651表达,碱性磷酸酶活性(ALP)测定、茜素红染色、钙离子定量以及定量RT-PCR检测牙龈间充质干细胞成骨/成牙本质分化相关基因的表达。结果 过表达miR-4651能明显促进牙龈间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨/成牙本质分化相关基因的表达。敲减miR-4651能明显抑制牙龈间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨/成牙本质分化相关基因的表达。在1μg/ml硝苯地平作用下,过表达miR-4651同样能促进牙龈间充质干细胞骨向分化。1μg/ml硝苯地平作用下,敲减miR-4651同样是抑制牙龈间充质干细胞的骨向分化。结论 即使在一定量硝苯地平作用下,miR-4651仍可促进牙龈间充质干细胞的成骨分化。     

炎症微环境下芦丁对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究芦丁（rutin）对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 采用有限稀释法分离纯化获得牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定牙周膜干细胞。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激牙周膜干细胞,建立体外炎症模型。实验分为4组,第1组使用α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第2组使用含有脂多糖的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第3组在含有脂多糖的α-MEM培养基加入芦丁培养牙周膜干细胞,第4组使用含有芦丁的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞。通过碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测试、茜素红染色、RT-PCR以及蛋白免疫印迹等方法检测成骨分化能力的改变。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析。结果 CCK-8和碱性磷酸酶活性测试结果显示,10 μmol/L芦丁对炎症状态下牙周干细胞增殖和成骨分化作用最明显。碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,10 μmol/L芦丁可以改善炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。RT-PCR、蛋白免疫印迹结果显示,芦丁可以增强炎症状态下COL1、ALP、RUNX2等成骨基因和成骨蛋白的表达。结论 芦丁可以增强炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

BCOR基因敲除促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的研究BCL6共抑制因子-BCOR对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法利用慢病毒载体的BCORshRNA基因敲除BCOR,进行丧失性功能研究。通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨分化相关基因的表达,观察骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果BCOR在牙源性间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的表达无明显差异。基因敲除BCOR促进了骨髓间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨分化相关基因骨涎蛋白、骨钙素的表达。结论BCOR基因表达降低能促进骨髓间充质干细胞成骨分化,证实BCOR是骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制基因。     

过表达甲基转移酶样3修复炎症来源牙周膜干细胞的成骨能力

目的探讨N⁶-甲基腺嘌呤（m⁶A）修饰与甲基转移酶样3（METTL3）在牙周膜干细胞（PDLSC）成骨分化和成脂分化中的作用。 方法使用流式细胞术、细胞集落形成实验分别鉴定PDLSC的表面标志物和增殖能力。通过茜素红染色和油红O染色分别检测PDLSC的成骨和成脂分化潜能。在人牙周膜干细胞（hPDLSC）和炎症来源牙周膜干细胞（pPDLSC）中分别构建METTL3过表达和敲低模型,成骨诱导一定时间,通过实时定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）、茜素红染色和油红O染色分别在mRNA水平、蛋白水平和宏观水平检测成骨和成脂的变化。两样本比较使用独立样本t检验,多组样本比较使用单因素方差分析。 结果（1）流式细胞术结果显示,hPDLSC和pPDLSC均阳性表达CD29（100.0%,98.0%）、CD105（100.0%,99.5%）和CD146（31.5%,17.8%）,阴性表达CD34（1.3%,0.4%）和CD45（1.4%,0.4%）。（2）细胞集落形成实验结果显示,hPDLSC和pPDLSC的集落形成数量分别为55±5和72±8,hPDLSC的细胞增殖能力较pPDLSC低（t = 3.16,P = 0.034）。（3）茜素红染色和油红O染色说明,两种细胞均具有成骨和成脂分化能力,hPDLSC具有更强的成骨分化能力（t = 27.77,P<0.001）,而pPDLSC具有更强的成脂分化能力（t = 5.02,P = 0.007）。（4）成骨诱导培养7 d后的慢病毒转染模型中,METTL3过表达组比过表达对照组的成骨关键基因Runx2的mRNA表达水平高,在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组的表达量是3.63 ± 1.15和1.61 ± 0.38,分别是其过表达对照组的3.39倍（t = 3.777,P = 0.020）和1.71倍（t = 2.948,P = 0.042）;而在METTL3敲低组较敲低对照组低,在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组的表达量是0.16 ± 0.03和0.26 ± 0.07,分别是其敲低对照组的0.15倍（t = 9.669,P<0.001）和0.26倍（t = 8.767,P<0.001）。同样地,Runx2的蛋白表达水平也发生相同改变。将转染后的细胞进行21 d的成骨诱导培养后进行茜素红染色,结果显示METTL3过表达组较过表达对照组染色深且钙化结节较大,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组是28.47% ± 3.82%和8.55% ± 0.43%,分别是其过表达对照组的1.78倍（t = 5.012,P = 0.007）和1.76倍（t = 7.293,P = 0.002）,而在METTL3敲低组较敲低对照组染色浅且钙化结节较小,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组是6.36% ± 2.00%和3.78% ± 0.56%,分别是其敲低对照组的0.35倍（t = 4.444,P = 0.011）和0.43倍（t = 5.337,P = 0.006）;将转染后的细胞进行21 d的成脂诱导培养,再进行油红O染色,结果显示脂滴的大小及数量在METTL3过表达组较过表达对照组少,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组是0.89% ± 0.11%和1.10% ± 1.15%,分别是其过表达对照组的0.24倍（t = 5.454,P = 0.006）和0.49倍（t = 2.935,P = 0.043）,而在METTL3敲低组则比敲低对照组的脂滴更大且多,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组是3.60% ± 1.08%和5.34% ± 1.31%,分别是其敲低对照组的1.94倍（t = 2.794,P = 0.049）和2.93倍（t = 4.131,P = 0.015）。 结论pPDLSC的METTL3表达水平低于hPDLSC;METTL3的过表达可促进hPDLSC和pPDLSC的成骨分化,并抑制两者的成脂分化。     

乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响

目的：观察乳铁蛋白（lactoferrin,LF）对体外培养的人牙周膜细胞（HPDLCs）增殖、迁移和成骨分化的影响。方法：原代培养并鉴定人牙周膜细胞,稳定传代后用 MTT 比色法、Transwell 法及划痕试验检测浓度分别为0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白对牙周膜细胞增殖和迁移的影响;矿化条件下,0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白作用牙周膜细胞后,茜素红染色法和实时荧光定量 PCR 检测矿化能力及成骨相关基因的表达。结果：10、20μg／ml 乳铁蛋白均能促进 HPDLCs 增殖、迁移（P ＜0．05）。10、20μg／ml 乳铁蛋白组矿化结节数量增多（P ＜0．05）,碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）表达量均有升高（P ＜0．05）。结论：乳铁蛋白能够促进人牙周膜细胞增殖、迁移与成骨分化。     

IP-10和IL-6在口腔扁平苔藓中表达的研究

目的:检测正常口腔黏膜与口腔扁平苔藓(OLP)黏膜的上皮和固有层结缔组织中干扰素诱导蛋白10(IP-10)、细胞因子白细胞介素-6(IL-6)mRNA的表达,探讨其在OLP中的作用。方法:应用荧光实时定量RT-PCR技术检测10例OLP黏膜和6例正常口腔黏膜的上皮和固有层结缔组织中IP-10、IL-6mRNA的表达量。结果:OLP黏膜上皮和固有层结缔组织中IP-10、IL-6mRNA的表达均较正常口腔黏膜明显升高(P<0.05),但IP-10、IL-6mRNA的表达量没有明显差异(P>0.05)。结论:OLP组织中趋化因子IP-10、细胞因子IL-6表达量改变可能与其发生发展有一定关系。     

张力作用下牙周组织破骨细胞分化因子、破骨细胞发生抑制因子表达变化的研究

目的:运用原位杂交的方法,观察破骨细胞分化因子(ODF)、破骨细胞发生抑制因子(OCIF)在正畸大鼠牙周组织改建过程中张力侧的表达变化,探讨ODF、OCIF与正畸牙周组织改建的关系。方法:8周龄成年健康雄性SD大鼠30只,随机分为对照组、牙齿移动1d组、3d组、5d组、7d组,共5组,每组6只。在大鼠上颌右侧第一磨牙与上颌切牙之间安置正畸矫治器装置,施力50g。在相应时间段处死实验动物,取材固定,进行原位杂交染色、图像分析。结果:在牙齿移动3d后,OCIF原位杂交染色在张力侧逐渐深染,OCIF mR-NA阳性细胞数量逐渐增多,OCIF阳性表达在5d时达到最高,并可见到有新骨形成;7d时OCIF阳性表达及分布情况与3d时相类似。张力侧牙周膜细胞、成骨细胞的ODF原位杂交染色阳性反应随天数的增加有逐渐增强趋势,并可观察到有ODFmRNA阳性破骨细胞出现,但表达变化并不明显。结论:ODF及OCIF参与了正畸牙周组织改建过程,OCIFmRNA在张力区随正畸牙齿移动表达升高具有时间依赖性。     

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目的通过观察分析中重度牙周炎患者血清中对氧磷酶-1（PON1）活性及白细胞介素-6（IL-6）在牙周基础治疗前后的变化,探讨PON1和IL-6与牙周病之间的相关性以及两者在牙周病病情变化中的作用。方法2012年5月至2013年2月在辽宁省人民医院体检中心体检的牙周健康人群30名（牙周健康组）及口腔科就诊的中重度牙周炎患者39例（牙周炎组）,对所有受试者进行基础治疗,检查治疗前后PON1、IL-6以及临床牙周检查指标。结果牙周健康组与牙周炎组在基础治疗前比较：牙周炎症指标[出血指数（BI）、牙周探诊深度（PD）]及血清IL-6差异均有统计学意义（P〈0．05）,血清中PON1活性差异无统计学意义（P〈0．05）。牙周健康组在牙周基础治疗前后各项指标差异均无统计学意义（P〉0．05）。牙周炎组在牙周基础治疗前后比较：牙周炎症指标BI、PD、血清PON1及IL-6与治疗前比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论牙周健康人群和中重度牙周炎患者血清PON1活性无差异;牙周基础治疗可改善中重度牙周病患者牙周健康状况,提高血清中PON1活性,降低IL-6水平;中重度牙周炎患者在牙周基础治疗前后血清中PON1活性和IL-6水平的变化存在负相关性。     

Muscle contraction accelerates IL-6 mRNA expression in the rat masseter muscle

OBJECTIVE: This study was conducted to determine if interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1beta (IL-1beta) mRNA expression increase in response to muscle contraction caused by repetitive electrical stimulation of the rat masseter muscle. METHODS: Male Wistar rats weighing 140-160 g were divided randomly into the following three groups: electrical stimulation (ES) group (n=21), carrageenan injection (CI) group (n=24), and ES under dantrolene sodium (muscle relaxant) injection (ESDI) group (n=7). ES or CI was done to the left masseter; and mock ES or mock CI to the right. Muscle tissues on both sides were sampled for total RNA isolation. Real-time RT-PCR was performed, with the cyclophilin A (CypA) mRNA level in each sample as an internal control. Mean relative IL-6 (il-6/cypA) and IL-1beta (il-1beta/cypA) mRNA levels were compared between the experimental and mock-treated sides within each group. RESULTS: Mean IL-6/CypA levels in the ES- or CI-treated muscle significantly increased, without any significant incremental change observed in either mock-treated muscle. Interestingly, the increase in the il-6/cypA level caused by the ES was suppressed by the injection of dantrolene sodium in the ESDI group. Furthermore, the mean il-1beta/cypA level in the CI-treated masseter also significantly increased without any significant incremental change observed in the mock-treated muscle. However, there was no significant difference in the mean il-1beta/cypA levels in the masseter between the ES- and the mock-treated sides. CONCLUSIONS: These results show that IL-6 mRNA expression in the rat masseter muscle was accelerated by the CI or by repetitive muscle contraction induced by ES. Since the mRNA level of IL-1beta, a well-known proinflammatory cytokine, was not altered by the contraction, the accelerated IL-6 mRNA expression elicited by the muscle contraction does not seem to be related to local inflammation.     

富血小板血浆对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨影响的实验研究

目的:探讨富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bonemarrowmesenchymal stem cells,rBMSC)体外成骨能力的影响。方法:体外分离、培养rBMSC,经细胞表面标记物检测和体外诱导分化鉴定后,分别采用MTT法检测PRP对细胞增殖活性的影响;细胞化学法检测PRP对成骨诱导后rBMSC碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)活性的影响;RealTime-PCR检测PRP对细胞成骨分化指标Col-3、OPN mRNA表达水平的影响;扫描电镜观察PRP对rBMSC在Bio-Oss上粘附的影响。结果:rBMSC传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;细胞表面标记物CD29阳性率为88.2%,CD90阳性率为98%,CD34细胞阴性率为2.8%,CD45细胞计数阴性率为2.7%;成骨诱导21 d后,茜素红染色可见明显矿化结节;成脂诱导14 d后,油红O染色可见红色脂滴形成。MTT检测,10%PRP组在培养1、3、5、7、9 d各时间点的OD值均显著高于空白对照组(P<0.05)。ALP染色显示,无论是诱导培养7 d还是14 d,成骨诱导液+PRP组的ALP活性均明显高于单纯成骨诱导液组,差异有统计学意义(P<0.05);另外,各组不同诱导培养时间点相比还发现,无论是实验组还是对照组,在诱导7 d时,ALP活性均较低;而在14 d,ALP的活性明显升高。RealTime-PCR检测显示,单纯10%PRP诱导培养7 d和14 d后细胞Col-3、OPN mRNA水平虽稍低于成骨诱导液组,但明显高于空白对照组,而10%PRP联合成骨诱导液诱导培养7 d和14 d的Col-3、OPN mRNA的表达量更高,与其他各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。另外各组诱导培养14 d的Col-3、OPN mRNA水平显著高于相应的7 d组(P<0.05)。扫描电镜结果显示PRP明显促进rBMSC在Bio-Oss骨粉上的粘附与伸展。结论:PRP对rBMSC的增殖、成骨分化,以及在生物材料上的粘附能力均具有明显的促进作用。     

Requirement of alveolar bone formation for eruption of rat molars

Tooth eruption is a localized event that requires a dental follicle (DF) to regulate the resorption of alveolar bone to form an eruption pathway. During the intra-osseous phase of eruption, the tooth moves through this pathway. The mechanism or motive force that propels the tooth through this pathway is controversial but many studies have shown that alveolar bone growth at the base of the crypt occurs during eruption. To determine if this bone growth (osteogenesis) was causal, experiments were designed in which the expression of an osteogenic gene in the DF, bone morphogenetic protein-6 (Bmp6), was inhibited by injection of the first mandibular molar of the rat with a small interfering RNA (siRNA) targeted against Bmp6. The injection was followed by electroporation to promote uptake of the siRNA. In 45 first molars injected, eruption was either delayed or completely inhibited (seven molars). In the impacted molars, an eruption pathway formed but bone growth at the base of the crypt was greatly reduced compared with the erupted first-molar controls. These studies show that alveolar bone growth at the base of the crypt is required for tooth eruption and that Bmp6 may be essential for promoting this growth.     

BMP9联合NGF对C3H10T1/2间充质干细胞骨向分化能力影响的实验研究

目的:探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)与神经生长因子(NGF)联合处理对间充质干细胞(MSCs)骨向分化的影响.方法:以重组腺病毒法将BMP9导入C3H10T1/2细胞,构建MSCs骨向分化实验模型,设定分组为绿色荧光(GFP)对照组、NGF单独处理组、BMP9单独处理组以及BMP9+ NGF联合处理组,分别在处理3h、12 h、24 h、48 h、3d、7d后检测早期成骨分化标志物Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2(RUNX2)和碱性磷酸酶(ALP)在细胞中的表达.检测方法采用ALP染色、实时定量RT-PCR检测mRNA转录水平以及Western blot检测蛋白表达.结果:BMP9+ NGF组较各单独处理组ALP活性显著增加,Ⅰ型胶原、RUNX2的mRNA水平在BMP9+ NGF组的表达明显高于其他各单独处理组,且各组在3h即出现显著差异;RUNX2蛋白在各实验组均表达,BMP9+ NGF组表达最高.结论:BMP9联合NGF在成骨诱导间充质干细胞分化早期,协同促进其骨向分化.