mdr1基因在人肺腺癌多药耐药细胞系LC－3／DDP中的表达

目的研究多药耐药基因（ｍｄｒ１）表达与人肺腺癌多药耐药细胞系（ＬＣ－３／ＤＤＰ）耐药性产生的关系。方法应用地高辛标记的ｍｄｒ１ｃＤＮＡ探针，采用原位杂交方法，检测ｍｄｒ１基因在人肺腺癌多药耐药细胞系ＬＣ－３／ＤＤＰ中的表达水平。结果该细胞系与亲代细胞比较，存在ｍｄｒ１基因超表达。结论ｍｄｒ１基因表达是人肺腺癌多药耐药细胞系ＬＣ－３／ＤＤＰ产生耐药性的相关因素。     

人类卵巢癌顺铂耐药细胞株OV1228／cDDP的建立及其生物学特性

 目的　建立人类卵巢癌细胞顺铂耐药细胞株OV1228／cDDP,并对其生物学特性进行检测。方法　采用顺铂浓度梯度递增法,建立人类卵巢癌顺铂耐药细胞株。通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、药物敏感试验、mdr-1和PKC-α基因及蛋白表达水平的测定,来评价OV1228／cDDP的生物学特性。结果　成功建立了OV1228／cDDP耐药细胞株,耐药指数（RI）为5.97,对多柔比星和5-氟尿嘧啶具有一定的交叉耐药性。与OV1228相比,OV1228／cDDP细胞异型性增加、细胞倍增时间延长;mdr-1和PKC-α在基因和蛋白表达水平均明显增高。结论　OV1228／cDDP细胞对顺铂耐药性稳定,并呈现一定的多药耐药特性,为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。     

K562／ADM耐药细胞株的建立及其生物学特性的初步观察

我们建立的K562/ADM耐药细胞株,在ADM浓度为2.4μg/m1(4.46μM)中已稳定培养3.5个月,传了30—35代,K562/ADM亦具有多药耐受件(Multidrug Resistance,MDR)的特点,对ADM、VCR、AT—1258和DDP的耐受性分别为K562的114.7、94.0、13.3和7.4倍,但对5—FU不产生交叉耐药。K562和K562/ADM的倍增时间分别为19.2h和52.8h,集落生成率分别为37.5％和11.1％,K562染色体数为34—68,中位数为56;K562/MDM染色体数为32—90,中位数为50,K562/ADM可做为耐药机理和克服耐药措施研究的极好模型。     

人大细胞肺癌多药耐药株H460/cDDP的建立及其生物学特性

目的：建立人大细胞肺癌多药耐药株H460/cDDP．并对其生物学特性进行测定。方法：以人大细胞肺癌细胞株H460为亲本细胞．采用顺铂大剂量问歇诱导法建立多药耐药细胞株H460／cDDP。光镜下观察其形态学变化；MTT法测定药物敏感性；锥虫蓝拒染实验测定细胞生长曲线、倍增时间；进行染色体核型分析；棵鼠成癌实验测定其体内成瘤活性。结果：历时近6个月建成人大细胞肺癌多药耐药株H460／cDDP．经鉴定其对顺铂的耐药指数为10．21，对5-氟尿嘧啶，多柔比星(阿霉素)、依托泊苷(足叶乙甙)、甲氨蝶呤有不同程度的交叉耐药。H460／cDDP较亲本细胞分裂高峰延迟，倍增时间由20．78小时延长至3646小时．细胞形态改变，染色体变化不突出。经过反复冻存．复苏．上述特性保持稳定．并具有体内成瘤活性，成瘤时间较亲本细胞有所延迟。结论：新建大细胞肺癌多药耐药株H460／cDDP呈中等度耐药、多药耐药表型稳定且具有体内成瘤活性，可用于下游实验。     

非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP中microRNA表达的初步研究

目的:应用miRNA芯片技术检测非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549及顺铂(DDP)耐药株A549/DDP miRNAs表达的差异.方法:MTT法检测A549/DDP相对于其亲本细胞A549的耐药性和耐药倍数;分别提取2种细胞的总RNA进行质检;microRNA芯片检测NSCLC细胞株A549及对应的DDP耐药株A549/DDP中miRNA表达差异;采用real-time PCR验证结果.结果:DDP对A549和A549/DDP细胞的IC50值分别为7.47和137.32μmol/L,两者差异有统计学意义(P＜0.01),耐药倍数为18.38倍.microRNA芯片结果显示,耐药株A549/DDP与亲本细胞系A549比较有34条有差异表达的miRNA(19条上调,15条下调)差异比值＞1.5倍或＜0.67倍,P＜0.05;real-time PCR的结果进一步证实miR-21、miR-31和miR-374在A549/DDP中显著上调,而miR-378、miR-886-5p、miR-886-3p和miR-520c-3p在A549/DDP中显著下调.结论:A549/DDP与A549的miRNA的表达谱存在差异,miRNA可能参与NSCLC DDP耐药,为进一步研究miRNA在NSCLCDDP耐药机制中的作用奠定基础.     

人喉癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的:建立人喉癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)耐药细胞系,为喉癌的耐药机制研究提供模型。方法:以高剂量浓度递增间歇给药的方法诱导筛选人喉癌Hep-2的多药耐药细胞株Hep-2/5-FU,比较两组细胞的形态和倍增时间;MTT法确定细胞的IC50及其耐药指数;流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布以及细胞内的罗丹明聚集;实时定量PCR法检测MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测相应MDR1-P蛋白的表达。结果:建成性能稳定的Hep-2/5-FU耐药细胞株,并与顺铂及长春新碱有不同程度的交叉耐药性,且Hep-2/5-FU细胞倍增时间较Hep-2细胞延长[(31.25±4.37)h vs(25.62±3.53)h,P<0.05]。Hep-2/5-FU细胞G0/G1期比例升高[(45.6±3.4)%vs(30.5±1.2)%,P<0.05],而S期比例明显降低[(32.1±4.2)%vs(52.4±3.6)%,P<0.05];Hep-2细胞内的罗丹明较Hep-2/5-FU细胞明显升高[(89.83±0.52)%vs(14.38±0.48)%,P<0.01];Hep-2/5-FU细胞MDR1 mRNA[(13.69±1.12)vs(17.82±0.61),P<0.05]及其编码的MDR1-P蛋白水平高于Hep-2细胞。结论:Hep-2/5-FU细胞株具有明确及稳定的多药耐药性,为喉癌的耐药机制提供了研究的模型。     

人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其生物学特性研究

目的建立耐紫杉醇的人肺腺癌细胞株模型SPC-A1/Taxol,并初步研究其生物学特性。方法应用浓度递增和短时作用法,从人肺腺癌细胞株SPC-A1中诱导分离出对紫杉醇耐药的细胞亚株(SPC-A1/Taxol)。采用MTT法检测耐药细胞的耐药指数及对抗癌药物的敏感性;光镜和透射电镜观察细胞形态;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布;以免疫细胞化学染色检测多药耐药基因(mdr1)的表达产物P-糖蛋白(P-gp)。结果经MTT法检测,SPC-A1/Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代SPC-A1细胞的759.46倍,对Taxotere、NVB、ADM呈高度耐药状态,对VP-16和HCPT有轻度的耐药,而对DDP、GEM以及中药榄香烯乳无交叉耐药现象。耐药细胞的群体倍增时间是亲代细胞的1.32倍;细胞形态未见明显改变;G0 G1细胞比例减少,S期细胞增多。SPC-A1细胞无P-gp表达,SPC-A1/Taxol则高表达P-gp。结论SPC-A1/Taxol肺腺癌细胞株是一个明确的多药耐药模型,具有耐药细胞的基本生物学特性,推测其多药耐药性与P-gp的高表达相关。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立,耐药机制的研究

目的通过建立人卵巢癌体外耐药模型，研究卵巢癌对顺铂的耐药特征和机制。方法应用浓度递增和短时间作用法。从人卵巢癌细胞A2780中培养对顺铂耐药细胞亚株（A2780／DDP）。采用MTT法检测耐药细胞的耐药指数及对抗癌药物的敏感性。而高效液相色谱仪检测耐药细胞内顺铂含量。以及应用RT－PCR法和免疫组化法检测MDRI和GST－π的表达情况。结果（1）A2780／DDP对DDP的耐药倍数为10．59．并且其倍增时间较A2780细胞延长，对VCR、MTX呈高度耐药状态，对Carp、Pym、CTX、VP16有不同程度的耐药，而对ADM、5－FU、KSM无交叉耐药现象。（2）耐药细胞内顺铂含量明显低于A2780细胞。（3）耐药细胞内GST－π的表达呈强阳性，而MDRI只有在高度耐药细胞呈弱阳性。结论A2780细胞对顺铂的耐药是获得性的，并呈多药耐药特征，其耐药的主要原因是与谷胱甘肽解毒途径有关的酶表达增多有关。GST一π表达过度导致细胞内药物浓度降低有关。     

小鼠多药耐药白血病细胞系的建立及其生物学特性观察

目的：建立小鼠多药耐药白血病细胞系P388/VCR并研究其生物学特性。方法：小鼠淋巴细胞白血病细胞系P388,通过长期、单一、逐步提高浓度的方法建立多药耐药的白血病细胞系P388/VCR。采用悬浮细胞培养和半固体培养观察该细胞系的生长规律：流式细胞术分析细胞周期分布及柔红霉素在细胞内的积聚量;RT-PCR方法检测mdrLa基因表达;四氮甲基唑蓝(MTT)法研究P388/VCR细胞系的耐药谱。结果：经过6个月单一、小剂量及间歇给药的方法诱导P388细胞成为多药耐药细胞系P388/VCR。与亲本细胞系P388比较,细胞生长曲线及倍增时间无明显差异,软琼脂培养集落形成率及大集落形成率差异不显著。细胞周期分析P388/VCR细胞S期比例降低。P388／VCR细胞除对原诱导药物具有耐药性外,对其他多种抗肿瘤药物如柔红霉素、高三尖杉酯碱、米托蒽醌、足叶乙苷等也具有交叉耐药性。流式细胞仪检测细胞内柔红霉素含量P388/VCR细胞平均荧光值为3．72,明显低于P388细胞的17．31。RT-PCR检测mdrla基因的表达结果为：P388细胞阴性,P388/VCR细胞阳性。结论：多药耐药细胞系P388／VCR具有mdrla基因表达阳性及对多种抗肿瘤药物耐药的特征。     

人膀胱癌多药抗药性建立及逆转的实验研究

目的建立抗药细胞模型，研究维拉帕米和奎宁对膀胱癌抗药性的逆转及其机制。方法应用阿霉素（ＡＤＭ）大剂量短暂冲击结合低浓度递增法，建立抗药细胞模型，测定抗癌药物５０％抑制浓度和细胞内阿霉素浓度。结果获得了具有多药抗药性的ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞，该细胞对ＡＤＭ的敏感性下降了２１倍，同时对表柔比星（表阿霉素，ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、长春新碱、依托泊甙也具有显著的交叉耐药性，对顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶和甲氨蝶呤无抗药性。ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞在脱离ＡＤＭ诱导第８周后，其抗药性保持９０％以上。ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量显著低于ＢＩＵ－８７细胞（Ｐ＜０．０５）；维拉帕米、奎宁能使ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量增加（Ｐ＜０．０５），两者联合应用基本上可逆转ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞的抗药性。结论（１）ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞具有多药抗药性（ＭＤＲ）表型，且抗药性稳定。（２）细胞内ＡＤＭ聚积量减少是抗药细胞的重要变化，维拉帕米、奎宁能逆转ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞的抗药性，可能与增加细胞内ＡＤＭ聚积量有关。     

三氟拉嗪逆转肺癌细胞多药耐药性研究

目的研究三氟拉嗪（ＴＦＰ）逆转肺癌细胞多药耐药的作用。方法应用ＭＴＴ比色法体外实验研究三氟拉唪对多药耐药性人肺癌细胞株Ａ５４９／阿霉素（ＡＤＭ）耐药性的逆转作用。结果（１）ＴＦＰ对细胞具有药物浓度依赖性毒性作用，ＩＰＰＣ浓度的ＴＦＰ细胞抑制率可达２９．７％±８．７％。（２）ＴＦＰ可显著逆转细胞对顺铂、长春新碱、阿霉素的耐药性，与单独化疗药物比较，有显著差异（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。其作用同样具有药物浓度依赖性，各药物浓度间细胞抑制率有显著差异（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。结论三氟拉嗪具有逆转肺癌细胞耐药的作用。     

人肺腺癌SPC—A—1细胞系mtDNA限制酶切分析

为了探讨线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）在细胞癌变中的作用,实验采用一步法快速制备癌细胞系ｍｔＤＮＡ,用ＰｖｕⅡ、ＸｈｏⅠ、ＰｓｔⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＢｓｔＥⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＨｐａⅠ、ＢｃｌⅠ、ＥｃｏＲⅤ、ＳｃａⅠ和ＸｂａⅠ共１１种限制性内切酶对ＳＰＣ－Ａ－１细胞系的ｍｔＤＮＡ进行了限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析,并根据单酶切及双酶切结果,构建了ＳＰＣ－Ａ－１细胞系ｍｔＤＮＡ限制性酶切图谱。结果发现,     

人鼻咽癌裸鼠移植瘤SUNT─1及其体外培养上皮细胞株SUNE─1细胞遗传学研究

对我所建成的鼻咽低分化癌的ＥＢ病毒核抗原阳性（ＥＢＮＡ）的裸鼠移植瘤ＳＵＮＴ－１及其体外培养上皮细胞株ＳＵＮＥ－１，分别于各代进行细胞遗传学分析，结果显示ＳＵＮＴ－１和ＳＵＮＥ－１癌细胞染色体的数目和结构均有相似的变化；染色体数呈非整倍体改变，并以亚四倍体为主，染色体畸变则以易位、重排、缺乏和等臂染色体为多见并形成较恒定的标记染色体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ５和Ｍ６，涉及３号染色体改变较多。提示进一步研究克隆ＳＵＮＦ－１和ＳＵＮＴ－１亚株的细胞遗传学和ＥＢ病毒基因存在变化，将为深入探讨鼻咽癌病因提供更多启示。     

温热与卡铂联合对胃腺癌（SGC－7901）细胞的作用

本实验以体外培养人胃腺癌（ＳＧＣ－７９０１）细胞为实验模型，选择卡铂（ＣＢＤＣＡ）与温热４０℃、４２℃联合应用，采用先药后热、热药同时、先热后药３种方案，对细胞的生长抑制及杀伤规律进行了观察。表明：１．温热与ＣＢＤＣＡ对ＳＧＣ－７９０１细胞均有一定的抑制增殖和直接杀伤作用；温热与药物联合应用对细胞具有协同抑制增殖和杀伤作用。２．温热和ＣＢＤＣＡ的联合对ＳＧＣ－７９０１细胞的杀伤和生长抑制作用均较温热或药物单独作用强，但序贯方面以热药同时为佳。３．温热４Ｏ℃作用后细胞“爆发性生长”，表明单纯加热低于４２℃是不适宜的。     

K562／Adm多药耐药细胞株生物学特性的进一步研究

采用流式细胞仪及逆转录－多聚酶链式反应技术对所建立的Ｋ５６２／Ａｄｍ细胞株生物学特性进一步研究。结果表明该耐药细胞对化疗药物的摄取能力明显降低，细胞跨膜糖蛋白Ｐ－１７０及编码该蛋白的ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ具有过度表达。细胞酶学研究发现耐药细胞Ｇ６ＰＤ及６ＰＧＤ活性明显升高，尤以Ｇ６ＰＤ为著。该细胞为多药耐药性及其相关机制的研究提供一良好模型。