华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIuⅠ和BclⅠ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中。结果成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NS5A区ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。     

HCV1b亚型ISDR变异影响PEG-IFN/RBV抗病毒疗效的新特点分析

目的 探讨HCV干扰素敏感决定区(ISDR)氨基酸(aa)序列变异度对聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)联合利巴韦林(RBV)治疗1b亚型慢性丙型肝炎(CHC)疗效的影响.方法 58例HCV 1b亚型慢性感染者采用PEG-IFN/RBV联合方案治疗48周,并随访24周.定量检测血清HCV RNA,逆转录-聚合酶链反应扩增治疗前血标本中HCV ISDR片段并测序,MEGA 4分析氨基酸序列变异度;二分类Logistic回归分析各变量与持续病毒学应答(SVR)之间的关系.结果 治疗前血清HCV的ISDR氨基酸序列与HCVJ株比较,15例为野生型(未突变),42例为中间型(1-3个突变),1例为突变型(≥4个突变).其中2218位点突变最多,约为60.3％(35/58).dSDR aa突变数目与SVR关系密切(P=0.000),ISDR aa突变数≥2的CHC组所获得的EVR和SVR明显高于aa突变数＜2的CHC组(P=0.041/P=0.012).结论 华南HCV 1b亚型ISDR突变型(氨基酸变异≥4)极少.ISDR aa变异能够预测SVR;采用PEG-IFN/RBV联合方案治疗,对SVR有预测价值的ISDR aa突变数可由4个减少为2个.     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

丙型肝炎病毒C，E2，NS3区基因嵌合重组载体的构建

目的：构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。方法：设计合成3对寡核苷酸引物，用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCV C区、E2和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp)，分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌XL1－Blue，分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致，证实符合表达框架。结论成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3.     

丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆及序列比对分析

目的:研究HCV N S5A区基因的结构与功能,为提高干扰素(IFN)治疗HCV感染的有效性提供依据,及为建立以N S5A蛋白做抗原的新一代诊断试剂盒,提高HCV感染检出率作出有益的尝试。方法:以含HCV 1b全长cDNA的质粒HCV 17为模板,利用巢式PCR扩增出一段长约500bp的cDNA片段,以此基因片段作为目的基因,进行T-A克隆,构建PMD 18-T-N S5A。结果:经酶切及测序证实,PMD 18-T-N S5A质粒中的插入基因片段为HCV 1b N S5A区部分基因,与HCV标准株HCV J序列进行比对分析,核苷酸和氨基酸序列的同源性均为90%以上,并且该区段包含了干扰素敏感决定区(ISDR)。结论:建立HCVN S5A基因片段稳定的无性繁殖系,并进行同源性分析对研究ISDR序列与IFN疗效的关系是非常重要的;通过基因重组表达N S5A蛋白,可用于HCV诊断试剂盒的研究。     

丙型肝炎病毒C,E2,NS3区基因嵌合重组载体的构建

【目的】构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。【方法】设计合成3对寡核苷酸引物,用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCVC区、E2区和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp）,分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,逐个定向连接到质粒pcDNA3中,转化宿主菌XL1-Blue,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。【结果】酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符,测序结果与文献报道序列及预计结果一致,证实符合表达框架。【结论】成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用

目的构建含有登革Ⅱ型病毒（DENV-2）前膜蛋白（prM）基因反向重复序列（irRNA）的重组质粒,评价其抑制病毒复制的
效果。方法DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoRⅠ的识别位点,将经RT-PCR 扩增
的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引
入酶切位点NheⅠ和BglⅡ,经RT-PCR 扩增prM 全长基因片段插入pMD18-T-vector 中,形成含有正向序列的重组质粒
pMD18-T-prM。限制性内切酶NheⅠ和KpnⅠ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线
性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA
用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果。结果成功构
建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量
PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28%;实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒
拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组（P<0.05）。结论DENV-2 prM反向重复
序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据。
     

淮北市HCV感染者基因亚型分布特征及1b型天然耐药突变分析

目的：分析淮北市HCV感染病人基因亚型分布特征及1b型天然耐药突变情况，为HCV临床抗病毒治疗和感染防控提供依据。方法：选取2019-2022年就诊于淮北矿工总医院住院的HCV感染者(未经任何DAAs治疗)HCV-RNA阳性血清样本，抽提RNA后逆转录，采用巢式PCR扩增NS5B、NS5A及NS3/4A区域基因序列，产物送交测序公司测序。采用Mega11.0软件对测序结果进行序列比对分析。结果：结果 HCV 1b型(68.63%)为主要亚型，2a型次之(29.41%),此外检出3a型2例(1.96%)。HCV亚型的分布与性别、年龄无明显相关(P>0.05),1b型多见于≥55岁年龄组中。RASs主要类型为：NS5B区C316N(100.00%);NS5A区Q54H(40.47%),Y93H(19.05%);NS3/4A区Q86P(30.88%),I71V+Q86P(19.12%),V170I+Q86P(14.71%)及T72I/A+Q86P(13.24%)。其中突变频率较高的RASs依次为：C316N(100.00%)、Q54H(60.00%)、Q86P(53.78%)、Y93H...     

抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义

目的：构建抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法：根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后线性的pSilencer^TM 3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western  blotting印迹法鉴定 NS5A蛋白表达。结果：对重新构建的pSilencer^TM3.1-H1neoHCV  NS5A- R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4　348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的 NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒 NS5A蛋白在相对分子质量5　600处出现条带。结论：设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。     

丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析

目的 对丙型肝炎病毒(HCV)NSSB区基因克隆并测序，研究其变异状况。方法 从HCV RNA阳性血清中抽提病毒RNA，利用巢式RT-PCR对NS5B区基因进行扩增，将扩增获得的靶cDNA克隆至P^KPL-3a质粒载体中，并以内引物为测序引物进行序列测定分析。结果 构建了已克隆HCVNS5B区基因的重组质粒KHC5—1；序列分析表明，与HCV-BDS株同源性最高，属于主要流行于我国的HCV 1b基因亚型。结论 证实了在NS5B区，与RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性密切相关的基元结构Gly-Asp-Asp及其相邻序列的同源性非常高。     

丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

联合分析HCV种属信息区和高度保守区序列确定广东地区HCV基因型和亚型

目的扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5-UTR基因序列,用系统进化树法深入分析HCV基因型和亚型,阐明广东地区丙型肝炎患者HCV基因型和基因亚型的特点。方法采集99例慢性丙型肝炎病例血清,应用RT-PCR技术分别扩增HCVNS5B区和5-UTR特定片段,测序后进行系统进化树分析,确定HCV基因型及亚型。结果99例患者标本均准确分型,其中NS5B区段分型74例,5-UTR区段分型99例。HCV基因型和亚型的分布:1a亚型1例、1b亚型59例、1型7例、2a亚型11例、3a亚型3例、3b亚型2例、3型3例、6a亚型13例;另有2例标本在两区段分型不同,5-UTR/NS5B区段分型分别为6a/1b和3a/1b。两区段共同分型74例,72例标本在两区段基因型一致,2例标本在两区段基因型不同,为HCV重组体。结论联合分析HCV不同区段基因序列,可提高HCV基因分型的准确度及灵敏性。广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为6a和2a;3型中的a、b亚型也占有一定比例。     

BamH Ⅰ酶切位点变异区域性分布在HCV 1b型5＇非编码区的研究

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）1b型5’非编码区BamH Ⅰ酶切位点变异的区域性分布。方法对来自中国4个不同地区的64例HCV 1b基因型血清样品进行5’-NCR扩增后，分别用MboⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切分析，比较不同地区变异株分布的差异。结果测序证实中国HCV 1b基因型在117位有BamH Ⅰ酶切位点。64例血清样品中，BamHⅠ单切点变异株，华南7例（28％），东北1例（10％）。华北1例（11．1％），西南0例；MboⅠ及BamHⅠ切点均无的变异株，西南8例（40％），华南2例（4％），东北1例（10％），华北0例。结论证实HCV1b型BamHⅠ变异具有区域性分布特点，华南地区和西南地区变异较多，华北和东北变异较少。而这一变异是否与干扰素治疗耐药有关，尚有待于进一步研究。     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体（PTHR）及其突变受体（DSEL）全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及
DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素（PTH）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方
法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1（+）,二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切,经T4
DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1（+）中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoR
Ⅰ与Not Ⅰ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL及空质粒pcDNA3.1
（+）分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重
组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）- DSEL
构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在
重组质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL
基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高
于空质粒pcDNA3.1（+）转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该
稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。
     

广州地区丙型肝炎患者HCV基因分型研究

目的研究广州地区丙型肝炎患者HCV基因型分布的变化情况。方法收集207例HCV RAN阳性丙型肝炎患者血清,对其HCV Core区(C区)和NS5B区基因序列进行RT-nPCR扩增,两区扩增成功的PCR产物进行基因测序,测序结果分别与相应的参照株序列比对,构建系统进化树,两区基因分型结果一致者确定HCV基因亚型。结果 185例HCV C区和NS5B区都扩增成功,其中179例两区基因分型结果一致。共检出1、2、3、6型4种基因型和8种基因亚型,其中1b型占40.78%(73/179),6a型占27.37%(49/179),3b型占11.73%(21/179),3a型占8.94%(16/179),2a型占6.15%(11/179),1a型占3.91%(7/179),2b型占0.56%(1/179),6n型占0.56%(1/179)。1b株可分为A、B、C三大簇,A簇与中国广泛流行1b株接近、B簇与中国中部及南部地区流行1b株接近,6a株分为Ⅰ、Ⅱ两大簇,与献血人群及静脉吸毒人群中6a型株接近。结论广州地区丙型肝炎患者HCV基因型以1b、6a、3型为主,存在多种亚型;1b型株包含中国大部分地区的1b型株,6a、3型已取代2a型分别成为第二、三主要流行基因型;未发现6型变异株。     

丙肝病毒NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体的构建

目的通过克隆丙肝病毒非结构蛋白NS3-4A基因,构建表达HCV-NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体。方法设计合成HCV NS3-4A基因全长的特异性引物,应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增非结构蛋白区NS3-4A基因片段,经限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切后克隆到pFastbacDual上,并转化到大肠杆菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果扩增得到的基因片段长度为2.2kb,该片段成功克隆在杆状病毒穿梭载体pFastBacDual上,经测序证实为HCV NS3-4A基因,这表明HCV-NS3A基因重组杆状病毒穿梭载体构建成功。结论成功构建了表达HCV NS3-4A基因的杆状病毒穿梭载体,这将为下一步HCV杆状病毒载体疫苗的制备打下基础。     

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的：构建HCV ns5b基因的重组原核表达质粒，并获得NS5B蛋白的高效表达，为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件。方法：利用PCR技术扩增HCV ns5b基因，Xho I和Kpn I双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上，转化大肠杆菌JM109菌株，获得阳性重组质粒pRSETA-ns5b，阳性质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western Blot电泳进行鉴定，并以薄层扫描分析对其定量。结果：成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pRSETA-ns5b，经诱导明显表达出6His-NS5B融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，表达量占菌体蛋白25％，Western—Blot结果显示表达蛋白保持活性。结论：HCV NS5B蛋白在体外得到了有效表达。     

BamH Ⅰ酶切位点变异区域性分布在HCV 1b型5''''非编码区的研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)1b型5'非编码区BamHⅠ酶切位点变异的区域性分布.方法对来自中国4个不同地区的64例HCV 1b基因型血清样品进行5'-NCR扩增后,分别用Mbo Ⅰ、BamH Ⅰ限制性内切酶酶切分析,比较不同地区变异株分布的差异.结果测序证实中国HCV 1b基因型在117位有BamH Ⅰ酶切位点.64例血清样品中,BamH Ⅰ单切点变异株,华南7例(28%),东北1例(10%),华北1例(11.1%),西南0例;Mbo Ⅰ及BamHⅠ切点均无的变异株,西南8例(40%),华南2例(4%),东北1例(10%),华北0例.结论证实HCV 1b型BamH Ⅰ变异具有区域性分布特点,华南地区和西南地区变异较多,华北和东北变异较少.而这一变异是否与干扰素治疗耐药有关,尚有待于进一步研究.     

BamHI酶切位点变异区域性分布在HCV1b型5''''非编码区的研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)1b型5'非编码区BamHⅠ酶切位点变异的区域性分布。方法对来自中国4个不同地区的64例HCV1b基因型血清样品进行5'-NCR扩增后,分别用MboⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切分析,比较不同地区变异株分布的差异。结果测序证实中国HCV1b基因型在117位有BamHⅠ酶切位点。64例血清样品中,BamHⅠ单切点变异株,华南7例(28%),东北1例(10%),华北1例(11.1%),西南0例;MboⅠ及BamHⅠ切点均无的变异株,西南8例(40%),华南2例(4%),东北1例(10%),华北0例。结论证实HCV1b型BamHⅠ变异具有区域性分布特点,华南地区和西南地区变异较多,华北和东北变异较少。而这一变异是否与干扰素治疗耐药有关,尚有待于进一步研究。