抗人MIF单克隆抗体的制备及其活性的初步鉴定

目的构建人巨噬细胞移动抑制因子(human macrophage migrationinhibitoryfactor,hMIF)原核表达系统并制备其单克隆抗体.方法采用RT-PCR从乳腺癌细胞株MDA-MB453细胞克隆hMIF cDNA,测序后构建pET11b/hMIF重组表达质粒,转化入大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达hMIF;重组hMIF经纯化和鉴定后,作为抗原常规免疫和CpG ODN加强免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体并鉴定活性.结果构建pET11b/hMIF重组表达质粒,表达出预期hMIF蛋白,表达率30%,纯化后纯度达95%.Western blotting鉴定为hMIF,NO释放实验证实具有生物学活性.两种免疫方案共获得9株分泌抗hMIF抗体的杂交瘤细胞株,其中一株经Western blotting和活性鉴定证明具有特异性和生物学活性.结论获得hMIF重组蛋白和抗hMIF单克隆抗体,为其基础性研究和在脓毒症的治疗等临床应用研究奠定基础.     

谷氨酰胺对脓毒症小鼠的保护作用

目的 探讨谷氨酰胺对脓毒症小鼠炎性反应及生存率的影响.方法 昆明小鼠45只,随机分为假手术组(CON)、手术组(CLP)、谷氨酰胺组(GLN),每组15只.采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备脓毒症模型,术后即刻尾静脉注射谷氨酰胺0.75 g/kg(GLN组)或等体积0.9%氯化钠溶液(CON和CLP组).6 h后每组各取5只.收集血清,腹腔灌洗分离巨噬细胞.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和巨噬细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-10水平;另外每组各取10只观察术后5 d生存率.结果 CLP和GLN组血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平均显著高于CON组(P值分别＜0.05、0.01);GLN组血清TNF-α水平显著低于CLP组(P＜0.05),两组间血清IL-6、IL-10的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).GLN组巨噬细胞中TNF-a、IL-6水平均显著低于CLP组(P值分别＜0.01、0.05),3组问IL-10水平的差异无统计学意义(P＞0.05).GLN组小鼠的存活时间显著长于CLP组(P＜0.05).结论 谷氨酰胺可以抑制脓毒症小鼠的炎性反应,降低其病死率.     

抗内毒素单克隆抗体对脓毒症大鼠TNF,IL—1,IL—6的影响

脓毒性是全身炎症反应的临床表现，炎性细胞因子在炎症的反应过程中具有广泛的生理功能，是引起重症感染，感染性休克，多器官功能衰竭以至死亡的主要因素，维持机体应急状态下的自身稳定是治疗脓毒症的努力目标。针对革兰阴性菌感染所引起的脓毒症，寻找防止细菌的侵袭，提高机体免疫力的有效处理手段，我们首先制备并获得了Ｍ２Ｂ这株单克隆抗体，采用脓毒症大鼠预先给以Ｍ２Ｂ的方法，观察了Ｍ２Ｂ在脓毒症１６ｈ动物存活率和细胞     

青蒿素对脓毒症大鼠的保护作用

目的观察青蒿素对脓毒症大鼠的保护作用并探讨其作用机制.方法采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligationand puncture,CLP)制作大鼠脓毒症模型,观察青蒿素对CLP大鼠死亡率的影响,ELISA法检测术后2、6、12、24、48和72 h大鼠血清LPS、TNF-α和IL-6水平;光镜和透射电镜观察72 h大鼠肠粘膜形态学的变化;分离大鼠腹腔巨噬细胞(PMФ),ELISA法检测青蒿素对LPS(100ng/ml)及热灭活大肠杆菌(3.5×107CFU/ml)刺激PMФ释放TNF-α及IL-6的影响.结果青蒿素组大鼠死亡率低于模型组(P＜0.05),CLP术后血清LPS、TNF-α和IL-6水平较模型组降低(P＜0.05或P＜0.01),肠粘膜的损伤程度减轻;青蒿素对LPS和热灭活大肠杆菌刺激PMqФ释放TNF-α和IL-6具有显著的抑制作用并呈量效关系(P＜0.01).结论青蒿素能抑制CLP大鼠巨噬细胞活化并减轻肠粘膜损伤,对CLP大鼠具有保护作用.     

抗CD200抗体对脓毒症小鼠肝脏保护作用及其机制的研究

目的观察CD200在脓毒症小鼠肝脏的表达情况,并进一步探讨抗CD200抗体对脓毒症小鼠肝脏的保护作用及其可能的作用机制。方法构建脓毒症小鼠模型(CLP),将C57BL/6雄性小鼠分为假手术组、脓毒症组(CLP组),每组8只,观察各组小鼠肝脏组织CD200的表达水平;将C57BL/6雄性小鼠分为假手术组,脓毒症组(CLP组)、CLP+同型对照抗体治疗组(Isotype组)、CLP+抗CD200抗体治疗组(anti-CD200组),每组8只。检测各组小鼠外周血氨基转移酶水平、肝脏病理、腹腔灌洗液细菌负荷、外周血TNF-α、IL-6的水平、肝脏组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-6的mRNA水平、肝脏组织核转录因子-κB(NF-κB)磷酸化水平。结果脓毒症组小鼠的肝脏CD200表达水平明显高于假手术组(P<0.05);anti-CD200组小鼠肝脏组织的坏死程度明显轻于脓毒症组(P<0.05),TNF-α、IL-6水平低于脓毒症组(P<0.05),腹腔灌洗液细菌菌落的水平低于脓毒症组(P<0.05),NF-κB的磷酸化低于脓毒症组(P<0.05)。结论抗CD200抗体可以对脓毒症小鼠肝脏产生保护作用,其可能的机制为抑制NF-κB的磷酸化、减少炎症因子的释放。     

Bioactivity identification of anti-hMIF monoclonal antibody and its protective effec on sepsis mice

目的 对制备的人巨噬细胞移动抑制因子(anti-human macrophage migration inhibitory factor,hMIF)单克隆抗体进行生物学活性鉴定,并研究其对脓毒症小鼠的保护作用.方法 通过ELISA、Western blot、免疫组织化学等方法鉴定抗MIF单克隆抗体F11的亚类、抗体亲和力及特异性;通过一氧化氮(nitric oxide,NO)释放抑制试验和异构酶活性抑制试验,鉴定F11抗体的生物学活性;选用C57 BL/6J小鼠构建CLP、LPS诱导脓毒症模型,研究F11抗体对脓毒症小鼠生存率的保护作用及对血清细胞因子TNF-α、IL-6的影响.结果 F11抗体亚类为IgG1型,亲和力为2.5×1010,Western blot 及免疫组织化学显示强阳性;F11抗体显著抑制MIF刺激RAW264.7细胞释放NO(P ＜0.01)及MIF异构酶活性(P＜ 0.01);明显提高脓毒症小鼠生存率(CLP模型:P＜0.01,LPS模型:P ＜0.05)且具有剂量依赖关系,并对CLP术后血清TNF-α和IL-6的升高具有明显抑制作用(P＜0.05).结论 成功制备了高特异性、高亲和力、具有异构酶活性抑制作用的抗MIF单克隆抗体,显著提高致脓毒症模型小鼠生存率并降低小鼠血清TNF-α、IL-6水平.     

抗MIF单克隆抗体的制备及其放射性碘标记方法

目的  制备抗小鼠巨噬细胞移动抑制因子（mMIF）单克隆抗体（McAb）对其进行放射性碘标记,为进一步研究MIF在炎症、肿瘤核素显像中的意义奠定基础。方法  异丙基硫代-β-D-半乳糖（IPTG）诱导pEQ30-mMIF/M15工程菌表达重组mMIF蛋白;采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,蛋白质印迹技术（Western blotting）和酶联免疫吸附试验（ELISA）进行特异性鉴定,巨噬细胞移动抑制试验（MMI）鉴定生物学活性。采用二氯二苯基甘脲（Iodogen） 法,用Na125 I 标记抗mMIF单克隆抗体。结果  成功建立3株稳定高效价分泌抗mMIF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5G2D7,5G2C7,5G2E3。经Western blotting、ELISA和MMI鉴定证明抗mMIF单克隆抗体具有良好的抗原特异性和生物学活性;125 I-抗mMIF单克隆抗体的标记率为90.40%,放射化学纯度98.36%,放射性比活度为21.48MBq/μg。结论  成功制备抗mMIF单克隆抗体和放射性碘标记抗mMIF单克隆抗体,为深入研究MIF相关性疾病和利用MIF进行临床肿瘤及炎症放射免疫显像提供了实验基础。     

龙胆苦苷对脓毒症所致急性肺损伤小鼠的保护作用

目的 观察龙胆苦苷对脓毒症急性肺损伤小鼠的保护作用.方法 采用盲肠结扎穿孔的方法建立小鼠脓毒症急性肺损伤模型.80只18 ～22 g雄性昆明小鼠按随机区组设计分为假手术组、模型组、龙胆苦苷低剂量组(25 mg/kg)、龙胆苦苷高剂量组(50mg/kg),每组20只.各组于术前30 min尾静脉注射龙胆苦苷或生理盐水.术后12 h收集肺泡灌洗液检测其中炎症因子(TNF-α、IL-6)及总蛋白含量,测定肺组织中丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)含量,光镜下观察肺组织病理改变情况.结果 与模型组相比,龙胆苦苷低、高剂量组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量及总蛋白含量,肺组织中MDA、MPO、iNOS、NO水平均较低(P＜0.05,P＜0.01),且病理学损伤程度较模型组轻.结论 龙胆苦苷能减轻炎症反应,对脓毒症所致急性肺损伤有保护作用.     

穿心莲内酯对脓毒症小鼠的保护作用及机制探讨

目的研究穿心莲内酯对脓毒症小鼠的保护作用及相关机制。方法采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制作小鼠脓毒症模型。64只C57BL/6小鼠随机均分为4组:假手术组(sham组)、脓毒症模型组(CLP组)、二甲亚砜组(DMSO组)和穿心莲内酯组(AND组)。各组小鼠于术后1、6、12h腹腔内分别注射相同剂量(0.2mL)的生理盐水、5%DMSO或穿心莲内酯(10mg/kg),记录各组小鼠术后7d生存率并绘制生存曲线。另取48只C57BL/6小鼠,分组及给药方法同前,术后24h分别检测腹腔灌洗液(PLF)中性粒细胞(PMN)数量、外周血及PLF细菌负荷以及外周血炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10水平,同时取小鼠肺脏及肝脏组织进行病理分析。结果与CLP组相比,AND组小鼠术后7d生存率增加(P<0.01),腹腔PMN计数下降(P<0.01),外周血和腹腔细菌清除能力增强(P<0.01),外周血TNF-α、IL-6水平降低,而IL-10水平升高(P<0.01),肺组织和肝脏组织病理损伤程度减轻(P<0.01)。DMSO组与CLP组各项检测指标差异均无统计学意义。结论穿心莲内酯对CLP脓毒症小鼠具有保护作用,可能与其调节免疫功能,增强细菌清除能力以及降低过度炎症反应有关。     

抗CRF单克隆抗体制备及鉴定

本文报道了应用促肾上腺皮质激素释放因子在碳化二亚胺作用下与牛血清白蛋白偶联形成的完全抗原，免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术。制备了２株分泌抗ＣＲＦ单克隆抗体的杂交瘤。并利用建立的小分子肽ＣＲＦ的间接ＥＬＩＳＡ法，对其腹水效价及其特异性进行了分析。     

抗人血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 运用杂交瘤技术制备抗血红蛋白(hemoglobin, Hb)单克隆抗体,为进一步探讨Hb在帕金森病中的发病机制及早期诊断中的意义奠定基础。方法 用重组人Hb作为抗原免疫Balb/c小鼠,并将其脾细胞与同系骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤,经3次有限稀释法及酶联免疫吸附试验法筛选获得抗人Hb单克隆抗体杂交瘤株5B1。腹腔注射于免疫抑制Balb/c小鼠产生腹水,并利用Dot blotting、酶联免疫吸附实验,免疫共沉淀、Western blotting法及免疫组织化学染色法进一步测定抗体效价,获得一特异性抗Hb单克隆抗体。结果 成功制备出1株高亲和力、特异性好的抗Hb单克隆抗体。结论 制备的单克隆抗体对Hb具有特异性(包括人血、猴及小鼠),为进一步研究Hb在帕金森病(Parkinson's disease,PD)中的作用提供了有力的特异性工具。     

抗DR5单克隆抗体对NCL-H446的致凋亡作用

目的:探讨抗DR5单克隆抗体(mDRA-6)对小细胞肺癌NCL-H446的凋亡作用。方法:NCL-H446细胞常规培养24 h后分为对照组、抗DR5单克隆抗体(mDRA-6)及mDRA-6+顺铂处理组。以细胞形态学改变、流式细胞仪和DNA凝胶电泳分析为凋亡观察指标。结果:经mDRA-6处理的NCL-H446细胞出现核固缩、染色质边缘化和凋亡小体形成;琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡特征性DNA梯状带;细胞凋亡发生率与抗DR5单克隆抗体(mDRA-6)剂量及细胞表面DR5的表达呈相关性。结论:mDRA-6对小细胞肺癌NCL-H446的杀伤作用主要通过诱导凋亡实现的,细胞表面DR5受体表达上调可促进凋亡作用。     

载脂蛋白H单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备及鉴定载脂蛋白H Aport单克隆抗体。方法从人血清中分离纯化Aport免疫小鼠后取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选出两株杂交瘤细胞株2C5和3H4，制备腹水后，用硫酸胺沉淀等方法纯化。获得Aport单抗。结果两株细胞产生的单抗皆属于IgG1，与其它载脂蛋白无交叉反应，细胞株连续传代3个月仍能稳定分泌Aport单抗，且效价稳定。结论2C5和3H4两株细胞能分泌合格的Aport单抗。     

背根神经节巨噬细胞迁移抑制因子参与 调控神经病理性疼痛的机制研究

目的 探讨脊髓背根神经节（DRG）巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）对神经病理性疼痛的作用及可 能的调控机制。方法 成年雄性SD 大鼠随机分为3 组（n =8）：假手术组（Sham 组）、坐骨神经结扎（CCI）模 型对照组（以下简称CCI 组）、ISO-1 组（CCI+ 鞘内注射ISO-1）。鞘内置管5 d 后予以左侧坐骨神经结扎。 CCI 组和ISO-1 组连续14 d 鞘内注射10% DMSO 10 μl 或含ISO-1 30 μg 的DMSO 10 μl,每天1 次。在术前1 天, 术后第1、3、5、7、10 及14 天（给药2 h 后）测定机械痛阈值;在第7 和14 天取大鼠DRG,ELISA 检测肿瘤 坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）的表达变化,Western blot 检测MIF 表达变化,并于第14 天记 录受损坐骨神经传导速度（CV）。结果 与Sham 组比较,术后CCI 组机械痛阈值均降低（P <0.05）;与CCI 组比较, ISO-1 组术后第10 和14 天机械缩足反射阈值均升高（P <0.05）。与Sham 组比较,CCI 组第7 和14 天背根神经 节MIF、TNF-α、IL-1β 表达上调（P <0.05）;与CCI 组比较,ISO-1 组第7 和14 天MIF、TNF-α、IL-1β 表达下调（P <0.05）。神经电生理的结果显示,与Sham 组比较,CCI 大鼠坐骨神经的CV 降低,差异有统计学意 义（P <0.05）;ISO-1 组与CCI 组大鼠坐骨神经的CV 比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 鞘内注射MIF 拮抗剂ISO-1 可以减轻大鼠机械痛敏,下调DRG MIF、TNF-α 和IL-1β 表达,但不能修复受损坐骨神经。 MIF 拮抗剂ISO-1 可能通过抑制脊髓背根神经节炎症反应,减轻大鼠神经病理性疼痛。     

藻酸盐单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备、筛选稳定分泌藻酸盐单抗的杂交瘤克隆。方法：应用藻酸盐BSA程序免疫BALB／C小鼠，将其脾脏与骨髓瘤细胞SP2／0融合，采用采用ELISA方法筛选阳性克隆。抗体的检测分别采用琼脂糖双向扩散试验和ELISA方法。结果：得到两株分泌藻酸盐单抗的杂交瘤克隆，分别分泌IgM和IgG。     

巨噬细胞移动抑制因子在肾癌中的表达及对肾癌细胞侵袭能力的影响

目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在肾癌组织中的表达及对肾癌细胞侵袭能力的影响.方法 以内蒙古自治区人民医院和包头市肿瘤医院2013年3月至2015年3月病理室确诊的49例肾癌患者为研究对象,采用蛋白质印迹法(West-ern blot)及反转录(RT)-PCR法检测肾癌组织及癌旁正常组织、肾癌细胞株及正常肾小管上皮细胞HK 2中MIF蛋白及mRNA表达;利用脂质体将siRNA MIF及siRNA NC转染到肾癌细胞中,Western blot及RT-PCR检测转染效果,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,Transwell法检测细胞侵袭能力,Western blot检测细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达.结果 肾癌组织中MIF蛋白及mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织(0.89±0.09 vs.0.18±0.02,1.19±0.04 vs.0.19±0.01,P＜0.05),肾癌细胞株ACHN、769-p、786-O、Caki-1中MIF蛋白及mRNA表达水平明显高于肾小管上皮细胞HK-2(P＜0.05).与siRNA NC组比较,siRNA MIF组中MIF蛋白及mRNA表达水平明显下调(P＜0.05),细胞活力及侵袭能力降低(P＜0.05),HIF-1α及MMP9表达水平下调(P＜0.05).结论 MIF在肾癌中高表达,下调MIF表达能明显抑制肾癌细胞的侵袭能力,可能与抑制HIF-1α/MMP9信号通路有关.     

抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

肺炎支原体种特异性单克隆抗体杂交瘤制备及鉴定

目的　制备抗肺炎支原体种特异性单克隆抗体。方法　以纯化的肺炎支原体膜蛋白抗原 (相对分子质量为43× 10 3)加福氏免疫佐剂免疫 8周龄雌性BALB c小鼠 ,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2 0 Ag14融合 ,以酶标记免疫吸附测定法 (ELISA)筛选和鉴定所制备的单克隆抗体。结果　共筛出 3株分泌抗肺炎支原体种特异单克隆抗体杂交瘤 ,经免疫鉴定其分泌的免疫球蛋白类型为IgG1、IgG2a及IgM ,与肺炎支原体有很强的亲和力 ,与种属相近的其它 6株支原体没有交叉反应。结论　本次筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌高浓度的肺炎支原体单克隆抗体 ,并且有很强的种特异性。