不同载铁状态下HL-60细胞转铁蛋白受体和铁蛋白mRNA的表达

目的:探讨不同载铁情况下HL-60细胞中转铁蛋白受体(TfR)mRNA和铁蛋白(Fn)mRNA的表达情况.方法:取HL-60细胞分5组培养.FeCl3-20组和FeCl3-40组培养液中加入FeCl3,终浓度分别为20 μmol/L,40 μmol/L;DFO-50和DFO-100组培养液中分别加入去铁胺(DFO)50 μmol/L,100 μmol/L;对照组用单纯培养液,不加FeCl3或DFO.分别于细胞培养12 h、24 h和48 h收集细胞,采用RT-PCR半定量法测定TfR mRNA和Fn mRNA的相对表达量.结果:与对照组比较,DFO-50和DFO-100组TfR mRNA表达量随培养时间的延长而升高,Fn mRNA表达量变化不大(P＞0.05).FeCl3-20和FeCl3-40组TfR mRNA的表达随培养时间的延长,先增高后降低,Fn mRNA的表达则逐渐降低.结论:TfR 和Fn 不同程度地参与了HL-60细胞铁代谢过程.     

丙戊酸钠诱导髓系白血病细胞分化、凋亡作用及其机制研究

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)诱导髓系白血病细胞体外分化和凋亡作用及其机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法增殖抑制实验和锥虫蓝拒染法检测VPA对细胞增殖的抑制,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原的表达和细胞凋亡,Western印迹法检测组蛋白H3的9位赖氨酸残基(H3-Ac-lys9)的乙酰化水平变化。结果VPA抑制U937和K562髓系白血病细胞增殖,并呈时间-剂量依赖效应。在VPA较低浓度下(0.5～1mmol/L)作用6d后,VPA诱导U937细胞分化,其细胞表面髓系分化抗原CD11b表达明显上调,细胞形态呈终末分化改变。VPA与全反式维甲酸和(或)粒细胞集落刺激因子联合应用,诱导分化作用更为显著。在VPA较高浓度下(2mmol/L),VPA诱导U937细胞磷脂结合蛋白结合力明显上升,细胞呈现凋亡状态。而同样条件下VPA不能诱导K562细胞出现显著的分化和凋亡。U937和K562细胞在H3-Ac-lys9的乙酰化水平存在差异。VPA能够上调U937细胞H3-Ac-Lys9乙酰化,而K562细胞未观察到类似调变作用。结论VPA诱导U937细胞分化和凋亡,其作用与U937细胞的H3-Ac-lys9乙酰化水平及其对VPA处理后的上调有关。     

人β-珠蛋白小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达及开关机制研究

目的从RNA角度研究珠蛋白基因表达调控,探讨人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的分子机制,为β-珠蛋白生成障碍性贫血的分子治疗提供新靶位,并为诱导肿瘤细胞分化治疗肿瘤提供依据。方法通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)比较白血病和非白血病患者外周血白细胞血红蛋白基因分子水平的差异,将β-珠蛋白基因转染K562细胞,运用噻唑蓝比色法、细胞流式分选等技术检测β-珠蛋白基因对K562细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响,通过Western blot及RT-PCR分别从蛋白质水平和mRNA水平分析其调控γ-珠蛋白基因表达的作用,同时运用生物信息学预测人β-珠蛋白基因可以产生具有基因表达调控作用的小分子RNAs。结果白血病患者血红蛋白A1、血红蛋白B、血红蛋白E1、细胞珠蛋白、脑红蛋白的mRNA表达均显著低于非白血病患者(P<0.05)。β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,并在第7天达到最佳时间效应。用RT-PCR检测转染后K562细胞α、β、γ-珠蛋白等mRNA的表达,发现β-mRNA上升导致转染后的K562细胞γ-珠蛋白表达下调,同时α-珠蛋白表达上调;β-珠蛋白基因可能产生作用于γ-珠蛋白的小分子RNA,符合条件的二级结构在热力学上稳定,空间位阻也在一定范围内。结论白血病患者外周血白细胞珠蛋白基因低表达,β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,其高表达可诱导K562细胞增殖受抑和凋亡,并抑制K562细胞γ基因表达,通过小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达沉默,有助于揭示人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的基因表达调控及开关机制。     

IFN α-2b对白血病K562细胞增殖及FAK mRNA表达的影响

目的:研究重组人干扰素(IFN α-2b)对人慢性粒细胞白血病急变期细胞系K562细胞增殖及黏着斑激酶(FAK)mRNA表达的影响。方法:应用MTT法检测IFN α-2K562细胞的抑制率,采用RT-PCR技术检测各IFN α-2b浓度组对K562细胞FAK mRNA表达水平的影响。结果:增加IFN α-2b浓度及延长反应时间,除48 h和72 h外,抑制K562细胞增殖的比率逐渐升高;IFN α-2b作用48 h,浓度1万U/mL对抑制细胞增长的比率最高;随着IFN α-2b浓度增加,K562细胞的FAK mRNA表达增高,其中1万U/mL IFN α-2b实验组FAK mRNA表达水平最高,各组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论:白血病K562细胞可能存在FAK mRNA异常表达,IFN α-2b可能通过上调正常FAK mRNA的表达水平抑制K562细胞增殖。     

氨基甾体H42648对K562白血病细胞系的抑制增殖和诱导分化作用

目的：探讨氨基甾体H42648对K562白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用。方法：采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验观察H42648对K562细胞增殖能力的影响,采用Wright-Gi-emsa染色,联苯胺染色和流式细胞术观察H42648对K562细胞的诱导分化作用。结果：H42648作用K562细胞1～5d后,细胞计数和集落计数明显减少,第5d处理组的MTT值显著低于对照组,并呈剂量依赖关系;联苯胺染色OD值升高,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,形态学观察其趋向成熟分化。流式细胞术检测药物处理4d后K562细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为89．19％。结论：氨基甾体H42648可抑制K562细胞增殖并诱导其向红系分化,提示该药可作为一种新型慢粒白血病细胞的诱导分化剂。     

全反式维甲酸对儿童卵黄囊瘤细胞增殖及维甲酸β受体表达的影响

目的:研究全反式维甲酸(ATRA)对儿童卵黄囊瘤细胞诱导分化过程中细胞形态及维甲酸β受体表达的影响.方法:在体外细胞培养的基础上,观察细胞形态学的变化、细胞增殖动力学的变化,采用MTT比色法测定细胞细胞增殖活性,以半定量RT-PCR方法检测维甲酸β受体(RAR-β)mRNA的表达.结果:全反式维甲酸能使卵黄囊瘤细胞形态趋向良性分化,有效地抑制了肿瘤细胞增殖;半定量RT-PCR结果显示,经不同浓度的ATRA处理后的卵黄囊瘤细胞的RAR-β mRNA表达水平均上调.结论:ATRA对卵黄囊瘤细胞有诱导分化作用,ATRA通过上调维甲酸β受体基因表达实现其诱导分化作用.     

丹参酮A与全反式维甲酸协同诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株的分化和凋亡

目的　研究丹参酮 A(Tanshinone A,Tan A)联合全反式维甲酸 (ATRA)对早幼粒细胞白血病细胞 (NB4 )诱导分化及凋亡的协同效应。方法　 0 .5 μg/ m l Tan A分别联合 0 .5 μg/ ml、0 .2 5 μg/ ml和 0 .12 5 μg/ml ATRA作用 NB4细胞 5 d,观察 NB4细胞形态学变化 ,检测硝基蓝四氮唑 (NBT)还原能力 ;流式细胞术检测CD11b,CD33的表达 ,并进行细胞周期和细胞凋亡分析。结果　 Tan A联合 ATRA可协同诱导 NB4细胞分化和凋亡。联合作用组第 5 d细胞生长抑制率均超过 80 % ;90 %左右的 NB4细胞分化 ,其中杆状和分叶核细胞比例超过6 5 % ;NBT还原能力显著升高。流式细胞术分析显示 CD11b表达升高 ,CD33表达降低 ;G0 / G1 期细胞增加 ,有明显的细胞凋亡 ,与 Tan A或 ATRA单独作用组相比均有显著性差异 (P<0 .0 1)。Tan A与 ATRA(0 .12 5 μg/ m l～0 .5 μg/ m l)联合对 NB4细胞的影响没有明显的浓度依赖倾向。结论　 Tan A联合 ATRA对 NB4细胞诱导分化和凋亡有协同作用 ;在 ATRA一定浓度范围内 ,这种协同作用无 ATRA剂量依赖性。     

抑制Cyclin D1基因对K562细胞生长和Vp16敏感性的影响

目的 应用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),构建针对细胞周期素D1(Cyclin D1)的RNAi,并检测其对K562细胞增殖和对化疗药物敏感性的影响.方法 采用针对Cyclin D1的RNAi质粒载体转染K562细胞,用反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测Cyclin D1RNAi后mRNA和蛋白水平的表达;用MTT实验测定细胞的增殖;流式细胞术测定细胞周期和凋亡.结果 针对Cyclin D1 RNAi转染白血病K562细胞后,可以明显降低白血病K562细胞中Cyclin D1的mRNA和蛋白的表达,明显抑制K562细胞的增殖,提高化疗药物Vp16诱导的细胞凋亡.结论 利用RNAi抑制Cyclin D1可抑制白血病K562细胞增殖,提高对化疗药物Vp16的敏感性.     

全反式维甲酸体外诱导神经母细胞瘤细胞分化的实验研究

目的体外观察全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞系SH-SY5Y(SY5Y)细胞生长及分化的影响及其可能的分子机制。方法用RT-PCR方法检测ATRA作用前后SY5Y细胞TrKA mRNA表达情况;采用台盼蓝拒染法检测ATRA对SY5Y细胞的体外抗增殖作用;用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。结果ATRA作用7d后SY5Y细胞TrKA mRNA表达增高;ATRA对SY5Y细胞有抗增殖作用和诱导细胞分化作用,并呈一定时间和剂量依赖关系。结论ATRA对SY5Y细胞有生长抑制及诱导分化作用,该作用与上调SY5Y细胞TrKA mRNA表达水平有关。     

CD34+细胞的WT1表达及其意义

目的：观察CD34^ 细胞分化过程中WT1表达水平的变化，探讨WT1作为白血病基因标志物的可行性。方法：以免疫磁珠从脐带血中分取CD34^ 细胞，以IL－3及GM－CSF促使其向髓系分化，采用半定量RT－PCR法检测分化过程中WT1表达的变化，比较CD34^ 细胞，K562，AML－M5等WT1的表达水平。结果：CD34^ 细胞的WT1表达水平不低于K562细胞及AML－M5白血病细胞，CD34^ 细胞在向髓系分化过程的0d或第1d表达水平较高，随即迅速降低至不可检测水平。以去除CD34^ 细胞的脐血细胞对K562细胞倍比稀释后再以RT－PCR检测WT1表达，当敏感度达10^-3时，1／10正常骨髓及2／5脐带血亦可检测出WT1表达。结论：正常CD34^ 细胞有较高水平的WT1表达，细胞分化早期WT1表达的迅速降低可能是正常造血细胞分化的必要环节，WT1作为白血病基因标志物有缺陷，会出现假阳性。     

CLONING PROMOTER OF HUMAN SATBl GENE AND EFFECT OF ATRA AND CoCl_2 ON ITS ACTIVITY

Objective To explore the structure and activity of SATBI promoter in different cells, ATRA and CoCl2 effect on its activity. Methods Using luciferase system to assay the promoter activity of human SATB1 gene, three luciferase reporter vectors were constructed which driven by different regions of 5' untranslated sequence from human SATB1 gene, called pGL3-SP2946-luc, pGL3-SP1718-luc and pGL3-SP751-luc, and transfeted into Jurkat T,K562, U937 and Hela cells transiently using lipofectinamine, the expression activity was detected at different dosage of ATRA and CoCl2 treatment for different time course. Results The reporter gene expression from SATB1 promoter were high activity in U937 cell, moderate in Jurkat T cell, low activity in K562 cell and showed no obvious activity in Hela cell, the reporter gene expression from pGL3-SP751-luc kept on the higher lever in Jurkat T,K562 and U937 cells than the other two vectors. We also found that the repressive effect of CoCl2 on SATBI' s mRNA expression and the relative luciferase expression from pGL3-SP751~luc in U937 cell was down-regulated obviously by ATRA and CoCl2 in the concentration- and time-dependent manners. Conclusion SATB1 promoter drives gene expression with cell-specificity and its core promoter region maybe exist in the - 751 ~ - 9bp of 5' untranslated region of human SATBI gene. Combined with the experiment result we found before that SATB1 was down-regulated by ATRA in U937, the results imply that STAB1 maybe is down-regulated by ATRA and CoCl2 through its promoter in the differentiation of myeloid cell line-U937.     

STUDY ON EFFECTS OF QUERCETIN ON PML GENE AND PROTEIN IN LEUKEMIA CELL LINES

Objective To investigate the effect of quercetin on PML gene and protein expression andlocalization in leukemia cell lines. Methods Cell morphology was assayed by Wright's stain and fluorescence stain, and PML mRNA expression by RT-PCR , PML protein localization by immuno-fluorescence. Results NB4 and HL-60 cells differentiated morphologically after treatment with all-trans-retinoic acid (ATRA) while K562 cells did not differentiate. Typical apoptosis was found in each cell line after treatment with quercetin. Immuno-fluorescence analysis showed , after treatment with ATRA , the fusion protein disappeared in NB4 cells and PML protein relocated , while HL-60 and K562 cells had no difference from control cells. After treatment with quercetin, the fusion protein disappeared in NB4 cells, PML protein relocated, then degraded. In HL-60 cells and K562 cells, PML protein also located and then degraded . The expression of PML mRNA was not changed in all three cell lines after treatment with ATRA or quercetin. C     

促红细胞生成素和甲状腺激素对K 562细胞铁代谢的影响

目的探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)和甲状腺激素(T3)对红白血病细胞K562铁代谢的影响及其可能的机制.方法参照骨髓铁染色的方法进行细胞铁染色,计算阳性细胞率,并通过流式细胞术观察转铁蛋白受体(TfR)的表达.结果 rhEPO与FeCl3共培养细胞时,可见铁染色阳性细胞率有明显上升,尤以rhEPO 5 U/ml组上升更为明显(P<0.01),且随培养时间延长,阳性率逐渐上升;不同浓度T3均使K562铁染色阳性细胞率明显上升,且以培养48 h组阳性率最高;不同浓度rhEPO培养细胞72 h均使K562细胞TfR表达明显增加(P<0.05),而不同浓度的T3对转铁蛋白受体的表达无明显作用.结论 rhEPO能增加K562细胞铁染色的阳性细胞率,其机制可能是由于增加TfR的表达使细胞大量摄入铁;而T3增加铁染色阳性细胞率的机制尚需进一步研究.     

全反式维甲酸对白血病NB4细胞PRAM蛋白的影响

目的:探讨在NB4细胞增殖过程中PRAM蛋白表达情况,并且用全反式维甲酸（ATRA）进行干扰,观察其对PRAM蛋白的影响。方法:①细胞增殖抑制实验:体外培养NB4细胞共5天,用台盼蓝染色法筛选ATRA有效干预浓度后,选取ATRA(1×10^-6mol/L)为目的干预浓度。②Western blot:ATRA(1×10^-6mol/L)持续干扰NB4细胞1、2、3天后检测PRAM蛋白的相对表达量。结果:①与对照组比较,4种浓度ATRA组细胞与NB4细胞的增殖率呈量效与时效关系;浓度越大,抑制率越高;于培养第4天出现最强抑制。②选取1×10^-6mol/L ATRA干扰NB4细胞共3天,对照组及ATRA组PRAM蛋白的表达在时间上有规律性:第2天表达最强烈。③1×10^-6mol/L ATRA使PRAM蛋白在第2天的相对表达量较对照组低（P<0.05）。④1×10^-6mol/l ATRA使NB4细胞PRAM蛋白在第2天出现最大表达量,同时该组细胞出现生长抑制。结论:ATRA能通过PRAM位点来达到抑制APL增殖分化的目的。     

全反式维甲酸对A549细胞株增殖和Caspase-3蛋白表达的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对A549肺腺癌细胞增殖和凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响.方法:①取对数生长期的人肺腺癌细胞株A549细胞,消化后于96孔板上按1×10-5 mol/L,1×10-6 mol/L,1×10-7 mol/L 3组ATRA药物浓度组和空白对照组培养,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察ATRA作用2 d,4 d,6 d对A549细胞增殖的影响.②用Hoechest33258荧光染色观察1×10-5 moL/LATRA培养24 h后A549细胞胞核形态变化.③利用免疫印迹法(Western blot)检测经1×10-7 mol/L,1×10-6 mol/L,1×10-5 mol/L ATRA作用12 h,24 h后A549细胞中Caspase-3蛋白表达的变化.结果:ATRA处理组与空白对照组相比细胞的增殖活性明显受到抑制(P＜0.05);经1×10-5 mol/L ATRA处理后的细胞呈典型的凋亡核固缩表现,胞核呈致密浓染的颗粒状或块状荧光.ATRA处理组的Caspase-3蛋白表达与空白对照组相比明显增高.结论:ATRA可抑制人肺癌细胞株A549的增殖,并通过上调Caspase-3蛋白表达诱导细胞的凋亡.     

AQP1在维甲酸诱导红白血病细胞红系分化中的作用

目的建立稳定抑制水通道蛋白1（AQP1）表达的K562细胞株,探讨AQP1在维甲酸（RA）诱导红白血病细胞红系分化中
的作用。方法RA处理K562细胞,通过real-time PCR法检测γ-珠蛋白表达和分光光度法检测血红蛋白的含量研究RA对K562
细胞红系分化的影响。Real-time PCR法、蛋白质印迹法检测RA诱导后K562细胞AQP1转录和蛋白表达水平的变化。设计特
异AQP1shRNA序列,构建pSUPER-retro-puro重组质粒转染K562细胞,筛选建立稳定抑制AQP1基因表达的K562细胞株
（K562-shAQP1）;通过比较K562-shAQP1细胞株与对照组细胞在维甲酸诱导后γ-珠蛋白和血红蛋白的表达,研究AQP1在维甲
酸诱导K562细胞红系分化中的作用。结果RA处理K562细胞后红系分化指标γ-珠蛋白和血红蛋白的表达均明显增加,同时
AQP1mRNA及蛋白表达随RA作用时间显著增加（P<0.01）。pSUPER-retro-puro-shAQP1干扰载体转染K562细胞后AQP1基
因在转录和蛋白水平上的表达均被抑制,差异有统计学意义（P<0.01）;K562-shAQP1细胞与对照K562细胞相比,在RA诱导后
γ-珠蛋白和血红蛋白表达受到不同程度的抑制,差异有统计学意义（P<0.01）。结论RA诱导K562细胞红系分化后AQP1表达
显著增加,而抑制AQP1基因的表达可部分阻断RA诱导红系分化的作用,说明AQP1在RA诱导K562细胞红系分化过程中发
挥重要作用。
     

尿多酸肽诱导慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药细胞生长抑制及分化的体外观察

目的观察尿多酸肽（CDA-2）在体外对慢性粒细胞性白血病（CML）伊马替尼（IM）耐药细胞株K562R生长抑制及诱导分化的作用。方法MTT和集落形成实验观察CDA-2对CML细胞株K562、IM耐药细胞株K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞生长抑制作用。吉姆萨染色观察细胞形态,膜联蛋白-V（Annexin-V）／碘化丙啶（PI）染色分析细胞凋亡,流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b、CD14的表达,反转录PCR（RT-PCR）检测细胞分化相关基因、细胞周期调节基因及DNA甲基化转移酶基因的表达。结果CDA-2均可抑制K562、K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞的生长,且对K562R细胞和IM耐药CML患者骨髓细胞的生长抑制更明显;CDA-2改变了K562和K562R细胞形态,诱导细胞向成熟分化,并引起细胞周期在G1期的停滞;这种停滞可能与CDA-2抑制DNA甲基转移酶活性,逆转细胞周期调节基因的甲基化状态有关。结论CDA-2在体外对K562R细胞株有很强的生长抑制和诱导分化的作用,提示CDA-2可能成为治疗IM耐药的CML患者的一种新药。