人宫颈癌Hela细胞穿透肽的噬菌体展示技术筛选

目的 细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透哺乳动物生物膜功能,并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子肽段.该肽段以其转导效率高,速度快,生物活性好,对细胞损害小等特点,成为药物导向治疗方法 研究领域的热点.本研究目的 在于利用噬菌体展示技术高通量、系统地筛选人宫颈癌Hela细胞的穿透多肽.方法 以Hela细胞作为对象,利用噬菌体随机肽库,采用细胞筛选的方法 ,筛选具有细胞膜穿透作用的多肽.将筛选得到的穿透多肽与增强型绿色荧光(EGFP)融合表达,通过荧光显微观察技术快速对多肽的穿透功能进行验证.结果 通过4轮的噬菌体文库筛选,目的 多肽得到了有效而快速地富集.初步的测序和验证得到了3条具有明显介导融合蛋白内化的短肽序列.结论 成功建立起基于噬菌体随机肽库的细胞穿透肽筛选技术,为肿瘤导向药物载体的研究开发奠定了基础.     

一种新的用于靶向化合物研发的体内高通量筛选方法

目的建立组织靶向化合物的体内完全随机高通量筛选模型：方法以氨基酸为原料，采用固相合成法合成C端氯化三肽组合文库。^99Tc^m-标记文库的结构通量为8000，即含有8000种不同化学结构的^99Tc^m-标记三肽化合物：体内筛选采用定位扫描和重复模式：实验动物采用SD大鼠和A549肺癌荷瘤裸鼠．通过测定每克组织百分注射剂量率（％ID／g）或显像，测定^99Tc^m-标记文库或单肽的组织分布。结果通过无创伤性显像或组织放射性计数测定组合文库的组织分布和代谢，实现体内完全随机高通量筛选，可用于发现、优化和设计具有组织特异性分布的（标记）化合物。这种组织靶向性分布有很高的化学结构特异性，在整个体内筛选过程中，非靶组织放射性本底同时受到监测。结论标记组合文库体内示踪技术是一种可靠、简易、灵敏的体内完全随机高通量药物筛选技术，可用于组织靶向药物（特别是放射性药物）的研究。     

KGF-2与PRO2605蛋白相互作用的初步研究

目的：利用酵母双杂交系统筛选KGF-2的相互作用蛋白，为阐明其分子作用机制提供有益线索。方法：通过聚合酶链反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF-2 cDNA，构建诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2，并对其自身转录激活活性进行鉴定，利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库，挑选双阳性克隆。将KGF-2和候选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中，共同转染COS-7细胞，通过CAT分析验证KGF-2和候选蛋白之间的相互作用。结果：VDNA序列分析和同源检索显示所获候选蛋白为PR02605。以KGF-2和PRO2605 cDNA共转化酵母宿主Y190后可激活报道基因，但共转染COS-7细胞后，CAT分析结果阴性。结论：KGF-2和PRO2605在酵母体内存在相互作用，但在COS-7细胞中未能检测到两者的相互作用。     

基于细胞表面特异识别的荧光标记小分子抗体的鉴定及其应用

 目的 建立基于细胞表面特异性识别的荧光标记小分子抗体的鉴定方法并应用于食管癌外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)检测。方法 本研究前期利用噬菌体技术高通量筛选富集到单链噬菌体抗体NFC 20b和NFC 70a,标记荧光后,观察在斑马鱼体内与食管癌细胞的聚集示踪,并用于检测食管癌患者的外周血CTCs;同时通过高通量蛋白组芯片对抗原蛋白表达谱进行分析。结果 荧光小分子抗体NFC 20b和NFC 70a于不同时间点,在斑马鱼的背主动脉、尾动脉和尾静脉中均能观察到抗体分布,与空白组和阴性抗体组相比,两抗体与移植瘤结合荧光更强;用蛋白芯片筛选抗原蛋白表达谱,初步确定NFC 20b结合的抗原蛋白为细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)。结论 荧光标记的小分子抗体可以通过血液循环分布到斑马鱼的卵黄囊,并能与移植瘤有明显的聚集结合效应,可以用于检测食管癌患者外周血CTCs;利用蛋白芯片技术可以辅助鉴定抗体所结合的抗原种类。     

一种新的人源性穿膜肽

目的：观察一种新的人体蛋白结构域(Circadian locomoter output cycles kaput protein′s DNA-binding peptide，hCLOCK′s DNA_BIND)对细胞膜的穿透过程。方法：化学合成hCLOCK′s DNA_BIND，N端标记FITC荧光素，与培养的血管内皮细胞(ECV-304)和原代培养的神经胶质细胞孵化后，荧光显微镜下观察并进行荧光强度分析。结果：hCLOCK′s DNA_BIND能够有效通过细胞膜屏障，内化的量随孵化时间和肽段浓度的增加而增加，但温度的改变对其似乎没有影响。结论：hCLOCK′s DNA_BIND具有很强的内化作用，为研究药物安全透过细胞膜屏障的载体提供了有效途径。     

基于毛细管电泳的细胞SELEX方法的初步建立

目的：初步建立一种基于毛细管电泳技术的细胞指数式富集的配基系统进化（SELEX）技术,实现快速、高效和微量筛选。方法：以表达有绿色荧光蛋白的HepG2细胞作为靶细胞,FITC标记的DNA文库作为初始文库,采用带有激光诱导荧光检测器的毛细管电泳（CE）进行检测分离,收集制备次级文库。同时采用常规方法进行了一轮细胞筛选,以进行比较。结果及结论：流式分析结果显示与常规方法相比,引入毛细管电泳分离技术后经过一轮筛选,特异配基即获得了较好的富集。这表明基于毛细管电泳的细胞SELEX方法获得了初步建立,为实现肿瘤细胞的快速微量筛选奠定了基础。     

抗凋亡蛋白BFL1/hA1研究进展

在细胞凋亡的调控过程中，Bcl-2家族蛋白发挥了关键作用。BFL1／hA1是Bcl-2家族中分子结构、作用途径和转录调控研究得比较深入的一个分子。BFL1／hA1通过与Bcl-2家族促凋亡成员Bid的功能形式tBid的BH3结构域紧密结合，阻止了tBid与促凋亡蛋白Bak和Bax相互作用，从而阻止了细胞色素C向胞质中释放，抑制细胞凋亡的发生。佛波酯（phobol ester）和炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等可以有效地诱导BFL1／hA1的表达。包括NF-κB在内的多种转录因子通过蛋白质和蛋白质及蛋白质和DNA相互作用形成一个大的转录调控复合物——增强体结合到BFL1／hA1基因的5’调控区，促进其转录水平的上调。     

DNA双链断裂感应分子ATM能与PTC1相互作用

目的：研究DNA双链断裂感应分子ATM与原癌基因ret重排活化蛋白PTC1的相互作用。方法：用Flag抗体Western印迹检测，ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的PTC1；RET抗体检测ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的c-ret;用HA／myc抗体Western印迹检测，HA－ret TK myc-LZPR免疫共沉淀蛋白复合物；荧光蛋白标记的亚细胞定位。结果：PTC1可以与ATM激酶相互作用，此作用不依赖于电离辐射，且不被PI3K家族特异性抑制剂沃氏蓝霉素（wortmannin)所抑制，而野生型RET蛋白则不能同ATM结合；缺失体实验进一步证明两者的结合区段为ATM的LZPR结构域与PTC1的酪氨酸激酶结构域，构建PTC1绿色荧光蛋白表达质粒的亚细胞定位实验显示，PTC1以弥散形式分布于细胞质内。结论：胞浆蛋白PTC1可能借债某种途径使ATM在DNA损伤反应发生后重新定位，介导了细胞的恶性转化机制。     

p185HER-2蛋白胞外区的表达及其结合肽的筛选

目的：构建p185^HER-2蛋白胞外区的原核表达裁体，实现p185^HER-2蛋白胞外区的表达。以纯化p185^HER-2蛋白胞外区为靶，从噬菌体肽库中筛选其结合肽，用于肿瘤导向治疗。方法：从含有HER-2全长cDNA的质粒psv^2-cerbB-2中克隆了人p185^HER-2蛋白胞外区cDNA，将此cDNA克隆到pET-30a 表达栽体中，构建p185蛋白胞外区的表达栽体。表达的p185^HER-2蛋白胞外区通过Zn^2 螯合层析柱进行纯化。以纯化的p185^HER-2蛋白胞外区为靶，通过淘洗方法进行噬茵体肽库筛选。结果与结论：构建了p185^HER-2蛋白胞外区的原核表达栽体，实现了p185^HER-2蛋白胞外区的高表达。通过Zn^2 螯合层析柱实现一步纯化，p185^HER-2蛋白胞外区的纯度达到95％。从噬菌体随机环七肽库中找到了一组具有核心序列p185^HER-2蛋白胞外区结合肽。这些p185^HER-2蛋白胞外区结合肽有可能成为肿瘤治疗的新的候选分子。     

穿膜肽标记异硫氰酸荧光素及钆喷替酸葡甲胺行MR分子显像的探讨

目的选择穿膜肽的基本序列之一，构建目的多肽序列标记异硫氰酸荧光素（FITC）及钆喷替酸葡甲胺（Gd-DTPA），探讨穿膜肽携带FITC及Gd-DTPA跨膜转运性能及MR分子显像的价值。方法在穿膜肽9聚精氨酸[arginine]基础上，构建新目的多肽序列CPP13：LAGRRRRRRRRRK，固相合成多肽后标记FITC（记为CPP13-FITC）和Gd-DTPA（记为CPP13-DTPA-Gd）；分别取CPP13-FITC和FITC溶于无血清Dulbecco最低必须培养液（DMEM）培养基中，待HEPG2细胞及鼠骨髓干细胞爬片上生长至80％-90％汇合时，取2只30mm^2皿，弃去培养皿中培养液，一皿中加入CPP13-FITC／DMEM溶液，另一皿中加入FITC／DMEM溶液，37℃CO2孵箱中抚育10、30、60min时依次取出1片，磷酸平衡盐溶液（PBS）冲洗爬片后置于倒置荧光显微镜上观察细胞内出现荧光素分布的时间和部位。CPP13-DTPA-Gd作用肝癌细胞株HEPG2后，MRI研究CPP13-DTPA-Gd在细胞内转运性能及MRI的特点，将CPP13-DTPA-Gd溶于无血清DMEM培养基中，浓度为3mg／ml。待HEPG，细胞在100mm。培养皿中长至80％-90％汇合时，取3只皿分别加入CPP13-DTPA-Gd的DMEM溶液、DTPA-Gd／DMEM溶液和DMEM溶液，孵育30min后弃去培养液，以0．1MPBS反复冲洗，胰酶消化，加入2m 1l％琼脂糖／PBS溶液混匀，装入2ml离心管中，将3管固定于装有150ml 1％琼脂糖／PBS溶液的微量加样枪头盒中，待凝固后测定MR信号。结果固相合成多肽成功，测定分子量为1792．78，与理论值接近。纯度达到95％以上；标记荧光素后，倒置荧光显微镜观察细胞摄取显示10min时肝癌细胞株HEPG2和鼠骨髓干细胞胞质与细胞核内均出现荧光分布；CPP13标记的Gd-DTPA，作用细胞30min后MRI显示CPP13-DTPA-Gd作用HEPG2细胞组呈短TI、短T2信号。3层面内3组细胞感兴趣区T1信号强度（Ii）与琼脂糖T1信号强度（Io）的比值及统计学分析如下：（1）号管3层面内Iil／Io（为CPP—DTPA-Gd作用cell组管内信号值与管外烧杯内琼脂糖背景信号值的比值）分别为：2．84、2．60、2．48；（2）号管3层面内Ii2／Io（为Gd-DTPA作用cell组管内信号值与管外烧杯内琼脂糖背景信号值的比值）分别为1．15、1．11、1．12；（3）号管3层面内Ii3／Io（为空白cell对照组管内信号值与管外烧杯内琼脂糖背景信号值的比值）分别为1．13、1．11、1．11。两两组间F检验：（1）与（2）：F（I．2）=201．88（P〈0．001）；（1）与（3）：F（1．3）=206．37（P〈0．001）；（2）与（3）：F（2．3）=0．529（P=0．507）。说明T1WI信号强度与Gd-DTPA作用组及与单纯细胞组信号强度比较差异有统计学意义；HEPG2细胞不摄取Gd-DTPA，30min时信号强度与单纯细胞组信号强度间差异无统计学意义。结论在穿膜肽基本序列基础上成功地重新构建的多肽能够携带荧光素和MR对比剂，并有效地跨膜转运进入细胞，为MR分子显像提供了1种新的重要手段。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导HeLa细胞p21WAF1/CIP1表达的分子机制研究

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDIs）诱导肿瘤细胞产生周期阻滞以及诱导p21^WAF1／CIP1表达的分子机制。方法：以人宫颈癌HeLa细胞为模型，用曲古抑茵素A（TSA）处理HeLa细胞，通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡，通过Western印迹及RT-PCR检测周期相关分子的蛋白及mRNA的表达；并构建TSA靶分子启动子区的荧光素酶报告质粒，进一步检测TSA的主要作用位点，寻找相关作用途径。结果与结论：TSA可诱导HeLa细胞发生周期阻滞，并呈现明显的剂量和时间依赖关系，加大用药剂量及延长用药时间可诱导凋亡。TSA可显著诱导p21^WAF1／CIP1的表达，表现为转录水平的调节，其变化可以指示周期阻滞的程度。p21^WAF1／CIP1启动子区3′端是TSA作用的主要位点，同样被TSA诱导表达增加的p53很可能通过与其效应元件的结合而使TSA诱导p21^WAF1／CIP1表达的总效果增强。     

多效生长因子基因沉默抑制PTEN基因敲除细胞的增殖

目的：在肿瘤抑制基因PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞Pten-/-MEF241细胞中,研究多效生长因子（pleiotrophin,Ptn）对细胞增殖的影响.方法：设计并合成可编码针对小鼠Ptn基因的小干扰RNA （siRNA）寡核苷酸,构建至pSilencerTM3.1-H1载体,将载体转染进Pten^-/-MEF241细胞中,获得稳定表达细胞克隆株,通过Northern印迹检测Ptn基因表达被抑制的情况,根据细胞生长曲线检测沉默Ptn基因对Pten^-/-MEF241细胞生长的影响.结果：获得的稳定克隆株中,与对照细胞相比,Ptn基因的表达在转染Ptn siRNA-B的3株细胞中均得到了有效的抑制,而在转染Ptn siRNA-C的2株细胞中抑制效果较差.生长曲线结果显示,在Pten^-/-MEF241细胞中,沉默Ptn基因能够减缓Pten^-/-MEF241细胞的生长速度.结论：本研究获得了可有效抑制Ptn基因的小干扰RNA,证明沉默Ptn基因可抑制PTEN 基因缺失细胞的增殖,提示Ptn可作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标.     

感染乳鼠组织中克里米亚-刚果出血热病毒的RT-PCR检测与形态学鉴定

目的：检测并鉴定感染组织中的克里米亚-刚果出血热病毒。方法：分别经皮下与腹腔两种途径感染乳小鼠；应用RT-PCR技术对病毒核酸进行检测；利用透射电镜超薄切片技术对病毒进行形态学鉴定。结果：RT-PCR可在心脏、肝脏、脾脏、肾脏以及脑组织内检测到病毒核酸，透射电镜下可在肝细胞胞浆内观察到形态典型的病毒粒子。结论：应用RT-PCR技术可以对感染组织中的克里米亚-刚果出血热病毒进行检测，利用透射电镜可以对病毒的形态进行观察与鉴定。     

PKA磷酸化p21WAF后对其泛素化修饰和稳定性的影响

目的：探索p21被蛋白激酶A（PKA）磷酸化修饰后对其泛素化修饰和稳定性的影响。方法：构建p21可能磷酸化位点的突变体p21 T145A，观察PKA体外磷酸化修饰p21；Western印迹分析PKA特异性抑制剂H89对p21稳定性的影响；通过免疫沉淀分析H89对p21泛素化修饰的影响以及p21 Thr 145突变前后和Skp2结合能力的变化。结果：PKA体外磷酸化修饰p21的Thr 145；PKA特异性抑制剂H89能够提高p21的稳定性并抑制p21的泛素化修饰；野生型（wild）p21比p21 T145A结合sk02的能力强。结论：PKA磷酸化修饰p21的Thr 145后导致其结合E3连接酶结合亚基skp2的能力增强，从而促进p21的泛素化修饰，导致p21稳定性的降低。     

新分离呼肠病毒的空斑试验及病毒纯化

目的：建立新分离呼肠病毒（reovirus）的空斑技术，进行病毒纯化，为呼肠病毒生物学和分子生物学的研究奠定基础。方法：4株新分离呼肠病毒的早代毒种经L929细胞连续传代，当产生细胞病变后进行空斑试验，加营养琼脂培养6d后加中性红，24h内挑取空斑，扩增一次后做PCR鉴定。取呼肠病毒PCR阳性病毒进行第2次克隆纯化。结果：4株新分离呼肠病毒经L929细胞连续传2～4代，均能观察到明显的细胞病变。用10^-3和10^-4接种L929单层细胞，第6～7天均能产生空斑，空斑呈圆形，直径为0．2～1．0mm，并分别测定其空斑滴度（PFU／ml）。两次纯化后进行PCR检测，呼肠病毒基因扩增阳性、脊髓灰质炎病毒基因扩增阴性。结论：4株呼肠病毒的空斑出斑规律，通过两次克隆，获得纯化的病毒。