C_(6/36)细胞在乙型脑炎病毒检测上的应用

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的检测方法,既往多采用小鼠脑内接种分离病毒,病毒量滴定,制备血凝素及中和抗体测定。自六十年代以后逐步开始应用组织培养代替小鼠。其中应用原代地鼠肾细胞滴定病毒,制备血凝素,进行细胞中和试验,以及用鸡胚细胞进行空斑试验滴定病毒和空斑减少中和试验等最为常见。但由于许多传代细胞系对乙脑病毒的病变不十分稳定,因此较少应用,Igarashi建立的白纹伊蚊细胞C_(6/36)纯系对许多虫媒病毒均敏感。本文试图应用该细胞培养乙型脑炎病毒制备血凝素并应用细胞病变进行病毒量测定和微量中和试验。取得了满意的结果,现报导如下。     

微囊藻毒素-LR对睾丸支持细胞活性及凋亡基因表达的影响

[目的]研究微囊藻毒素-LR对睾丸支持细胞活性的影响及其对细胞凋亡相关基因表达的影响. [方法]分离纯化大鼠睾丸支持细胞,用低剂量(0～500×10-3 μg/ml)和高剂量(1～20 μg/ml)微囊藻度素-LR染毒细胞,细胞培养24 h、48 h和72 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和中性红吸收(NR)实验检测微囊藻毒素-LR对支持细胞活性的影响;将纯化后的部分睾丸支持细胞接种于6孔板中,给予不同剂量的微囊藻毒素-LR (0,1,10μg/ml),于24h和48 h后提取细胞总RNA,RT-PCR方法检测细胞中凋亡相关基因P53、bax和bcl-2表达水平.[结果]低剂量(0～500×10-3 μg/ml)微囊藻毒素-LR作用于支持细胞24、48、72 h,细胞活性增强.高剂量微囊藻毒素-LR(10和20μg/ml)作用24、48 h,细胞活性显著降低.时闻效应实验结果显示随着暴露时间的延长细胞活性降低.细胞暴露于1 μg/ml微囊藻毒素-LR后与对照组细胞相比较P53和bcl-2 mRNA水平相对表达量增加,bax表达量降低.暴露予10 μg/ml微囊藻毒素-LR后P53和bax mRNA水平相对表达增加,bcl-2表达降低.[结论]低剂量的微囊藻毒素-LR对 细胞具有兴奋效应,随着剂量的增高及暴露时间的延长微囊藻毒素-LR能够明显抑制细胞活性.同时微囊藻毒素-LR可通过P53、bax和bcl-2基因的表达影响睾丸支持细胞的凋亡.     

十溴联苯醚诱导小鼠海马神经元细胞氧化应激和凋亡的机制

目的探索十溴联苯醚(PBDE-209)诱导小鼠海马神经元细胞凋亡的潜在机制。方法原代海马神经元细胞和海马神经元细胞系HT-22用0、6.25、12.5、25、50和100μg/mL PBDE-209处理24 h。检测原代海马神经元细胞SOD活性,MDA、NO和GSH的含量,用Annexin V/PI双染法检测海马神经元细胞系HT-22细胞凋亡情况,用免疫蛋白印迹Western blot检测Bax、Bcl-2、CHOP、GRP78、PERK和Caspase-12蛋白表达水平。结果染毒组原代海马神经元细胞和HT-22细胞系细胞存活率显著降低(P0.05)。原代海马神经元细胞MDA、NO含量显著升高(P0.05),GSH含量、SOD活性显著降低(P0.05);原代海马神经元细胞的Bax/Bcl-2比值、CHOP、Caspase-12蛋白表达水平升高(P0.05)。HT-22细胞系GRP78、PERK、Caspase-12表达水平和细胞凋亡率升高(P0.05)。结论氧化应激和内质网应激可能参与PBDE-209诱导的海马神经元细胞凋亡过程。     

微囊藻毒素-LR对传代细胞的毒性

目的 从多种传代细胞株中，筛选对微囊藻毒素-LR敏感的细胞株，探讨建立经济、简便研究该毒素传代细胞模型的可能性。方法 不同宿主来源的8种细胞株(KB细胞，NIH／3T3细胞，H-4-Ⅱ-E细胞，Hela细胞，Vero细胞，HepG2细胞，Caco-2细胞，HL-60细胞)与不同浓度的微囊藻毒素-LR作用，细胞培养24，48，72。96h后观察其形态学变化，利用体外细胞法(MTT)测定其细胞毒性终点(判断细胞活性)及乳酸脱氢酶试验测定细胞膜受损情况。结果8种细胞株中，KB细胞和H-4-Ⅱ-E细胞在培养96h，毒素浓度大于18．8μg／ml时，呈现明显剂量-反应关系。KB细胞与毒素接触8h后就有显著的形态学改变，其实验结果的重现性和稳定性非常好；乳酸脱氢酶试验显示微囊藻毒素-LR可导致KB细胞膜损伤。结论 微囊藻毒素-LR对KB细胞和H-4-Ⅱ-E细胞有明显的细胞毒性作用。从形态学变化、试验结果的重现性、稳定性和敏感性考虑，KB细胞可用作研究该毒素的传代细胞模型。     

三种氯代烯烃对人角质形成细胞的细胞毒性作用

目的　探讨三氯乙烯(trichloroethylene ,TCE )、四氯乙烯(perchloroethylene ,PCE )和二氯乙烯(dichloroethylene ,DCE)对人角质形成细胞(keratinocyte ,KC)的细胞毒性作用以及其时间 剂量 效应关系。方法　利用中性红吸收(neutralreduptake ,NRU)试验测定TCE、PCE和DCE对人KC的中性红半数吸收浓度(5 0 %neutralreduptake ,NR50 ) ,用乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase ,LDH)释放试验研究三者对人KC细胞毒作用,并探讨其时间 剂量 效应关系。结果　TCE、PCE和DCE对人KC的NR50 分别4 .5 3mmol/L、2 . 16mmol/L和5 . 5 7mmol/L ,LDH释放试验表明三者对人角质形成细胞具有明显的细胞毒作用,且具有时间 剂量 效应关系。结论　TCE、PCE和DCE都对人KC具有细胞毒性,且PCE >TCE >DCE。这可能与三者对人KC的细胞膜损伤有关。     

活性氧在微囊藻毒素-LR诱导细胞凋亡效应中的作用探讨

[目的]研究微囊藻毒素．LR（MC—LR）对原代大鼠肝脏细胞的促凋亡效应以及探讨活性氧（ROS）在这一效应中的作用。[方法]采用胶原酶灌注法获取原代大鼠肝脏细胞,用William’s E培养液重悬后接种于铺被鼠尾胶原的孔板内,分为1个对照组和4个染毒组,370C、5％CO2条件下培养3h后换液并染毒各梯度浓度的MC—LR,使各染毒组毒物终浓度分别为1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol／L。染毒相应时间后,采用中性红比色实验检测细胞存活率,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS含量。[结果]中性红比色实验发现,至染毒期末观察到1×10^-5、1×10^-6mol／L两个染毒组的肝脏细胞几乎全部死亡（〉95％）,1×10^-7mol／L染毒组部分肝脏细胞死亡（约30％）;流式细胞术观察到MC—LR染毒后早期（5min）诱导细胞调亡,同时观察到肝脏细胞内短时间（15min）快速产生大量的ROS。[结论]MC—LR诱导原代大鼠肝脏细胞快速产生大量的ROS,这可能是MC-LR诱导细胞凋亡并最终导致细胞死亡的毒性作用机制之一。     

使用CHO细胞染色体畸变和SCE检测致癌物

本文报道了用中国地鼠卵巢(CHO)细胞测试系统检测染色体畸变和姐妹染色单体交换(SCE)的方法。并经已知致癌物苯并(a)芘(BP)和黄曲霉毒素B_1验证。实验使用从国外引进的CHO细胞系,培养于最低基础培养液中,另补充非必需氨基酸和10％小牛血清,在含5％CO_2的培养箱中于37℃条件下培养。实验在加入和不加入肝匀浆S_9混合物的情况下,使受试物与细胞反应2小时。反应结束后24小时内收获细胞。作染色体分析用。如进行SCE分析用,则需于反应结束后加入含20μMBrdU的培养液。培养24～27小时,再加入秋水仙素。4小时后收获细胞。制片,用荧光素加姬姆萨染色法染色。 BP和黄曲霉毒素B_1诱发SCE频率和染色体畸变率的增加,并呈良好的剂量—反应关系。对肝匀浆S_9适宜浓度的研究表明,5％的浓度是合适的。     

光工作人员外周血中性分叶核细胞中中毒细胞和核突细胞的观察

光工作人员外周血中性分叶核细胞中中毒细胞和核突细胞的观察建湖县人民医院（建湖２２４７００）章龙生大量事实证明在严重感染或中毒时，由于毒素的侵袭可以发现中性粒细胞的核及胞浆发生一些毒性变化。本文对５０例正常成人及６０例ｘ光人员的中性分叶核细胞中毒变化及...     

基于微孔板的人HepG2细胞体外彗星试验方法的研究

目的运用微孔板体外培养技术,建立人HepG2细胞的体外彗星试验方法,为进一步建立体外高通量筛选方法提供依据。方法选用人HepG2细胞,运用96孔板体外细胞培养技术,建立微孔板的彗星试验方法,结合中性红检测细胞毒性的方法,选择20种化合物对所建方法进行验证。结果阳性和阴性对照物用所建方法与体内试验所获结果一致,验证结果显示,8种遗传毒物在体外彗星试验中均获得阳性结果,灵敏度为100%,且当细胞的相对活力>50%时,拖尾率及尾长均与剂量呈正相关。12种非遗传毒物中,11种物质呈阴性反应,1种物质呈阳性反应,特异性为91%。结论运用微孔板体外细胞培养技术,可在1块96孔板上同时检测4~5种受试物,并在无S9的情况下能检测出直接与间接诱变剂,并可界定出引起遗传毒性的作用剂量,提高了筛选的速度,减少了受试物等的用量,具有发展成为体外高通量筛选方法的良好条件。     

利用体外3T3细胞中性红摄取试验检测化学物质光毒性作用

目的建立体外Balb/c3T3细胞中性红摄取法作为检测化学物光毒性的试验方法,初步探讨体外BaLb/c3T3细胞中性红摄取法作为豚鼠光毒性试验的一种替代方法。方法采用体外培养的BaLb/c3T3细胞建立反应的最佳条件。结果中性红浓度、孵育时间、pH值、性别浓度等是影响试验结果的因素。结论体外BaLb/c3T3细胞中性红摄取试验可作为动物光毒性试验的替代方法。     

鱼藤酮对大鼠中脑原代培养细胞的毒性

目的 研究植物杀虫剂鱼藤酮(Rotenone)对大鼠中脑原代培养细胞的毒性作用.方法 采用大鼠胚胎中脑原代细胞培养法,用0.01、0.10、1.00μmol/L鱼藤酮对体外培养中脑原代培养细胞染毒24h,通过免疫细胞化学的方法观察神经细胞的存活数及形态学改变.结果 与对照(0μmol/L)组比较,0.10和1.00μmol/L鱼藤酮染毒组多巴胺神经元数目明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);1.00μmol/L鱼藤酮染毒组星型胶质细胞数目明显下降,差异有统计学意义(P<0.05).随着鱼藤酮染毒浓度的升高,存活的多巴胺(DA)能神经元体积变小,突起减少、变短或断裂.结论 多巴胺神经元对鱼藤酮的毒性作用更敏感.     

两种膨润土细胞毒性的体外试验研究

目的 比较酸性膨润土和有机膨润土的细胞毒性.方法 用CCK-8试验、中性红(NRU)试验、乳酸脱氢酶(LDH)试验、凋亡试验和溶血试验来检测2种土的细胞毒性.溶血试验以人的红细胞为靶细胞,暴露剂量为0,0.3125、0.6250、1.2500、2.5000mg/ml,暴露10min.其余4个试验均以人B淋巴细胞系(HMy2.CIR)为靶细胞,暴露剂量为0、10、20、30、60、120、180 μg/ml,暴露4 h.结果 所有剂量2种膨润土的溶血率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).CCK-8试验结果表明,酸性土和有机土剂量分别≥30、20μg/ml时,细胞活性明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);NRU试验和LDH试验出现类似结果,并均呈剂量-效应关系.180μg/ml酸性土组与120、180μg/ml有机土组的早期细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).5个体外试验的结果均表明,有机土毒性明显高于酸性土.结论 2种膨润土均可诱发细胞凋亡、细胞膜损伤等细胞毒性.有机土细胞毒性明显高于酸性土.     

四氯乙烯对人原代角质形成细胞的细胞毒性作用

[目的]研究体外培养条件下有机溶剂四氯乙烯(perchloroethylene,PERC)对正常人表皮角质形成细胞(normalhumanepidermiskeratinocyte,NHEK)的细胞毒性作用。[方法]用0.25%的胰蛋白酶经冷温两步消化皮肤,分离得到NHEK,进行体外无血清培养;用中性红吸附试验(NRU)测定PERC对NHEK的中性红吸附减少50%的浓度(NR50值),并据此确定PERC细胞毒性试验的染毒剂量;测定乳酸脱氢酶(LDH)活力反映其对细胞膜的损害,测定丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力反映细胞脂质过氧化作用。[结果]PERC可引起NHEK细胞活力剂量依赖性降低,PERC对NHEK的NR50值为2.16mmol/L(95%可信区间为1.27~3.07);0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mmol/LPERC处理NHEK1、2、3、4h后,LDH的释放呈明显剂量-反应和时间-反应关系;以上浓度的PERC处理NHEK4h,可引起MDA含量增加和SOD活力抑制,且均显示剂量-反应关系,与空白对照组、溶剂对照组相比,引起差异有显著性的最低浓度分别为0.20mmol/L(MDA升高)和0.10mmol/L(SOD降低),均为P<0.05。[结论]在体外培养条件下,PERC可能通过氧化应激和脂质过氧化作用对人角质形成细胞产生细胞毒性作用。     

人类表皮角朊细胞原代培养方法新进展

自1975年RheinWald和Green等首次培养成功人类皮肤表皮角朊细胞(Human Keratinocyte,HK)以来,表皮细胞培养技术已越来越多地被应用于医学研究:正常人或皮肤病人(如牛皮癣)表皮细胞增生、分化、角质形成及DNA合成等特性的研究;用自体或同种表皮细胞培养作为植皮的补充措施之一;用融合或接近融合的表皮细胞研究化学物的致癌作用;在药理及毒理学中的应用已日益引起关注。有关人类表皮细胞培养方法报道不一,由于影响因素较多,现正努力探索更简易有效的培养技术。本文就近年文献中介绍的方法及其在毒理学中的应用作一概述。     

整合素β1阳性卵巢癌细胞具干细胞样属性和间质属性分析

目的:检测和分选人卵巢癌细胞系SKOV3及原代卵巢癌细胞中整合素β1(ITGβ1)阳性细胞,鉴定其是否具有肿瘤干细胞生物学特性。方法:从临床卵巢癌患者腹水中成功分离卵巢癌细胞后,采用流式细胞技术检测SKOV3及原代卵巢癌细胞中ITGβ1和干细胞标志CD133的阳性率;流式分选得到ITGβ1(+)和ITGβ1(-)两群细胞后,采用qRT-PCR比较卵巢癌干细胞相关基因(CD44、CD133、ALDH1、OCT)及上皮间质化(EMT)分子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentine、MMP2、MMP9)表达情况,采用悬浮成球试验观察两者干细胞潜能。最后通过免疫缺陷小鼠体内的有限稀释成瘤试验对比ITGβ1(+)/ITGβ1(-)细胞的成瘤能力、自我更新和自我分化能力。结果:SKOV3细胞中可检测到少量的CD133(+)细胞,其比率为(0.91±0.12)%,腹水原代细胞中CD133(+)比率为(2.38±0.34)%;ITGβ1检测SKOV3中ITGβ1(+)比率为(1.95±0.24)%,原代卵巢癌细胞中含量为(3.78±0.28)%;流式分选得到的ITGβ1(+)细胞较ITGβ1(-)细胞表达更高的干细胞基因(CD133、CD44、ALDH1、OCT4)(P<0.05)、更低的上皮标志E-cadherin(P<0.05)和更高的间质标志(N-cadherin、Vimentine、MMP2、MMP9)(P<0.05);悬浮成球试验结果显示:SKOV3细胞和原代卵巢癌细胞中ITGβ1(+)细胞较ITGβ1(-)细胞成球数量明显增多,球体体积也明显大于ITGβ1(-)细胞(P<0.05);体内成瘤试验结果显示:在SKOV3细胞系或原代卵巢癌细胞中102个ITGβ1(+)细胞即可成瘤,成瘤比率分别为1/5和2/5,成瘤时间分别为64天和54天;而至少需要104个ITGβ1(-)细胞SKOV3细胞系才有成瘤现象,至少需要103个ITGβ(-)细胞原代卵巢癌细胞才有成瘤现象,成瘤比率均为1/5,成瘤时间分别为78天和68天;ITGβ1(+)细胞的成瘤能力至少为ITGβ1(-)细胞的100倍。结论:卵巢癌细胞中ITGβ1(+)细胞高表达间质属性和干细胞基因,具备自我分化、自我更新和体内成瘤能力,ITGβ1(+)表型可考虑作为分选卵巢癌干细胞的新方法。     

四种细胞毒性试验测定柴油机尾气颗粒物提取物急性毒性的比较

目的比较四种体外细胞毒性试验检测柴油机尾气颗粒物(DEP)提取物急性毒性的能力。方法用浓度分别为5、10、20、40、80和160μg/ml的DEP提取物作用于16HBE细胞,于12、24及48h后,通过MTT法、中性红法、乳酸脱氢酶(LDH)法及蛋白测定法测细胞存活率。结果 MTT法在检测急性毒性方面与其它三种方法相比,染毒12h时就表现出了很高的敏感性。随着染毒时间的增加,MTT法与中性红法的敏感性逐渐提高,染毒24h后与对照组相比,各剂量组细胞存活率明显降低(P<0.05)。LDH法测定DEP提取物染毒24h后细胞存活率有所降低,但继续增加染毒时间,存活率不再发生变化。蛋白法测定染毒12h和24h的细胞存活率,仅高剂量组显著降低,染毒48h后,各剂量组细胞存活率均显著降低。结论四种不同的细胞毒性试验测定结果存在差异,MTT法和中性红法比蛋白法和LDH法更为敏感。结合各试验检测的毒性指标可以看出,DEP提取物主要影响16HBE细胞内各细胞器的功能,如线粒体、溶酶体;对于细胞贴壁的影响和细胞膜损伤程度的影响较弱。     

人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及生长曲线的绘制

目的 探讨EM异位子宫内膜细胞原代培养方法,并绘制其生长曲线.方法 采用改良EM细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,并观察细胞形态差异.结果 正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率,在位子宫内膜腺上皮细胞与正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似,但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多,核增大.结论 注意取材方式,采用改良原代培养方法.可以提高EM异位子宫内膜细胞培养成功率有所提高.异位子宫内膜细胞与正常对照在位子宫内膜细胞形态和活力的差异,是揭示子宫内膜异位症的发病机制的一个有利因素.     

小鼠原代神经元细胞狂犬病病毒滴度测定

目的探索利用小鼠原代神经元细胞测定狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的可行性。方法分离培养小鼠大脑皮质原代神经元细胞,接种100小鼠脑内接种半数致死量(MICLD50)的标准攻击强毒(CVS)毒株,通过免疫荧光和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其感染性,并在此基础上在原代神经元细胞上进行了该毒株的细胞半数感染量(CCID50)测定。结果成功制备了小鼠大脑皮质原代神经元细胞;原代神经细胞培养物接种CVS 96h后,用抗微管相关蛋白质(MAP2)抗体和抗RV阳性血清作为一抗并经荧光抗体染色后,在胞体和突起上均有神经元特异性和RV特异性着染;在共聚焦显微镜下,当相同的细胞部位上出现红色和绿色交迭时呈现粉色斑点,免疫荧光证实原代神经细胞可被CVS感染,同时RT-PCR得到1 770 bp左右的目的条带,说明其被CVS感染;该原代细胞上所测定的CVS病毒滴度为104.5CCID50/0.1 mL,而该病毒的原始滴度为104.5MICLD50/0.03 mL。结论小鼠脑原代神经元细胞上测定的CVS株的病毒滴度与通过脑内接种法测定的滴度相同。     

高脂膳食对人肺腺癌细胞SPCA1增殖活性影响的血清生理学研究

目的探讨用血清生理学方法直接在细胞水平上研究高脂膳食对人肺腺癌细胞系SPCA1增殖活性的影响。方法在探讨合适的血清生理学实验条件后,将20只SD雌性大鼠按体重随机分为高脂组和对照组,对照组自由进食普通饲料,高脂组自由进食高脂饲料(猪油∶普通饲料=1∶9),喂养7周后取血分离血清,用大鼠血清代替细胞培养液中小牛血清培养人肺腺癌细胞系SPCA1,用MTT比色法、3HTdR掺入法、流式细胞术检测方法从细胞生长曲线、细胞DNA合成以及细胞周期分布等方面观察高脂膳食喂养的雌性大鼠血清对癌细胞增殖活性的影响。结果(1)加入细胞培养液中血清浓度为15%时,人肺癌细胞生长较好,并且未灭活组好于灭活组。(2)从MTT比色法、3HTdR掺入实验以及流式细胞术结果来看,高脂膳食喂养的大鼠血清(RSTHFD)能促进肺腺癌细胞SPCA1的增殖和癌细胞DNA的合成,并能促使细胞进入活跃的有丝分裂状态。结论(1)用血清生理学方法可以直接在细胞水平上研究膳食因素对人肺腺癌细胞系SPCA1增殖活性的影响。(2)高脂膳食能促进人肺腺癌细胞SPCA1的增殖。     

BHK-21细胞在流行性乙型脑炎病毒检测上的应用

流行性乙型脑炎 (简称乙脑 )是一种严重危害人类健康的疾病。既往对乙脑病毒的检测采用小鼠脑内接种分离病毒 ,然后进行病毒滴定 ,测定抗体。自 6 0年代以后 ,开始应用组织培养代替小鼠 ,应用原代地鼠肾细胞和鸡胚细胞以及传代细胞。但由于原代细胞来源困难 ,许多传代细胞对乙脑病毒的病变不十分稳定 ,因此较少应用。从 2 0 0 0年开始探索应用BHK 2 1细胞传代地鼠肾细胞培养乙脑病毒 ,并应用细胞进行病毒滴定和中和抗体测定 ,取得了满意效果。1　材料与方法1 1　细胞的制备　BHK 2 1细胞由中国军事医学科学院惠赠 ,在本实验室已传至 5 3…