小鼠抗人Nanog多克隆抗体的制备及其鉴定

目的用基因免疫方法制备小鼠抗人Nanog多克隆抗体并进行鉴定。方法应用Accelrys软件分析Nanog抗原表位,选择其中免疫原性较强的抗原表位（A16-V101）,从Nanog cDNA全长质粒中扩增其cDNA（258bp）序列,克隆到pBQAP-TT构建基因免疫载体,鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-Fh31。同时免疫小鼠,12周后用ELISA方法检测血清抗体滴度,Western blot方法鉴定抗体对人肾组织的特异性。同时将Nanog-AAV2病毒转染到HKC细胞,免疫荧光定位Nanog在细胞的表达。结果成功构建了Nanog基因免疫载体,经酶切及序列分析鉴定完全正确。ELISA结果显示抗体滴度为1：32000。Western blot结果显示小鼠抗Nanog多克隆抗体识别人肾组织34kD的Nanog蛋白。免疫荧光结果表明转染的Nanog基因主要表达在HKC细胞细胞核。结论用基因免疫的方法可以成功制备高效价和高特异性抗Nanog多克隆抗体。     

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的：构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体（hscFv)原核表达载体，对其产物作初步鉴定，为肝癌的导向治疗奠定基础。方法：采用分子克隆技术，PCR法扩增PE38基因片段，克隆人GST－融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中，重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确，受IPTG诱导表达后，SDS－PAGE及Westem blot分析GST融合蛋白结果。结果：成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38（以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90000的目的蛋白条带，光密度薄层扫描提示表达量为11％，Western blot在相同位置显示蛋白印迹，证实载体构建及表达均正确。结论：利用基因重组技术，在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38，为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径。     

人细胞外基质磷酸糖蛋白MEPE的表达纯化及抗体制备

目的 原核表达、纯化人细胞外基质磷酸糖蛋白(Mepe)基因,并制备多克隆抗体.方法 设计出扩增人Mepe全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性.结果 原核表达了人Mepe全长基因,纯化了MEPE蛋白,并获得了抗MEPE的多克隆抗体,抗体效价达到1∶25 600,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的MEPE蛋白.结论 MEPE蛋白能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础.     

转移正相关基因mag-1的原核表达及抗体制备

目的:克隆人mag1-基因,在大肠杆菌中进行表达并制备其抗体。方法:利用PCR方法从含有mag1-基因全长序列的pcDNA3-mag1-质粒上扩增mag1-基因开放阅读框(ORF),将其插入表达载体pET-28 a( )中,构建重组表达载体pET-28 a-mag1-,用IPTG诱导目的基因在E.coli中的表达,并通过W estern印迹方法对表达产物进行鉴定。表达产物经过初步纯化后作为抗原免疫兔制备多克隆抗体。结果:所获得的序列经测序分析与源序列一致;SDS-PAGE分析表明,经0.1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h后在E.coli中有大量的融合蛋白表达,相对分子质量约为18×103。W estern印迹分析提示,诱导表达产物能与H is单抗发生特异反应。ELISA结果表明获得了高效价的多克隆抗体。结论:获得了H is-mag1-融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,并制备了其相应的多克隆抗体。     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达

目的：构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素(hEnS)融合基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法：利用RCR的方法扩增hEDN基因，克隆人含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS后，以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PACE及Westen-blot分析及鉴定。结果：成功构建了抗肝癌HdsFv-hEDN融合基因原核表达载体；SDS-PACE和wbsten—blot分析显示，诱导表达产物出现一条Mr约为45．0KD的新生蛋白带，表达量占菌体总蛋白量的x％，主要以包涵体形式存在。结论：抗肝癌hdsFv—hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达，为其进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

抗人红细胞单链抗体基因的克隆与表达

目的：获得抗人红细胞单链抗体（single-chain antibody,ScFv)基因,并在大肠杆菌中表达具有能与人红细胞特异性结合的ScFv。方法：以从分泌抗人红细胞单克隆抗体细胞株中提取细胞的总RNA为模板,利用扩增鼠源性抗体可变区基因的通用引物,通用RT－PCR分别获得轻链（VL）、重链（VH）可变区基因,并通过15个氨基酸的加接肽（Gly4Ser)3按VL－接头－VH的顺序连接起来,组建成ScFv基因。结果：核苷酸序列分析证明,获得的单链抗体基因VH基因属于小鼠抗体重链可变区基因家族的V（A）组,VL基因属于小鼠抗体k轻链可变区基因家族的IV组。与PGEX－5X－3表达载体上的GST融合蛋白表达后,在相对分子质量54000有一明显的空载体对照没有的蛋白带（ScFv28000,GST26000）。间接免疫荧光证明该表达产物能与人红细胞特异性结合。结论：获得抗人红细胞ScFv基因和具有抗体活性的抗人红细胞ScFv,为建立患者自身红细胞凝集试验奠定了基础。     

人CD20胞外区与噬菌体pⅢ融合基因在E．coil中的可溶性表达

目的：克隆人CD20胞外区基因(cdw)和丝状噬茵体(M13KD7)G3蛋白N端结构域(pⅢN1)基因，并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法：利用逆转录PCR和PCR方法分别克隆CD20胞外区基因和pⅢN1基因，然后将二者融合克隆入pTIG-Trx表达载体，在大肠杆菌中进行可溶性表达。结果：可溶性表达产物占细菌可溶性蛋白的约25％，表达产物可被抗CD20分子的单克隆抗体识别。结论：成功地表达并鉴定了人CD20胞外区蛋白，为利用噬菌体抗体库进行抗CD20抗体的筛选奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒（sARSCoV）N蛋白的DNA,构建原核表达质粒pGEX-2T／N,并诱导表达。方法采用RT-PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌中表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS-CoV抗体阳性血清做Western blot。结果获得N基因片段;GST-N融合蛋白以可溶形式表达;Western blot检测表明,其与抗SARS-CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论成功地构建原核表达质粒pGEX-2T／N,并表达GST-N融合蛋白,为下一步的研究奠定了基础。     

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的：构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体，并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法：采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合，构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP—C1-DAT1，测序验证序列无误后。用脂质体法将重组质粒转入C8细胞，荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果：测序验证结果表明，重组质粒含有DAT1全长编码序列，转染实验表明EGFP—DAT1能在C8细胞中正确表达，且：DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论：DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功，在C8细胞中可以正确表达，为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

人载脂蛋白A～Ⅰ的基因克隆﹑原核表达及多克隆抗体的制备

目的获取人载脂蛋白A～Ⅰ(ApoA～Ⅰ)的重组蛋白,并用于多克隆抗体的制备。方法从人肝细胞(LO2)中提取总RNA后,经RT～PCR法得到人ApoA～Ⅰ基因片段,用以构建融合表达载体pGEX～6P～1～ApoA～Ⅰ的重组质粒;将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,用异丙基硫代～β～D～半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST～ApoA～Ⅰ包涵体蛋白,通过蛋白复性和纯化后免疫小鼠得到多克隆抗体,并用ELISA法检查其效价。结果经PCR扩增出的ApoA～Ⅰ基因片段(746bp)与理论值大小基本一致。SDS～PAGE(十二烷基磺酸钠～聚丙烯凝胶电泳)以及West-ern blotting(蛋白印迹分析)验证纯化后的蛋白质分子量与质谱分析数据相符。免疫小鼠所得的免疫血清通过ELISA显示其抗体效价也具有高度特异性。结论成功地在大肠埃希菌中诱导表达出了ApoA～Ⅰ,蛋白质通过纯化免疫小鼠,得到了特异性的多克隆抗体。     

内皮活化相关新基因EOLA1的亚细胞定位及组织表达

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因的亚细胞定位和组织表达特性,为对其进行进一步的功能研究打下基础。方法构建EOLA1-EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达质粒,转染内皮细胞后瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1蛋白的亚细胞定位;通过人多组织Northern杂交研究EOLA1基因的组织表达。结果EOLA1蛋白在正常人各组织中呈选择性表达,在人的心脏、骨骼肌、肾脏、肝脏和胎盘组织中有较强的表达,在结肠、脾脏和小肠中有较弱的表达,而在脑、胸腺、肺和外周白细胞中无表达;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆,少量表达于细胞核。结论EOLA1属胞内蛋白,可能在细胞内信号转导中起着作用。     

人分化相关基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位研究

目的 :研究人源分化相关新基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位。方法 :采用电子拼接和PCR扩增技术 ,从人 2 2周孕龄胎肝cDNA文库中获得与人Ndr1基因同源的一段表达性序列标签 ,继而从成人脑cDNA文库分离出Ndr3的全长cDNA ;采用点杂交分析和多组织Northern杂交分析方法 ,确定其组织表达谱 ;将其亚克隆入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP_N1,用脂质体介导法转染COS_7细胞 ,确定其亚细胞定位。结果与结论 :Ndr3的全长cDNA为 2 879bp ,其开放阅读框 (ORF)编码 375个氨基酸 ,染色体定位为 2 0q12_11.2 3。Northern杂交和点杂交分析显示 ,NDR3在脑组织和睾丸中高表达 ,在肾、心肌和前列腺中有一定量的表达 ,在胚胎组织的表达较低 ,在 8种人肿瘤细胞中的表达极低。与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果显示 ,该蛋白定位于核外胞浆内     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

PGEFP-C1/N载体的构建及其在转染细胞中的初步定位

目的观察SARS冠状病毒（SAR-CoV）N蛋白的亚细胞定位。方法将SARS-CoV N基因片段克隆人融合绿色荧光蛋白载体（PGEFP-C1）中。采用瞬时转染技术,在A549、VeroE6细胞株中利用荧光显微镜观察GPT-N蛋白的亚细胞定位,Westem blot鉴定N蛋白的表达。结果成功构建了PGEFP-C1／N表达载体,在A549、VeroE6细胞中观察到N蛋白定位于细胞胞浆中,Western blot证实了N蛋白表达。结论SARS-CoV N蛋白在真核细胞中定位于细胞胞质中。     

Transcellular transport of 4-iodo-L-meta-tyrosine via system L across monolayers of kidney epithelial cell line LLC-PK1

The substance 4-[(125)I]iodo-L-meta-tyrosin (4-[(125)I]mTyr) is a radioiodinated amino acid that exhibits high in vivo stability and rapid renal elimination in vivo. We investigated transport of 4-[(125)I]mTyr in LLC-PK(1) (porcine kidney epithelial cell line) monolayers grown on collagen-coated, micro-porous membrane filters. We found that 4-[(125)I]mTyr transport in LLC-PK(1) cells was carrier-mediated and sodium-independent, and that 4-[(125)I]mTyr transport was similar to that of L-Tyr and 3-iodo-alpha-methyl-L-tyrosine. The results of the inhibition experiments suggest that 4-[(125)I]mTyr transport is predominantly mediated by a L-type amino acid transporter 1-like porcine homologue (a component of system L) in both basolateral and apical membrane.     

感觉神经元特异性受体rMrgE基因的克隆与表达

目的 克隆感觉神经元特异性受体rMrgE基因并于HEK293细胞中表达.方法 利用聚合酶链式反应技术,从大鼠背根神经节总RNA中扩增出目的基因rMrgE,克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisB中,构建真核表达rMrgE载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株.采用RT-PCR、免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定.结果 与结论含有rMrgE基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上.本研究为进一步探究rMrgE受体的功能奠定了基础.     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

H5N1型流感病毒M1蛋白的基因克隆与表达

目的：克隆、表达A型H5N1流感病毒基质蛋白M1,为研制新的流感快速检测方法奠定基础。方法：应用PCR方法扩增M1的全基因序列,克隆至PET32a载体上,经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21（DE23）,经IPTG诱导表达M1蛋白后,对其表达产物进行SDS-Page和Western Bloting分析。结果：SDS-Page电泳显示M1蛋白在BL21（DE23）大肠杆菌中成功表达,Western Bloting分析显示表达产物可以与M1多克隆抗体发生特异性反应。结论：成功克隆和表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,为进一步制备高滴度单克隆抗体、研制新的流感检测方法奠定了基础。