Smad3基因siRNA表达载体的构建及沉默效应

背景：研究提示抑制Smad3可望抑制纤维增生和胶原的大量产生。 目的：构建针对Smad3基因的siRNA表达载体,观察RNA干扰对增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用。 方法：根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染增生性瘢痕成纤维细胞,荧光定量PCR和Western blot方法检测Smad3基因的表达情况。 结果与结论：测序分析结果显示：克隆入pRNAT-U6载体的针对Smad3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段插入正确;荧光定量PCR和Western blot检测显示：转染的增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因的表达水平明显降低,尤以AGA CAG ACT GTG ACC AGT A(1156)为靶序列的siRNA沉默作用最强,抑制效率于转染后48 h可达45%。证实实验构建的沉默增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功。     

siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选

目的：构建并鉴定巨噬细胞移动抑制因子（MIF）特异性siRNA重组逆转录病毒载体，将其导入PHOENIX细胞中，筛选出分泌MIF-siRNA病毒的包装细胞，其分泌的病毒可以抑制MIF蛋白的表达，并初步了解稳定沉默MIF细胞株的特性。方法:体外合成含针对MIF特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆转录病毒载体，构建的载体通过酶切、测序鉴定后，采用脂质体介导转染包装病毒细胞株PHOENIX，收获病毒上清；将其感染HeLa细胞株，经过嘌呤霉素筛选得到抑制MIF表达的HeLa细胞株。Western blotting鉴定MIF表达的抑制效果并通过迁移实验、软琼脂糖克隆形成实验比较HeLa-pSuper-MIF和HeLa-pSuper-mock之间的特性。结果:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF，转染包装病毒细胞株PHOENIX，病毒上清感染HeLa细胞，抑制了HeLa细胞内源性MIF蛋白的表达。沉默MIF蛋白后导致HeLa细胞迁移能力下降，不依赖支持物生长的特性减弱和黏附能力下降，同时稳定表达沉默MIF蛋白的细胞株生长周期停留在G0/G1期与对照组相比凋亡减少。结论:构建了重组逆转录病毒载体pSuper-MIF，转染包装细胞所产生的病毒上清，能够抑制HeLa细胞内的MIF蛋白表达，表明MIF对HeLa细胞的迁移和不依赖支持物生长能力有重要作用。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的 构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率.方法 合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSilencer载体,构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体.将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平.结果 酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT-PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43.6 %、47.7 %和81.6 %,它们的干扰效果被Western印迹所证实.结论 干扰率为81.6 %的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,它可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究.     

Cyr61基因siRNA表达载体的构建及沉默作用研究

目的:构建Cyr61靶向siRNA重组表达载体,为探讨抑制Cyr61基因表达对机械通气所致肺损伤的研究奠定基础。方法:根据GenBank数据库提供的Cyr61基因核苷酸序列,选择设计3条能转录siRNA的DNA序列,命名Cyr61-1 siRNA,Cyr61-2 siRNA,Cyr61-3 siRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil1.1载体,转化扩增后进行序列测定。4种重组表达载体转染肺癌A549细胞,逆转录RT-PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测Cyr61的表达。结果:经酶切鉴定和测序结果证实Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为60.54%和52.97%。结论:Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功并能显著抑制Cyr61基因的表达。     

DNMT1 siRNA 稳定表达载体的构建及其沉默效率的评价

目的构建能在肝癌细胞系SMMC-7721中稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体。方法合成特异性干扰DNMT1的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分子，并与pSUPER—GFP载体连接。脂质体转染SMMC-7721细胞，并以G418筛选稳定表达细胞系。应用逆转录-聚合酶链反应和Western印迹方法对细胞系中DNMT1的RNA表达水平和蛋白表达水平进行了分析。应用甲基化聚合酶链反应方法分析该细胞系中甲基化的基因E-钙粘着蛋白的甲基化状态。结果转染DNMT1沉默载体的SMMC-7721细胞中DNMT1的mRNA表达量为对照载体pSUPER转染SMMC-7721细胞的43％，而前者中DNMT1蛋白表达水平小于后者的10％。DNMT1的siRNA沉默效率大于90％，所构建的DNMT1的siRNA有较高的沉默效率。DNMT1的表达抑制使E-钙粘着蛋白基因启动子区出现去甲基化。结论成功构建了能稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体，但目的基因沉默后其RNA表达水平与蛋白质表达水平表现不一致，评价siRNA干扰作用时应以目的基因相应蛋白质的表达水平为准。     

针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其沉寂效应检测

目的：设计并构建针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达载体，观察其对转染细胞中的caspase-8的抑制作用。方法：化学合成用于产生针对caspase-8的发夹状的RNA的寡核苷酸，将合成的寡核苷酸链退火形成双链，连接入经Hind Ⅲ和Bgl II双酶切后的pSUPER真核表达载体。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞，RT—PCR、间接免疫荧光检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果。结果：构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER—C1和pSU—PER—C2，并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase-8基因的干涉作用，而且pSUPER—C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER—C2。结论：成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体，转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达。     

小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究

目的研究siRNA表达载体在体外培养细胞中对目的基因的干扰作用,建立利用RNA干扰技术研究基因功能的平台。方法构建针对β-actin基因的表达siRNA载体,转染HeLa细胞,然后在mRNA水平、蛋白水平和细胞形态水平评价siRNA表达载体对β-actin基因表达的抑制作用。结果siRNA表达载体可以有效的抑制体外培养细胞β-actin基因的表达,使β-actin基因的mRNA和蛋白表达量显著下降,细胞形态发生显著变化。结论siRNA表达载体可以在体外培养细胞中有效的沉默β-actin基因,为研究基因功能提供了一个快速、有效的系统。     

抗mdr1 RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建抗mdr1 RNA干扰真核表达栽体。方法：根据Reynolds的设计原则．针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1栽体中．转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果：用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3均符合设计要求,测序证实序列完全正确。结论：通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3插入位点正确,与设计序列一致．预期可用于逆转mdr1所致耐药。     

GAP- 43干扰RNA表达载体的构建与鉴定

目的：构建GAP-43小干扰RNA（SiRNA）的表达载体并在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12中验证其抑制效果。方法：利用设计软件根据GAP-43 mRNA序列没计特异性SiRNA插入序列，体外合成该序列后将其定向克隆入真核表达载体pRNAT HL1／Neo。以Lipofectamine^TM2000试剂转染GAP-43-SiRNA表达载体至PC12细胞中，以NGF诱导PCI2细胞GAP-43的表达，以免疫组化方法鉴定GAP-43-SiRNA对GAP．43表达的抑制效果。结果：DNA测序证实合成的并被克隆入真核表达载体pRNAT HL1／Neo的SiRNA插入序列完全正确，GAP-43-SiRNA表达载体转染PC12细胞后可特异性抑制NGF诱导的PC12细胞的GAP-43的表达。结论：GAP-43-SiRNA表达载体构建成功，为后期研究GAP-43在少突胶质细胞前体上表达的意义奠定了基础。     

ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化转录因子2(ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2。脂质体介导质粒转染HepG2细胞。Westernblot法检测ATF-2蛋白表达;MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误;Westernblot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低;ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生。结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

肿瘤干细胞相关标记物CD44及CD24在乳腺癌中的表达及其意义

目的探讨肿瘤干细胞相关标记物CD44及CD24在乳腺癌组织中的表达特点、CD44+/CD24-细胞与HER-2、ER、PR、CK5/6表达的相互关系及其与临床病理因素的关系。方法采用免疫组化SP单染及双染法检测42例乳腺导管原位癌及126例乳腺浸润性导管癌组织中CD44及CD24的表达情况,检测126例乳腺浸润性导管癌组织中HER-2、ER、PR、CK5/6表达状况以进行免疫分型。结果 (1)CD44阳性定位于癌细胞膜。在浸润癌中阳性率为56.3%,在导管原位癌中阳性率为85.7%。两者差异有显著性意义(P<0.05)。在不同分化程度的乳腺浸润性癌中,CD44阳性率分别为69.2%、58.1%及44.7%,差异有显著性意义(P<0.05)。(2)CD24阳性表达于非癌性乳腺组织中小管的腔缘;在癌组织中除腔缘阳性外,可出现膜质阳性。在浸润癌中阳性率为32.5%,在导管原位癌中阳性率为64.3%。两者差异有显著性意义(P<0.05)。(3)126例浸润性导管癌中CD44+/CD24-者65例,占51.6%;CD44+/CD24-阳性细胞在Luminal A型为47.5%、Luminal B型为42.9%、HER-...     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

靶向CD4基因的microRNA表达载体构建及其功能研究

目的 用分子克隆方法构建靶基因为CD4的microRNA的GFP报告载体,并观察其对MT4细胞CD4分子表达的影响.方法 在microRNA在线预测软件中寻找靶基因为CD4的microRNA.设计hsa-mir-181a基因引物,PCR后将产物与T载体连接,双酶切后与pEGFP-N1载体连接.用菌液PCR及测序鉴定正确连接入pEGFP-N1载体.测序正确后电转染MT4细胞系.用荧光定量PCR检测microRNA表达,流式分析检测CD4分子表达.结果 hsa-mir-181a为靶基因为CD4的microRNA.所构建载体测序结果证明连接产物正确.转染细胞后建靶基因为CD4的microRNA稳定表达,并能够使MT4细胞CD4表达下调.结论 表达靶基因为CD4的microRNA的GFP报告基因表达载体构建成功,并且能够抑制CD4分子的表达.本研究为microRNA成为潜在的抗HIV基因治疗工具提供了体外实验的依据.     

CD24分子的免疫学研究进展

人CD24、鼠CD24a或热稳定抗原是一种重要的糖基磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白（GPI）,该蛋白可作为判断多种细胞（如T细胞、B细胞等）成熟与否的标志,参与调节机体的免疫应答,与系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等自身免疫性疾病以及肿瘤疾病密切相关,因此引起人们广泛的关注.新近研究发现：CD24可通过CD24-Siglec10/G信号通路能够抑制免疫反应,保护宿主免遭由于细胞死亡所引起的致死反应.     

Dynamic regulation of CD24 expression and release of CD24‐containing microvesicles in immature B cells in response to CD24 engagement

The glycophosphatidylinositol‐anchored cell surface receptor CD24 (also called heat‐stable antigen) promotes the apoptosis of progenitor and precursor B‐lymphocytes. However, the immediate proximal events that occur after engagement of CD24 in B cells are not precisely understood. Using a bioinformatics analysis of mouse (Mus musculus) gene expression data from the Immunological Genome Project, we found that known vesicle trafficking and cellular organization genes have similar expression patterns to CD24 during B‐cell development in the bone marrow. We therefore hypothesized that CD24 regulates vesicle trafficking. We first validated that antibody‐mediated engagement of CD24 induces apoptosis in the mouse WEHI‐231 cell line and mouse primary bone marrow‐derived B cells. We next found that CD24 surface protein expression is rapidly and dynamically regulated in both WEHI‐231 cells and primary immature B cells in response to engagement of CD24. The change in surface expression was not mediated by classical endocytosis or exocytosis. However, we found that CD24‐bearing plasma membrane‐derived extracellular microvesicles were released in response to CD24 engagement. Furthermore, in response to CD24 engagement we observed a clear exchange of CD24 between different populations of B cells. Hence, we show that engagement of CD24 in immature B cells results in a dynamic regulation of surface CD24 protein and a redistribution of CD24 within the population.     

不同类型乳腺组织中CD44~+/CD24~-细胞的数量与分布

目的检测CD44+/CD24-细胞在乳腺正常组织及良恶性肿瘤中的数量与分布特点,探讨其在乳腺癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SP双染法,检测了30例乳腺正常组织(normal tissue,NT),30例乳腺纤维腺瘤(fibroadenoma,FA),60例乳腺浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)中的CD44及CD24的共表达情况。结果在乳腺NT及FA中,可见CD44+/CD24+,CD44+/CD24-,CD44-/CD24-3种表型,而在IDC中,除上述3种表型外,尚可见CD44-/CD24+表型。从NT,FA到IDC,CD44+/CD24-细胞的阴性率(-,阳性率1%)依次降低(40.0%→36.7%→35.0%);而强阳性率(,阳性率60%)依次升高(0.0→6.7%→21.7%)。结论 CD44+/CD24-可能作为一种阶段性祖细胞标记,参与了正常乳腺的分化及乳腺肿瘤的发展过程。     

CD24 expression has a prognostic impact in breast carcinoma

We investigated the prognostic significance of BAG-1 and CD24 in invasive breast carcinomas. Seventy cases of invasive breast carcinoma were studied immunocytochemically for the expression of BAG-1 and CD24. The results were correlated with several prognostic parameters, including 5-year survival. Univariate analysis showed a significant correlation of BAG-1 and CD24 overall positive staining with several adverse prognostic parameters, such as increased stage (p<0.0001), tumor grade 3 (p=0.016 and p=0.02, respectively), positive lymph nodes (p<0.0001), and increased tumor size (p<0.0001). Similar results were found for BAG-1 nuclear staining, as well as for positive cytoplasmic CD24 expression. Both of our markers studied had a significant, negative effect on survival. Multivariate analysis further revealed an independent prognostic impact for CD24 overall staining. The results of our study showed that overall cytoplasmic and especially nuclear BAG-1 expression, as well as overall and cytoplasmic CD24 expression, correlates with adverse prognostic parameters. An independent prognostic value for overall CD24 staining was also demonstrated.     

大鼠CD80基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠CD80基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠NRK和IEC6细胞上鉴定其沉默效率.方法:将筛选获得的大鼠CD80基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与pGCSIL-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠NRK细胞、IEC6细胞和大鼠DC细胞(树突状细胞,Dentritic cell),分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到4×10~8 TU/ml.shRNA慢病毒颗粒感染NRK和IEC6细胞后CD80基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了66.9%和63.5%.结论:成功构建了大鼠CD80基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因.     

CD147 shRNA质粒表达载体的构建及鉴定

目的构建表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147,EMMPRIN)基因序列特异性的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体。方法根据CD147基因序列及shRNA设计原则,化学合成两段编码短发夹RNA寡核苷酸序列,将其定向克隆到pGenesil-1.1质粒表达载体中,重组构建RNAi质粒,并对重组质粒进行酶切分析。结果限制性内切酶Eco31I和SacI酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1.1质粒载体中,酶切结果证实插入片段与设计序列完全一致,成功构建针对基因CD147的shRNA质粒表达载体。结论成功构建人CD147基因重组载体,为研究CD147蛋白的生物学效应和骨肉瘤的治疗提供实验依据。