膝关节滑膜间质干细胞分离、培养及其多向分化潜能特性的研究

目的 探讨晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间质干细胞(synovium-derived mesenchymalstem cells,SMSCs)体外分离、培养的可行性及其在体外向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化的特性.方法 取膝关节滑膜组织,胶原酶消化获得有核细胞.挑选单细胞克隆,筛选获得SMSCs.流式细胞技术检测细胞表面特异性抗原标志.培养至第三代,分别向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导分化.油红O染色鉴定向脂肪细胞分化;碱性磷酸酶染色、茜素红染色鉴定向成骨细胞分化;甲苯胺蓝染色鉴定向软骨细胞分化.RT-PCR检测脂肪细胞、成骨细胞标志基因.Ⅱ型胶原免疫组化染色检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达.结果 原代SMSCs体外培养呈葵花样细胞集落,传代后可见圆形巨噬样细胞和纺锤形成纤维样细胞,融合后呈成纤维细胞样生长.CD44、CD90呈阳性,CD34、CD71和CD45呈阴性.向脂肪细胞诱导21d,油红O染色阳性;RT-PCR检测有脂蛋白酶、乙二腈及PPARγ2表达;向成骨细胞诱导7、28 d,ALP,茜素红染色阳性,有ALP、Osteopontin及Osteocalcin表达;向软骨细胞诱导21d,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.结论 晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织可以分离、培养获得SMSCs. SMSCs具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能.     

损伤性和骨关节炎性滑膜细胞成骨作用的体外研究

分离，培养取自关节内损伤性和晚期骨关节炎性滑膜细胞，逐日在倒置显微镜下观察细胞生长状况，发现有树突样细胞，巨噬细胞样细胞和成纤维细胞样细胞三种不同类型的细胞贴壁生长。其中，ＦＣＳ增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，在细胞表面有分泌物形成不透光的结节，经四环素标记，ＡＲＳ及甲苯胺蓝以后，显示结节为新生骨组织。     

类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞体外增殖活性的研究

目的研究类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的体外增殖活性。方法收集行关节腔镜术或关节置换术的RA、骨关节炎(OA)、关节创伤患者的膝关节滑膜组织标本各3例,应用酶消化法进行FLS的分离培养,采用MTT法比较三种来源细胞的体外增殖活性。结果 RA-FLS在体外培养第3、4、5天时OD值较OA、关节创伤来源者增高(P值均小于0.05)。结论 RA-FLS细胞增殖程度较OA、关节创伤来源者增高。     

骨关节炎滑液中肿瘤坏死因子α活性检测及滑膜组织超微…

目的进一步探讨滑膜参与骨关节炎病理进程的机理。方法 采用Ｌ９２９细胞毒活性法检测了２４例急、慢性关节内损伤及晚期骨关节炎（ＯＡ）患者关节滑兴中肿瘤坏死因子生物活性，并用光镜和电镜观察比较三者滑膜组织间的形态学差异。结果 ＯＡ滑液中所含ＴＮＦ－α水平较高；ＯＡ滑膜细胞性内膜，细胞增殖与脱落同时发生，内膜下层呈现明显的纤维增生性高、滑膜增厚；Ｂ型和Ａ型滑膜细胞的超微结构变化分别呈现旺盛的蛋白分泌相和活     

肝硬化组织来源纤维母细胞的分离、培养及鉴定

目的 建立肝硬化组织来源纤维母细胞的分离、培养方法,探讨体外培养纤维母细胞的生物学特性.方法 采用组织块贴壁法等细胞培养技术分离培养肝硬化组织来源纤维母细胞,通过显微摄像、细胞计数研究其形态学变化及生长特性,用细胞免疫荧光及Western blotting等方法检测细胞成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)、波形蛋白的表达情况,对所得细胞进行分析鉴定.结果 2h内组织块贴壁良好,1周左右可见组织块周边有单个的胞体较大的肝细胞样细胞游出,2周左右可见梭形或三角形纤维母细胞游出.传代后细胞呈均一的成纤维细胞样,生长潜伏期短,纤维母细胞生长性状稳定,3、4、5代细胞生长曲线基本一致.细胞免疫荧光结果表明,细胞表达FSP1、波形蛋白呈阳性,阳性率分别为(90.6±1.0)％和(91.2±4.1)％.结论 采用组织块贴壁培养法能获得纯度较高的纤维母细胞,此方法简便、高效、稳定,培养的细胞具有良好的细胞生物学特性.     

晚期膝骨关节炎滑膜MRI厚度与疼痛及功能评分相关性

目的探讨晚期膝骨关节炎(OA)患者中滑膜厚度分级与膝关节疼痛及功能评分间的关系,从而明确滑膜炎的MRI厚度分级是否可用于作为膝关节置换的适应证标准。 方法选择晚期膝OA患者31例,接受：①MRI对膝内、外侧间沟和内、外侧髌上囊4个观察部位滑膜的厚度进行分级测定,根据厚度可将滑膜炎程度分为0～3级;②全膝关节置换(TKA)术前的膝关节疼痛评分(VAS)、西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)。采用Pearson线性相关或Spearman秩相关分析滑膜厚度分级与WOMAC以及VAS之间的相关性。 结果晚期膝OA 4个观察部位滑膜的MRI厚度分级无显著性差异,不同部位滑膜厚度与疼痛评分不具有相关性,不同部位滑膜厚度与功能评分同样不具有相关性。晚期膝OA滑膜炎的MRI厚度分级与膝关节功能及疼痛评分无相关性(rs＝0.17,P >0.05;rs＝0.32,P>0.05)。 结论晚期膝OA滑膜炎的严重程度与主观评分无相关性,滑膜MRI厚度分级不能作为关节置换手术指征的判断标准,不能用滑膜炎严重程度决定是否需要行膝关节置换手术,也不能用主观评分来评估OA的病情发展、评价治疗。     

补肾活血方对大鼠膝骨关节炎滑膜细胞β-catenin、MMP-7的影响

目的:观察Wnt经典信号通路中β-catenin在大鼠膝骨关节炎滑膜细胞胞核中的表达,并观察补肾活血方对大鼠膝骨关节炎(OA)膝关节滑膜细胞胞核中β-catenin和滑膜细胞MMP-7的调控作用。方法:采用Hulth法建立大鼠膝关节骨性关节炎模型,胶原酶消化法原代培养正常滑膜细胞与OA滑膜细胞。将所培养滑膜细胞分为正常组、OA模型组和补肾活血方组,用补肾活血方含药血清作用OA滑膜细胞48h后,采用Western Blot法检测滑膜细胞中MMP-7、胞核β-catenin的蛋白表达变化;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测滑膜细胞上清液中MMP-7表达变化。结果:OA滑膜细胞培养成功,WesternBlot结果显示OA滑膜细胞中MMP-7、胞核β-catenin表达均明显高于正常滑膜细胞,补肾活血方对OA滑膜细胞中MMP-7、胞核β-catenin表达有明显下调作用;ELISA结果显示OA滑膜细胞上清液中MMP-7表达明显高于正常滑膜细胞上清液,补肾活血方对其有明显下调作用。结论:①β-catenin在OA滑膜细胞胞核中表达升高,表明Wnt经典信号通路在大鼠膝骨关节炎滑膜中是激活的。②MMP-7在OA滑膜细胞和上清液中表达升高,印证了MMP-7是Wnt/β-catenin信号通路下游基因。③滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的活化、MMP-7的表达升高可能是导致关节软骨降解,促进骨性关节炎形成的机制之一。④补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用是其抑制软骨降解,促进软骨修复,治疗骨性关节炎的可能机制之一。     

晚期膝骨关节炎的滑膜炎MRI厚度分级与滑膜病理相关性

目的滑膜炎在膝骨关节炎(OA)中常见,晚期膝OA患者MRI测定的滑膜厚度分级与滑膜病理评分间的关系,尚不明确。本研究目的是探讨晚期膝OA患者中二者间关系,从而明确滑膜炎的MRI厚度分级和病理评分,是否可应用于OA的治疗效果评价。 方法本次研究选择符合晚期膝OA诊断标准Ahlback分级法中的4级和5级并排除其他疾病的住院手术患者31例,均接受：①MRI对内、外侧间沟和内、外侧髌上囊4个区域滑膜的厚度进行分级测定,根据厚度将滑膜炎程度分为0～3级;②观察部位滑膜的取样进行苏木素－伊红(HE)染色、病理学评分;③采用Pearson线性相关或Spearman秩相关分析滑膜厚度分级、病理评分间的相关性,以相关系数(rs)评价。 结果晚期膝OA 4个观察部位滑膜的MRI厚度分级差异无统计学意义(F＝0.39,P>0.05);4个观察部位滑膜的病理评分和病理指标差异无统计学意义(F ＝2.146,P >0.05);晚期膝OA滑膜炎的MRI厚度分级与病理评分具有正相关(rs ＝0.81、0.56、0.59和0.52,P <0.01);与病理学3项指标具有正相关(rs＝0.4、0.47、0.36,P <0.05)。 结论滑膜的MRI检查与滑膜病理具有较强相关性,因此滑膜MRI与病理检查可用于对滑膜炎敏感的OA治疗药物选择及晚期患者的治疗效果评价。     

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及巨自噬的表达水平

目的:探讨体外原代培养的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RA-FLS)中是否存在巨自噬现象以及在类风湿关节炎(RA)中的发病机制.方法:培养原代RA-FLS,以骨关节炎(OA)患者膝关节滑膜组织中培养的骨关节炎滑膜成纤维细胞(OA-FLS)作为对照组.采用MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞仪检测细胞凋亡;采用实时荧光定量聚...     

瘦素对于体外培养人类软骨细胞增殖的影响

目的 探讨重组人类瘦素对体外培养软骨细胞增殖活性的影响.方法 选用本院膝骨关节炎(OA)患者行关节置换及外伤致膝关节截肢患者术中取出OA软骨块和正常软骨块,种植于25 cm培养瓶中,采用组织贴块法分离培养软骨细胞,及时传代,选用第2代细胞,进行Ⅱ型胶原免疫组化签定后,以不同浓度的重组人类瘦素刺激培养的第2代软骨细胞,以CCK-8检测不同时段的细胞增殖活性,并比较光镜下细胞形态的变化.结果 Ⅱ型胶原免疫组化证明分离出的是软骨细胞,在不同浓度、不同时段和不同人群,重组人类瘦素刺激对于软骨细胞的增殖影响有统计学差异(P＜0.05),光镜下的细胞形态变小,出现丝状伪足.结论 瘦素可抑制体外培养的软骨细胞增殖,可能在OA的发病和进展中起重要作用.     

大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

目的：分离培养大鼠胰腺星状细胞,为体外研究胰腺纤维化提供细胞模型。方法：采用酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离胰腺星状细胞,通过倒置显微镜观察细胞形态,油红O染色和免疫细胞化学染色desmin,α-SMA进行细胞鉴定,并绘制传代后细胞生长曲线。结果：原代培养的大鼠胰腺星状细胞呈星形或梭形生长;原代胰腺星状细胞油红O染色胞浆均可见红色密集脂滴,直至传代后消失;原代胰腺星状细胞培养48 h后,desmin表达开始减弱,α-SMA表达开始增强;传代后desmin基本不表达,α-SMA阳性表达100%;传代后第3 d-5 d的胰腺星状细胞处于快速增殖阶段。结论：酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离培养大鼠胰腺星状细胞纯度高,重复性好,可以满足体外研究的需要。     

无血清无滋养层培养的人角质形成细胞生物学特征

目的建立一种人角质形成细胞(HKC)无血清、无滋养层培养方法,观察用该方法培养的HKC的生物学特征。方法取5~10岁儿童及20~30岁成人(各5例)环切术后包皮,分为儿童组和成人组。采用二步消化法分离人包皮标本,检测其原代HKC获得数;用KC无血清培养液培养,光镜下观察HKC形态;荧光显微镜下鉴定HKC,并观察其生长速度;用噻唑蓝(MTT)法检测HKC生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果儿童组原代HKC获得数为(1.780±0.010)×106/cm2,较成人组(1.490±0.120)×106/cm2高(P<0.01).HKC形态学观察见刚分离的HKC为透亮的小圆形细胞,台盼蓝染色约94%细胞拒染,多次传代的HKC贴壁速度、贴壁率及透亮度明显增加;荧光显微镜下见细胞胞浆呈强黄绿色荧光,细胞核未着色,证明其为KC.儿童组HKC传代次数为(11.0±1.2)次,较成人组(9.2±0.8)次高(P<0.05).HKC生长曲线无明显潜伏期,细胞增殖速度快,扩增倍数高。G1期细胞为36.15%,G2期细胞为25.17%,S期细胞为38.68%,细胞增殖指数为63.85%。结论无血清、无滋养层培养,是一种较理想的培养HKC的方法。     

改良人输卵管上皮细胞培养法及电镜观察

目的简化人输卵管上皮细胞分离及培养方法,提高上皮细胞纯度。方法收集19例子宫肌瘤或子宫腺肌病等手术切除的输卵管进行上皮细胞体外培养。改良酶消化法和刮取法收集人输卵管上皮细胞,采用溶血法及差速贴壁法纯化上皮细胞。观察上皮细胞生长及特征,免疫组织化学检测其纯度,扫描和透射电镜评价细胞超微结构。结果改良法培养的人输卵管上皮细胞占细胞总数>90%;电镜显示原代培养的细胞具有微绒毛及纤毛等上皮细胞特征,部分纤毛细胞的胞膜游离面有球状突起,细胞内可见含电子致密物或暗物质的囊泡。结论本改良法方法简单,培养的人输卵管上皮细胞纯度高,电镜结果有利于输卵管上皮细胞分化的研究。     

人股骨头骨微血管内皮细胞的分离培养方法

目的:探讨培养人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法.方法:2013年10月至2014年1月15例行髋关节置换患者切除的内部无病变的股骨头,男2例,女13例;年龄38～92岁,平均71.2岁.无菌条件下将股骨头内松质骨咬成碎骨粒,放入培养基.采用酶消化法,密度梯度离心法分离细胞;差速贴壁法,选择性培养基法纯化细胞.倒置显微镜观察细胞特点,并采用vWF、CD31免疫荧光进行细胞鉴定.结果:原代培养24 h后倒置显微镜下观察细胞数量与患者年龄呈正相关,年龄越大细胞越少.培养4～5 d细胞呈短梭形、多角形或“鹩卵石”状.培养7～10d细胞生长密集,细胞融合呈漩涡状,接触抑制明显.vWF、CD31免疫荧光检测阳性率100％,表明细胞为骨微血管内皮细胞.结论:人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法简单、稳定、有效、可重复性好,可以获得纯度较高的股骨头骨微血管内皮细胞.     

人成骨细胞与外周血单核细胞共同培养诱导破骨细胞样细胞

目的 探讨人外周血单核细胞与原代人成骨细胞共同培养体外转化为破骨细胞样细胞的条件,并观察其体外生长,功能情况。方法 分别分离培养人成骨细胞,外周血单核细胞,并在含1,25（OH）2D3（10^-7mol/L）,地塞米松（10^-8mol/L)及巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）（25ng/ml)的条件液中共同培养,用相差显微,抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）观察破骨细胞样细胞生长情况,应用扫描电镜（SEM）观察骨片隐窝以反映其功能。结果 共同培养中的单核细胞逐渐融合;TRAP染色阳性多核细胞在第7天明显增多;骨片隐窝呈现多种形态。结论 人原代成骨细胞与人外周血单核细胞共同培养可以诱导出破骨细胞样细胞,但应该选择分化程度较低的细胞以及控制接种密度。     

大鼠小肠Cajal间质细胞的体外分离、培养及鉴定

目的：探讨大鼠小肠Cajal间质细胞（ICC）的原代分离、培养及鉴定方法。 方法：出生后5~10 d的SD乳大鼠,颈椎脱臼处死。无菌条件下取出小肠,在解剖显微镜下剥去小肠系膜、肠黏膜和黏膜下层,将小肠平滑肌层组织剪成小块后接种于含有干细胞因子的DMEM培养基中进行培养。倒置显微镜下连续观察组织块周围细胞的游出情况及细胞的形态,用酪氨酸蛋白激酶受体c-kit特异性抗体免疫荧光染色鉴定细胞类型。 结果：培养1周后,倒置显微镜下可见组织块周围长出细胞,呈梭形、三角形,有多个短突起;随着培养时间的延长,突起细长化并彼此相互连接形成网络。该类细胞c-kit抗体免疫荧光染色呈阳性。 结论：该研究成功建立了一套由大鼠小肠平滑肌组织块原代培养ICC的方法,为ICC的生物学特性及其与胃肠道动力障碍性疾病关系的研究奠定了基础。     

人增生肝外胆管上皮细胞的原代培养及组织学特点

目的 建立人增生胆管上皮细胞(BECs)的原代培养.方法 通过胶原酶消化、机械分离对不同原因引起的扩张人肝外胆管上皮细胞进行分离纯化,建立原代培养;利用免疫细胞化学和免疫荧光染色,对培养的胆管上皮细胞表达CK-19、E-cadherin、Vimentin、α-SMA和S100A4进行特性鉴定.结果 BECs的贴壁成活率高,原代培养细胞生长速度快;免疫细胞化学和免疫荧光染色显示,上皮细胞特异性标志CK-19和E-cadherin表达阳性,间质细胞标志Vimentin表达弱阳性或阴性,α-SMA表达阴性,但上皮间质表型转变标志蛋白S100A4呈阳性表达.结论 本方法经济、简便、易行,在体外成功分离培养增生的人肝外胆管上皮细胞,获得了高纯度的BECs(>98%);发现增生的胆管上皮细胞发生了上皮间质表型转变,可能是参与胆汁性肝纤维化的机制之一.     

人胚胎成纤维细胞饲养层支持人精原干细胞的生长

目的:探讨人精原干细胞分离、纯化及以人胚胎成纤维细胞为饲养层培养的方法和条件。方法:利用两步酶法和Percoll不连续密度离心法分离、纯化人精原干细胞,在人胚胎成纤维细胞饲养层上培养;用免疫组织化学方法检测精原干细胞表面标志SSEA-1和OCT4;检测精原干细胞克隆碱性磷酸酶活性;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测精原干细胞相关基因的表达。结果:精原干细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上可以存活并增殖形成集落。集落未分化标志检测显示SSEA-l、OCT4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,并表达精原干细胞相关基因。结论:人胚胎成纤维细胞饲养层可以支持人精原干细胞的生长。     

分离培养汗腺导管部细胞的新方法

目的 探讨建立汗腺导管部细胞分离的新技术.方法 成人仞厚皮片和薄中厚皮片标本(n=10)剪碎后用Ⅱ型胶原酶消化12 h,吸取并转移汗腺导管到培养皿中贴壁培养.应用流式细胞仪、免疫组织化学染色和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以及蛋白印迹(Western Blot)分析检测培养细胞的汗腺特异标志CEA、CK8、CK18、CK19抗原表达,并用膜片钳技术检测培养细胞膜上阿米洛利(amiloride)敏感Na~+离子通道,用t检验比较分析两组间实验数据.结果 汗腺导管贴壁48 h后,围绕汗腺导管出现单层扁平的上皮细胞,生长2～4周融合成片.流式细胞学检查示原代培养汗腺导管细胞与原代培养汗腺细胞在癌胚抗原(CEA)阳性率[(90.26±1.12)%vs.(89.70±1.43)%]和细胞角蛋白8(CK8)阳性率[(94.41±1.84)%vs.(93.65±1.63)%]上,差异无统计学意义(P>0.05).形态学染色汗腺导管细胞抗CEA、CK8、CK18、CK19染色均为阳性.RT-PCR表明原代培养汗腺导管细胞表达CEA、CK8、CK18、CK19基因,Western Blot清晰显示CEA条带,CK8、CK18、CK19蛋白条带.膜片钳检测表明原代培养汗腺导管细胞膜上存在amiloride敏感Na~+离子通道.无血清表皮细胞EpiLife培养基在汗腺导管细胞生长过程中抑制成纤维细胞生长.结论 从仞厚皮片和中厚皮片分离培养汗腺导管部细胞的方法较传统的分离方法具有简便快速的优点,EpiLife培养基可抑制培养过程中成纤维细胞的生长,可以在体外建立最佳汗腺导管细胞模型.