弗氏志贺菌2aT32株asd基因缺失突变体的构建

目的：构建痢疾弗氏志贺菌２ａＴ３２的ａｓｄ基因全缺失突变体。方法；采用全菌Ｐ座痢疾弗氏２ａ Ｔ３２株染色体扩增了ａｓｄ基因及其上下游各约５００ｂｐ的染色体例 ＤＮＡ序列，并将其克隆至ｐＵＣ１８，测定其核苷酸序列，在体外用ｃｔｘＢ基因置换了ａｓｄ基因，然后将其克隆至自杀载体ｐＸＬ２７５。通过细菌酱和人同源重组，用ｃｔｘＢ基因完全取代痢疾弗氏２ａ Ｔ３２株染色体上的ａｓｄ基因。结果与结论：构建成ａｓｄ     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记（SILAC）技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

志贺菌菌痢疾分子流行病学研究进展

志贺氏菌属的主要毒力因子:侵袭基因、LPS基因和志贺氏毒素的编码基因已先后被克隆出来,一些预防痢疾的菌苗候选株正在进行临床试验和田间试验。质粒图谱、限制性酶切图谱、核酸分子杂交、PCR及多位点酶电泳等分子生物学技术已普遍应用于志贺氏菌属的分子流行病学研究,并取得了可喜的进展。作者回顾了近年来国内外有关志贺氏菌属的分子生物学及分子流行病学研究概况,并就此作一简要地概述。     

苍蝇携带志贺氏菌属的调查报告

近年来,广州市食物中毒屡有发生,1989～1992＄为29.0％（29八00）;城市居民点阳性卒为u.0％年共发生微生物性食物中毒62起,中毒2189人,分（6/50）。这一结果表明,不同地点环境卫生状况不别;’i食物中毒总起数的59.1％,总人数的78.5％。同,苍蝇携带志贺氏菌属阳性率有明显差别。因此,因志贺氏菌属引起的菌痢占相当数量。4年来第3搞好环境卫生,消灭苍蝇,是控制细菌性痢疾及其它季议发生食物中毒的次数和人数均占首位。苍蝇是传染病流行的重要措施。肠近传染病的重要传播媒介,1994年8～9月,我们用SPA协同凝集试验快速检测广州市不同地区225只…     

弗氏志贺菌2a GadB蛋白的功能研究

目的探究gadB基因的潜在功能及其对弗氏志贺菌2a 301株致病能力的影响。方法利用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株的gadB缺失突变株,随后进行基本的表型实验测评,并初步评价其毒力,最后制备突变株和野生株全菌蛋白样品,利用双向电泳技术比较二者在蛋白表达谱上的差异。结果成功获得gadB基因缺失株;生化实验发现缺失株不能利用甘油发酵;而豚鼠角膜实验发现突变株炎症反应稍轻于野生株;全菌蛋白表达谱中发现10个差异蛋白。结论利用双向电泳鉴定到一些可能与GadB有关的蛋白,为gadB潜在功能的研究提供了线索。     

自杀质粒同源重组方法构建弗氏志贺菌htrA可控表达菌株

目的：构建弗氏志贺菌HtrA蛋白的可控表达菌株。方法构建自杀质粒同源重组载体,利用重组方法在基因组htrA前插入阿拉伯糖启动子,同时构建并导入外源表达AraC蛋白的表达载体,实现对HtrA蛋白的可控表达;在此基础上,通过蛋白印迹实验,检测诱导前后全菌以及周质中HtrA蛋白的表达情况。结果测序结果表明,自杀质粒同源重组载体以及外源表达载体构建成功;蛋白印迹实验结果显示,对比阿拉伯糖诱导菌株,未诱导菌株中基本未检测到HtrA蛋白的表达。结论自杀质粒同源重组方式可在无阿拉伯糖时有效阻遏HtrA蛋白的表达;同时在诱导后,还可恢复HtrA蛋白的正常表达,有利于后续功能研究。     

弗氏2a志贺菌CobB和GtrⅡ蛋白水平及毒力相关性的初步研究

目的研究翻译后修饰基因cobB和gtrⅡ对志贺菌致病能力的影响。方法采用λ-Red重组系统构建福氏2a志贺菌2457T的cobB,gtrⅡ缺失突变株,进行初步的毒力评价,随后制备野生株,cobB,gtrⅡ缺失突变株的全菌蛋白样品,并进行双向电泳比较野生株和缺失株在蛋白表达谱上的差异。结果成功构建cobB、gtrⅡ基因的缺失突变株,豚鼠角膜实验发现cobB、gtrⅡ缺失株症状稍弱于野生株,但在全菌蛋白表达谱中野生株和突变株并无明显差异。结论双向电泳难以有效地呈现CobB和GtrⅡ的翻译后修饰能力。     

志贺氏菌的接触性溶血试验

本文研究了接触性溶血试验的最适条件,并应用于检测志贺氏菌的毒力.绵羊红细胞(SRBC)和福氏2a志贺氏菌(F2a)的合适浓度分别在2～6×10~9/ml和1～4×10~(10)/ml范围内;细菌在贺氏肉汤内振荡培养8～12h溶血能力最强.比较强毒肠道菌及其无毒突变株的溶血能力与毒力相符;除侵袭性大肠菌以外,志贺氏菌的溶血活性都依赖温度.实验结果表明,接触性溶血试验与志贺氏菌及EIEC大质粒编码的"侵袭相关蛋白"的表达具有相关性.该法具有简便行易、省时、结果较为稳定和客观等特点.可作为检测志贺氏菌毒力的方法之一.     

志贺氏菌芳香族氨基酸缺陷减毒株的构建

目的构建一种新型痢疾疫苗,使其较完整地保留保护性抗原,又不致丧失其侵袭力。方法用PCR技术从野生型福氏2a志贺氏菌2457T中克隆出aroA基因,在体外进行精确的缺失突变,并通过体内同源重组,构建成ΔaroA突变体RS426。结果这种突变体仍保持了侵袭能力和保护性O抗原的表达,但其毒力已明显降低,不能产生豚鼠角结膜炎,小鼠半数致死量明显提高。结论免疫保护试验显示,RS426可在小鼠中产生对福氏2a野生菌100％的保护作用。     

弗氏志贺菌2a 2457T株蛋白复合体BN/SDS-PAGE电泳方法的建立

目的建立分离弗氏志贺菌2a2457T株胞内可溶性复合物的BN/SDS-PAGE电泳方法 ,并优化分离条件。方法分别比较了不同配胶方式、配胶长度以及胶条平衡方法。结果成功建立了分离弗氏志贺菌2a2457T株胞内可溶性复合物的方法。结论本实验所建立及优化的方法 ,可以有效地分离蛋白复合体,为进一步研究志贺菌属蛋白复合体奠定了基础,并对以后的实验具有一定的参考价值。     

志贺菌的菌型分布与耐药性研究

目的：了解宝铁辖区近年来志贺菌的菌型分布与耐药性分析。方法：对分离的139株志贺菌进行生化鉴定、血清学分型和K irby-Bauer纸片扩散法（K-B）药物敏感性试验。结果：139株志贺菌中,福氏志贺菌73株占52.5%（包括福式X、Y变异株各1株,占总数的1.4%）,宋内氏志贺菌64株占46.0%,鲍氏菌2株占1.4%。志贺菌对多种常用抗菌药物呈高度耐药,且多为多重耐药,对第三代头孢菌素的耐药性最低,其次为氟奎诺酮类。福式志贺菌与宋内氏志贺菌对多种药物的耐药率差异有显着性。结论：宝铁辖区检出的志贺菌以福氏和宋内氏、志贺菌为主,志贺菌尤其是福氏志贺菌对某些抗生素的耐药性有上升的趋势。     

志贺氏菌激发的粘膜免疫与粘膜保护

将家兔分为三组,分别经口服、滴眼或皮下接种活福氏2a 志贺氏菌。用 BA-ELISA 技术测定血、唾液、泪和粪中 IgG、IgM 和 IgA 类特异抗体。结果表明:滴眼组兔血 IgG 抗体迅速上升,口服组兔血以 IgM 抗体增加幅度较大,并出现较早。两组动物的唾液、泪和粪中 IgG 和 IgA 抗体上升幅度大。粪抗体以口服组出现最早。皮下组血 IgM 增加明显,下降迅速。其他体液中,三类抗体都未见增加。各组动物于免疫后约90天,经眼攻击。局部免疫的两组动物呈现有保护作用,皮下组则无。以上结果证实了机体内共同粘膜免疫系统的存在,并提示唾液、泪和粪产生的对志贺氏菌的免疫应答可能反映动物肠道的免疫状态,评价口服疫苗和研究免疫机理。     

弗氏志贺菌2aphoNl基因功能的初步研究

目的：初步探讨phoN1基因在志贺菌属中的功能。方法使用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株phoN1缺失突变株,通过比较蛋白质组学方法研究突变株与野生株的蛋白表达谱差异,并利用豚鼠角膜炎模型、HeLa细胞竞争侵袭实验评价两者之间的毒力差异。结果成功构建了phoN1缺失突变株,蛋白质学研究发现, phoN1缺失对其他胞内蛋白无显著影响,豚鼠角膜实验和HeLa细胞竞争侵袭实验证实,phoN1缺失不影响志贺菌属的侵袭能力。结论 phoN1在体外生存、侵袭宿主细胞过程中未发挥显著作用,其功能有待进一步研究。     

志贺菌检测用抗原研究进展

志贺菌是细菌性痢疾的病原体,目前检测手段主要为常规生化法、免疫学及分子生物学方法,其中免疫学方法快速、便捷,实用性较强。本文综述了志贺菌免疫学检测用抗原的研究进展。     

口服福氏2a志贺氏菌T32菌苗株减毒基础分析

福氏2a志贺氏菌(下简称F2a)T32菌苗株,其质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳表明,具有志贺氏菌属共有的约120～140Mdal大小的质粒.DNA探针杂交试验证明,T32株与志贺氏菌属侵入有关的17kb或4.1kbDNA探针没有同源性.免疫印迹技术显示,T32株不表达侵袭性4种外膜蛋白(a,b,c和d).当将宋内氏志贺氏菌毒株I相大质粒诱动转移到T32株时,它又回复了侵入上皮细胞并引起豚鼠眼角膜结膜炎的能力.上述事实揭示,T32株的减毒基础在于140Mdal大质粒上与侵入有关的某些基因片段的缺失突变,而与毒力有关的染色体上的基因片段并未发生改变.     

福氏2a痢疾菌多糖蛋白结合抗原的制备和免疫原性观察

提取福氏２ａ痢疾菌脂多糖中的多糖抗原与白喉类毒素共价交联，能增强多糖抗原对家兔的免疫原性，抗多糖抗体与抗载体蛋白抗体的反应规律基本一致，有二次免疫应答。抗血清能与福氏各型痢疾菌的脂多糖反应，与其它各群痢疾菌无交叉反应，其针对的主要抗原决定簇为福氏多糖骨架。     

blaCTX-M-55介导的宋内志贺菌耐药机制研究

目的：研究 blaCTX-M-55介导的宋内志贺菌＃1083的耐药机制。方法双纸片协同扩散法验证＃1083是否为产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）菌株;PCR 方法鉴定其耐药基因;接合转移实验验证携带 ESBL 基因的质粒是否具有可转移性;VITEK 2仪器检测菌株对多种抗生素的 MIC 值;基因组测序鉴定介导耐药基因转移的移动元件;引物延伸实验鉴定耐药基因转录起始位点。结果＃1083为 blaCTX-M-55介导产 ESBL 的菌株,携带 blaCTX-M-55的耐药质粒可通过接合转移的方式进入受体菌 EC600,并使受体菌具有相应的耐药谱;介导 blaCTX-M-55转移的转座单元为 ISEcp1-blaCTX-M-55-Δorf477,且其上游的插入序列 ISEcp1为耐药基因提供强启动子区,促进耐药基因表达,且此表达为恒定表达,不受抗生素的诱导作用影响。结论质粒携带的 blaCTX-M-55为＃1083的主要耐药基因,插入序列 ISEcp1介导此基因的表达与传播。     

共表达肠毒素大肠杆菌定居因子CFA/Ⅰ、CS6与单独表达CFA/Ⅰ、CS6痢疾载体候选疫苗株的免疫原性比较

目的：评价同一菌株表达多种肠毒素大肠杆菌(ETEC)定居因子时的免疫效果，为构建多价疫苗提供依据。方法：以同等剂量分别口服免疫BALB／c小鼠，比较并评价共表达肠毒素大肠杆菌定居因子CFMI、CS6的减毒弗氏痢疾菌苗株FWL01(pZCF16)与单独表达CFA/Ⅰ的FWL/01(pZHY21)和表达CS6的FWL01(pZLG6)免疫效果。结果：免疫BALB／c小鼠全部产生了抗CFA/Ⅰ和(或)CS6的特异性血清抗体IgG和分泌性抗体sIgA。共表达CFMI、CS6的减毒弗氏痢疾菌苗株FWL01(pZCF16)免疫动物后，血清和黏膜抗体滴度与单独表达CFA/Ⅰ 的FWL01(pZHY21)和表达CS6的FWL01(pZLG6)的免疫效果相似。结论：共表达ETEC CFA／Ⅰ和CS6的减毒弗氏痢疾菌苗株FWL01(pZCF16)能够像单独表达相应抗原的菌苗株一样有效激发机体抗CFA/Ⅰ和CS6的体液及肠道黏膜免疫应答，为构建ETEC多价疫苗奠定了基础。