表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。     

胰腺癌HER—2／neu肿瘤基因表达与预后关系的探讨

用免疫组化方法和单克隆抗体ＣＢ１１对２１例胰腺导管癌和６例胰壶腹癌ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达进行了研究。发现：９１）正常胰腺导管和腺泡可呈弱阳性反应；（２）将中度和强阳性反应视为过表达，并见于２１例胰腺癌中的１０例和６例胰壶腹癌中的３例；（３）ＨＥＲ－２／ｎｅｕ过表达与胰腺导管中预后不良密切相关，过表达患者平均生存时间明显短于无过表达患者，Ｐ〈０．０１。     

胰腺癌k—ras基因突变及其与HER—2／neu表达的关系

采用ＣＲ技术，石蜡切片ＤＮＡ为模板，成功地在１９例胰腺癌中的１８例扩增了ｋ－ｒａｓ基因片段。用特异核酸探讨和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测了扩增后的ｋ－ｒａｓ基因。     

胰腺癌HER－2／neu肿瘤基因表达与预后关系的探讨

用免疫组化方法和单克隆抗体ＣＢ１１对２１例胰腺导管癌和６例胰壶腹癌ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达进行了研究。发现：①正常胰腺导管和腺泡可呈弱阳性反应；②将中度和强阳性反应视为过表达，并见于２１例胰腺癌中的１０例（４７．６％）和６例胰壶腹癌中的３例；③ＨＥＲ－２／ｎｅｕ过表达与胰腺导管癌预后不良密切相关，过表达患者平均生存时间（７．３±３．８个月）明显短于无过表达患者（１９．１±１１．７个月），Ｐ＜０．０１。结果提示ＨＥＲ－２／ｎｅｕ肿瘤基因过表达常见于胰腺导管癌，并可作为估计预后的生物学指标。     

胰腺癌k－ras基因突变及其与HER－2／neu表达的关系

采用ＰＣＲ技术，以石蜡切片中ＤＮＡ为模板，成功地在１９例胰腺癌中的１８例（９４．７％）扩增了ｋ－ｒａｓ基因片段。用特异核酸探针和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测了扩增后的ｋ－ｒａｓ基因。发现１８例中有１５例（８３．３％）含有点突变。未证实ｋ－ｒａｓ基因突变与预后的关系。免疫组化检测发现本组１９例中９例有ＨＥＲ－２／ｎｅｕ过表达井与患者预后不良密切相关。未证实ｋ－ｒａｓ基因突变与ＨＥＲ－２／ｎｅｕ过表达有关。结果提示：①ｋ－ｒａｓ基因突变在胰腺癌中极为常见，可作为诊断的指标；②ＨＥＲ－２／ｎｅｕ过表达也常见于胰腺癌，与ｋ－ｒａｓ突变关系不大，是一个极好的预后指标。     

乳腺X线影像组学标签在预测乳腺癌HER2表达中的价值

目的:探讨乳腺X线摄影影像组学标签在预测乳腺癌HER2表达中的价值.方法:回顾性分析2018年1月-2020年10月在苏州大学附属第一医院及苏州市立医院经病理证实为乳腺癌患者的临床及X线资料.共入组222例女性患者,平均年龄(53.70±14.46)岁,其中HER2阳性患者59例,阴性患者163例,苏州大学附属第一医院...     

小鼠DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定

目的 建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSPl)3’端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统,并对其进行功能鉴定.方法 提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP1 3'-UTR全长序列,酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游,获得重组载体LuDP,经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞,48h后检测双荧光素酶报告基因的表达.将含有小鼠DUSP1 3’-UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中,获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL,将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共t转染NIH3T3细胞,检测双荧光素酶的活性,分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响.结果 成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体.小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍,P＜0.01);共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍,P＜0.05),共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍,P＜0.05).结论 成功构建了DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统,该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究.     

HER2表达与乳腺癌预后的相关性研究

为了研究乳腺癌HER2表达与预后的关系 ,探讨其作为乳腺癌预后指标的可行性 ,采用免疫组化法 (IHC)检测 185例乳腺癌标本的HER2表达 ,并随访其生存时间。 185例中失访 6 5例 ;12 0例有 10年预后随访资料 ,其中死亡 2 8例。所有检测标本的HER2的阳性率为 37 3%;不同HER2表达级别生存曲线比较差异有统计学意义 ,各生存曲线之间比较差异有统计学意义 ,P值均小于 0 0 1;HER2阴性者 40和 6 0个月生存率比高表达患者高 ;HER2过度表达与生存期呈负相关(P <0 0 5 )。结果说明 ,乳腺癌患者HER2高表达预示生存时间缩短 ,HER2是乳腺癌预后不良的一项独立指标。     

大鼠脑胶质瘤荧光素酶动物模型建模细胞株C6-Luc的构建

目的 构建稳定表达萤火虫荧光素酶的大鼠脑胶质瘤细胞株C6-Luc.方法 通过浓度梯度法测定C6大鼠脑胶质瘤细胞的潮霉素最佳筛选浓度.使用FuGENE HD转染试剂将表达荧光素酶的真核质粒pGL4.50转染至C6细胞,应用潮霉素筛选多克隆细胞株,进一步采用有限稀释法筛选单克隆细胞株.采用报告基因分析对单克隆细胞株进行阳...     

EGFR、HER-2/neu蛋白在胃癌中的表达及其预后价值研究

目的 研究胃癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)、HER-2/neu蛋白的表达与临床病理特征及生存时间的关系,探讨其作为胃癌预后指标的可行性.方法 应用免疫组织化学法检测103例胃癌标本中EGFR、HER-2/neu蛋白的表达,并将检测结果与患者临床病理特征进行综合分析.结果 在103例胃癌组织中,EGFR、HER-2/neu蛋白的阳性表达率分别为42.7%(44/103)、31.1%(32/103),而胃正常组织中均无表达.EGFR、HER-2/neu蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度均无相关性(P＞0.05),而与肿瘤的浸润深度、病理分期、淋巴结转移、远处转移相关(P＜0.05).EGFR、HER-2/neu蛋白表达阳性患者的中位生存时间分别为11.0和10.1个月,表达阴性患者的中位生存时间分别为65.2和64.5个月,表达阳性与阴性患者的生存时间有显著性差异(P＜0.05).EGFR与HER-2/neu蛋白联合表达与生存时间相关(PEGFR＝0.027,PHER-2/neu＝0.000,rEGFR＝1.965,rHER-2/neu＝3.153),二者阳性表达时有减少胃癌患者生存时间的危险,HER-2/neu阳性表达的危险度相对较大.结论 测定胃癌组织中EGFR、HER-2/neu蛋白的表达,有助于判断患者预后,也为分子靶向治疗药物在胃癌的应用提供了理论依据.     

腹腔感染致肺损害的实验观察

腹腔感染致肺损害的实验观察２３００３１合肥解放军第１０５医院赵成功，黎介寿关键词腹膜炎；并发症；肺水肿中国图书资料分类号Ｒ５７２．１肺损害是腹腔感染常见和重要的并发症之一，本实验观察腹腔感染后肺损害出现的时间和过程，探讨其病理机制。新西兰白兔３０只，...     

稳定转染小鼠IL-17全长基因的乳腺癌细胞株的建立及基因转染对4T1细胞的影响

目的建立稳定转染小鼠IL-17基因全长的小鼠乳腺癌4T1细胞株,并进行鉴定。方法脂质体法将携带小鼠IL-17基因全长的真核表达载体pcDNA3．1转染小鼠乳腺癌细胞4T1,经G418筛选出稳定表达IL-17的细胞株;镜下观察细胞形态,RT-PCR法、Western印迹和激光共聚焦法检测目的基因和蛋白的表达;收集转染和未转染IL．17的4T1细胞的培养上清,分别与巨噬细胞RAW264．7共培养,ELISA法检测RAw264．7细胞培养上清中IL-6水平;MTS法检测细胞的增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期、凋亡以及细胞表面MHCI、MHC11、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）等分子表达。结果获得1株稳定表达IL-17的4T1细胞,而且其培养上清可刺激小鼠巨噬细胞RAW264．7产生IL-6,证明该细胞可表达功能性IL-17。结论成功建立了稳定转染IL-17基因的小鼠乳腺癌细胞株。     

Investigation using an HER‐2/neu transgenic mouse model of a newly developed MR contrast agent with the effect of an antitumor drug

Purpose

To assess whether Gd‐DTPA‐Gel‐Cis, a conjugate of gadolinium (Gd), cis diamminedichloroplatinum (Cis), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)‐dianhydride, and bovine gelatin (Gel) can be used as an intravascular contrast agent at MRI and as an antitumor cell proliferation agent in vitro.

Materials and Methods

We injected Gd‐DTPA‐Gel‐Cis (200 mg/mL) into the caudal vein of female HER‐2/neu transgenic mice with spontaneous mammary tumors. The tumor signal intensity was measured with a 0.3 Tesla MRI scanner. HER‐2/neu‐expressing NT cells were treated with Gd‐DTPA‐Gel‐Cis (5 μM cisplatin, 200 mg/mL Gel), Cis alone (5 μM cisplatin), or Gel alone (200 mg/mL gelatin). Differences of P < 0.05 were considered to be statistically significant.

Results

On T1‐weighted MRI scans of mice injected with Gd‐DTPA‐Gel‐Cis we observed a 23% increase in signal intensity. The survival rates of cells exposed to Gd‐DTPA‐Gel‐Cis or Cis were 70.9% and 58.3%, respectively, of the survival rates observed after treatment with Gel alone. Gd‐DTPA‐Gel‐Cis showed significant toxicity (P < 0.05).

Conclusion

Gd‐DTPA‐Gel‐Cis shows promise for use as an MRI contrast medium and as an antitumor agent. J. Magn. Reson. Imaging 2009;30:907–910. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

反转录病毒介导的Luciferase基因稳定转染细胞株的建立及其生物发光成像检测

目的 建立反转录病毒介导的Luciferase基因(Luc2)稳定转染的细胞株,通过体内及体外实验探讨Luc2阳性细胞数与生物发光成像系统光通量之间的关系.方法 采用分子克隆方法构建pMX-Luc2质粒,将其与pMD.G质粒共转染293T gag-pol细胞,获得表达Luc2的反转录病毒.将该反转录病毒感染小鼠结肠癌CT26、人小细胞肺癌NCI-H446、人结肠癌HT-29、人卵巢癌SKOV3、人肝癌sMMC-7721细胞系,建立并筛选Luc2阳性表达的细胞株.分别接种10～1×104个SKOV3-Luc2细胞于培养皿中,在4只裸鼠背侧皮下16个位点分别接种200μl不同浓度(1×107、5×106、2.5×106、1 × 106、5×105、2.5 × 10s、1×105、5 × 104/ml)的SKOV3-Luc2细胞,在另外4只裸鼠尾静脉中分别注射1 ×106和3×106个SKOV3-Luc2细胞.采用生物发光成像系统检测体外、体内接种细胞的光通量值.结果 成功获得表达Luc2的反转录病毒,感染肿瘤细胞系CT26、NCI-H446、HT-29、SKOV3、SMMC-7721,筛选阳性细胞株,均可稳定表达Luc2.体外生物发光成像系统检测结果表明,光通量值与培养皿中接种的细胞数之间存在显著的线性关系(R2=0.944,β=0.972,P＜0.01);活体检测结果表明,光通量值与裸鼠尾静脉注射和皮下接种的细胞数之间均存在显著的线性关系(R2=0.991,β=0.996,P＜0.01; R2=0.351,β=0.628,P＜0.01).结论 采用表达Luc2的反转录病毒感染肿瘤细胞系是快速建立Luc2阳性细胞株的一种可行方法.Luc2阳性细胞数与生物发光成像系统中光通量值具有显著的线性关系.     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

高海拔地区FISH法检测乳腺癌HER2基因的方法改进

目的 在高海拔地区改良并简化乳腺癌HER2 FISH法检测的预处理步骤,节省实验时间,扩大FISH检测试剂盒的临床应用.方法 以10例HER2免疫组化染色结果为＋ ＋以上的乳腺癌标本为研究对象,采用美国PanPath公司的HER2 FISH检测试剂盒,将其中的预处理步骤改良为高压煮沸处理,比较常规法与改良法对HER2基因扩增结果的影响.结果 两种方法检测乳腺癌HER2基因的阳性率无统计学差异,并且均能使细胞间质完全消化,细胞或重叠或孤立,细胞核中红绿信号清晰.结论 改良FISH法可以替代常规预处理步骤,简化了步骤,节省了时间,扩大了FISH检测试剂盒的临床应用.     

HER-2/neu配体结合区蛋白的表达、纯化及复性研究

目的：将HER-2/neu配体结合区(RLD)基因重组，并在大肠杆菌中表达，对以包涵体形式表达的融合蛋白进行变性和复性的研究。方法：采用PCR技术将皿R-2／neuRLD的两段基因分别扩增，并利用基因片段末端的共同酶切位点将两段基因相连接，连接产物插入原核表达载体，在大肠杆菌中实现融合蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE和Westem印迹检测后，进行蛋白质的变性、纯化和复性等处理。结果与结论：在大肠杆菌中实现了融合蛋白的高效表达，表达产物可被特异性抗体识别。经SDS-PAGE分析，表达产物以包涵体形式存在，通过变性、纯化和复性等处理，获得了含两个RID的融合蛋白，从而为HER-2／neu肿瘤疫苗的研究打下了基础。     

荧光原位杂交与免疫组化检测乳腺癌组织Her-2/neu基因扩增或表达情况的比较

目的比较荧光原位杂交法（HSH）与免疫组化法（IHC）对乳腺癌组织中Her-2状态检测结果的差异性和相关性。方法以IHC法检测20例乳腺癌细胞膜十的Her-2蛋白,以FISH法检测上述乳腺癌细胞内的Her-2／neu基因扩增情况,以X^2检验对两种方法检测结果的相关性进行分析。结果两种方法检测结果的总符合率为85．0％,二者之间存在显著正相关（X^2=80．00,p=0．000）。结论IHC法与FISH法在检测乳腺癌Her-2状态方面有良好的一致性。