hEGF cDNA导入培养的人角朊细胞及其表达

目的 观察外源性人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因导入正常导入正常角朊细胞后,能否表达及分泌ｈＥＧＦ;为深入探讨ｈＥＧＦ的作用机制及临床应用奠定物质基础。方法 脂质体包埋ｈＥＧＦ－ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈＥＧＦ转染人角朊细胞,经Ｇ４１８筛选,克隆,扩大及传代培养转基因的角朊细胞,特异性ｎｃｏ探针原位杂交显示转基因细胞内的质粒载体,ｈＥＧＦ抗体免疫细胞化学法观察转基因细胞内ｈＥＧＦ的表     

小鼠角朊细胞和成纤维细胞的Fas通路及其影响因素

FaS（CD95）和FaS配体（Fed）分别是l型和11型细胞膜表面糖蛋白，属于肿瘤坏死因子（TN’F）超家族成员。其相互间结合是触发细胞凋亡的一个主要途径，在维持免疫系统的自身稳定、控制肿瘤的发生等方面发挥着重要作用［’。维甲酸、辐射等很多因素都会诱导和调节凋亡的产生［‘］。我们采用了高敏感的RNA酶保护法，半定量地检测了正常新生小鼠角阮细胞和成纤维细胞的Fas和FaSLInRNA及维甲酸对其表达的影响，同时检测了细胞表面蛋白质的表达。一、材料与方法1.新生小鼠角肮细胞和成纤维细胞的培养【‘］：（）将角肮细胞培养在低钙…     

人白细胞介素2基因转染角朊细胞稳定表达的检测

目的 观察人白细胞介素２（ＩＬ－２）基因皮肤角朊细胞中的稳定表达及分泌情况。方法 ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法转染，以Ｇ４１８筛选出阳性克隆并做扩大培养用ＤＮＡ斑点杂交，ＲＮＡ斑点杂交，细胞铺片原位杂交，免疫组织化学，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交分析及噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测外源基因在角朊细胞内的表达及分泌情况。结果 ＤＮＡ斑点杂交ＲＮＡ斑点杂交，原位杂交和免疫组织化学以均显著转染组有阳性信号，Ｗｅｓ     

pcDNA3-hbFGF转染角朊细胞对真皮成纤维细胞增殖的生物学效应

目的：观察含外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因的角朊细胞（ＨＫ）,对真皮成纤维细胞（ＨＤＦｉｂ）增殖的影响;探讨转ｈｂＦＧＦ基因ＨＫ对创面愈合的生物学效应及作用机理,为这种转基因ＨＫ细胞用于创面基因治疗的可行性提供实验依据。方法：收集含真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ的ＨＫ细胞培养上清,加入培养的ＨＤＦｉｂ细胞内;ＭＴＴ法测定细胞的增殖率、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定细胞ＤＮＡ合成率     

茶多酚对原代培养的大鼠皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长的 …

目的 探讨茶我酚对原代培养的皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长作用的影响。方法 利用原代２的两种主要的皮肤细胞－－角朊细胞和成纤维细胞,采用丙酮酸比色法、ＴＢＡ比色法和ＤＴＮＢ（双硫代对硝基苯甲酸）法测定细胞２的上清液胞浆酶（ＬＤＨ）释放情况,脂质氧化产物（ＭＤＡ）、谷胱甘这氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）,并测定培养细胞的生长情况,对茶多酚在皮肤中可能起到的作用进行评价。结果 在加入茶多酚后不同时间地多数发现     

获取SD仔鼠角朊细胞和真皮成纤维细胞6种方法比较

目的 :探讨如何以简便快捷的方法获得大量最佳生长状态的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞 .方法 :用 2 .5 g·L -1 胰酶、35 g·L -1 热溶素和 9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase分别在不同条件下处理皮肤标本 ,观察表皮与真皮的分离情况 ,并分别培养角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,观察比较细胞的贴壁率和克隆形成率 ,通过MTT和BrdU检测观察细胞的生长状态 ,并分别用不同方法获得的细胞构建组织工程皮肤 .结果 :在各种条件下 ,Dispase处理组获得的细胞数量、细胞贴壁率和克隆形成率均优于其他消化液处理组 ,细胞纯度高 ,生长状态良好 ;用其他方法获得的细胞生长状态相似 ,都可成功构建组织工程皮肤 .结论 :使用9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase可以简便快捷的获得大量生长状态良好的角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,以作为皮肤组织工程的种子细胞 ,合适的消化方法、时间和温度可以最大限度保持原代细胞的活力     

表皮细胞生长因子对培养表皮角朊细胞DNA合成的影响

目的 :选择培养表皮角朊细胞时添加表皮细胞生长因子 ( EGF)及小牛血清的最适浓度。方法 :添加不同浓度的 EGF及小牛血清 ,测定 3 H- Td R掺入量。结果 :添加 2 0μg· L-1EGF时3 H- Td R掺入量明显高于添加 5和 1 0 μg·L-1EGF时。结论 :2 0 μg·L-1EGF、2 0 %小牛血清为培养表皮角朊细胞的最适浓度。     

人角朊细胞培养的实验研究

目的 :探讨实验室条件下人体角朊细胞的培养技术 ,观察角朊细胞培养生长过程。方法 :采用改良的有血清培养技术进行人体角朊细胞的培养。结果 :培养的角朊细胞 5天融合达 70 % ,9天达 90 % ,1 1天左右完全融合 ,细胞分裂指数高峰在 9天左右 ,可达 1 1 %。结论 :利用改良的有血清培养技术体外培养角朊细胞生长好 ,9～ 1 1天即可形成膜片 ,可达到移植条件 ,对临床上救治大面积烧伤病人具有重要意义     

在空气—液体交界面培养角朊细胞

为使体外培养的角朊细胞在近似体内状况下生长,本实验将人体表皮角朊细胞置于塑料培养环内的胶原基质上进行空气—液体交界面培养。培养14d后,将培养物冰冻切片,行普通细胞染色和免疫细胞化学检查,结果显示,有多层细胞形成,且在上层细胞中出现filaggrin。提示此培养技术可用于研究人体表皮细胞的生长和分化。     

KGF-transfected cells can stimulate growth and proliferation of human cultured keratinocytes in vitro

Objective: To establish two stably KGF-transfected, immortalized cell lines. Methods: HaCaT-keratinocytes and KMST-6-fibroblasts were transfected by liposome mediated gene transfer. Transfection effectivity, gene integration and configuration of the transgenic protein were investigated by ELISA, DANN-PCR and β-Gal-staining. Results: Most effective GF producing clones were tested by a colorimetric XTT-test. Conclusion: This is a significant acceleration of cell proliferation and mitosis of human keratinocytes in an Air Liquid Interface (ALI) test system.     

人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法：从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正确的重组质粒用SacI线性化后电转化至毕赤酵母X-33,经PCR法、SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物,从而筛选出能够稳定、高效分泌表达hbFGF的酵母工程菌。结果：经测序证实获得的hbFGF序列与GenBank（登录号NM002006）报道的完全一致,甲醇诱导表达后培养液上清的SDS-PAGE凝胶电泳显示在相对分子质量约18 000有一蛋白条带,Western blotting结果显示表达产物与抗人碱性成纤维细胞生长因子抗体产生特异性条带,证明rhbFGF蛋白的表达。结论：成功克隆了hbFGF 基因,并在毕赤酵母体系中进行了表达。     

一株IL—11 cDNA转染的成纤维细胞体外促造血活性的鉴定

目的：为了探讨ＩＬ－１１基因修饰成纤维细胞的体外促造血活性及其在造血系统基因治疗中的应用前景。方法：将含ＩＬ－１１ ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体转染小鼠成纤维细胞系ＮＩＨ－３Ｔ３细胞，获得了高表达ＩＬ－１１的亚克隆１Ｅ７，通过造血祖细胞集落形成实验及细胞增殖实验对１Ｅ７在体外的促造血活性做了初步的鉴定。     

HGF基因转染关节软骨细胞及其生物学特性影响

目的观察携带有绿色荧光蛋白（gree fluorescent protein，GFP）标记的肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）cDNA转染兔软骨细胞后的主要生物学特性。方法取兔膝关节软骨细胞体外培养至第二代，HGFcDNA转染软骨细胞，空白质粒组为对照组；噻唑蓝（MTT）检测软骨细胞的增殖能力，SABC免疫组化及原位杂交法测其Ⅱ型胶原在转染前后的变化与mRNA的表达。结果软骨细胞在转染后可较长时间的保持其软骨细胞的生物学特性，并可促进软骨细胞的增殖，SABC免疫组化测第VI代软骨细胞的Ⅱ型胶原表达仍呈强阳性，而对照组软骨细胞则明显减弱，说明HGF基因转染软骨细胞后可表达其生物学功能。基因瞬间转染率大约为31．23名。结论GFP标记的HGF基因以脂质体为载体转染兔膝关节软骨细胞后可发挥其生物学功能，加速细胞的生长，在荧光显微镜下可直观的计算软骨细胞的瞬间转染率。     

Expression of Vascular Endothelial Growth Factor （VEGF） in Human Osteosarcoma Cells Transfected with Adeno-associated Virus-antisense VEGF

Ithasbecomeacommonmethodforcancertreatmentthroughantivascularizationinthepresent.Somestudieshaverevealedthatlivercancer ,lungcancerandcervicalcancercanbetreatedsuccessfullythroughholdingbackvascularendothelialgrowthfac tor (VEGF) proteinbecauseofitsimport…     

bFGF基因转染的牙龈成纤维细胞与脱细胞真皮基质复合物的体外构建

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因修饰的牙龈成纤维细胞（GFs）与组织工程支架材料脱细胞真皮基质（ADM）复合后的生长、结合情况,为基因治疗与组织工程联合应用于牙周组织缺损再生治疗提供依据。方法将转染bFGF的GFs接种于ADM真皮面,通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、透射电镜及组织学检查,观察细胞的生长状况及其与支架材料的复合情况。结果基因修饰的牙龈成纤维细胞复合ADM膜后生长良好,24 h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞在支架材料中生长,并与支架材料结合紧密。结论转染bFGF基因的的GFs与ADM膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

aFGF重组腺病毒载体的构建、转染效率和使用安全性的初步研究

目的：旨在构建人酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibrolast growth factor,aFGF）重组腺病毒载体，为基因转染的研究作准备。方法：将用于转染的重组粘粒和DNA－TPC混合后，以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293细胞，获取重组腺病毒。结果：重组腺病毒DNA经酶切鉴定为正确，所得重组腺病毒为E1缺陷型并带有aFGF基因，同时证明重组腺病毒体外转染效率高且使用安全，结论：此重组缺陷型腺病毒载体可用于体内基因治疗研究。