Genistein和PD98059对aFGF及bFGF诱导的CAOV3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂genistein和细胞外信号调节激酶(ERK)激酶MEK1抑制剂PD98059对酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF,bFGF)诱导的人卵巢上皮性浆液性癌细胞株CAOV3细胞增殖的抑制作用.方法:以不同浓度的aFGF或bFGF刺激CAOV3细胞,施加不同浓度的genistein或PD98059,通过MTT比色法观察genistein及PD98059对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪测定细胞各周期细胞百分数.结果:aFGF和bFGF使该细胞株增殖比明显增加,genistein和PD98059使增殖比明显下降,genistein的抑制作用强于PD98059.CAOV3细胞受到aFGF或bFGF刺激后,由GO G1期进入S和G2 M期的细胞明显增多,genistein或PD98059作用下则明显减少,并在一定浓度范围内成剂量依赖性,与对照组比较差异显著.结论:CAOV3细胞株中aFGF及bFGF受体有TPK活性,genistein对aFGF及bFGF引起的细胞增殖具有抑制作用,且aFGF及bFGF可能通过激活TPK受体从而激活Ras-Raf-ERK信号转导途径调控CAOV3细胞增殖,PD98059可有效阻滞此传导途径.     

ERK1/2介导的bFGF在乳腺癌细胞系MCF-7增殖中的作用

目的 观察Ras-Raf-ERK1/2途径介导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖的影响,探讨bFGF及其信号传导途径与乳腺癌发生及发展的关系.方法 应用细胞免疫组织化学技术检测不同浓度bFGF处理细胞后ERK1/2蛋白的表达;应用蛋白印迹技术检测不同浓度、不同时间bFGF和bFGF+PD98059处理MCF-7细胞后,细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达水平的变化.结果 经bFGF不同浓度(0、12.5、25及50 ng/mL)处理MCF-7乳腺癌细胞系后,ERK蛋白表达随着浓度的增加而增强,且与bFGF水平呈剂量依赖关系;以最佳工作浓度25 ng/mLbFGF处理MCF-7乳腺癌细胞系不同时间后,其表达活性明显高于对照组和bFGF+PD98059组.加入bFGF抑制剂PD98059后,bFGF诱导MCF-7细胞系p-ERK1/2活性的作用受到抑制,ERK蛋白表达明显下调.结论 bFGF通过Ras-Raf-ERK1/2途径的介导,促进了MCF-7细胞的增殖,进而抵抗无血清诱导的凋亡.抑制剂PD98059可阻断此诱导作用,使ERK表达明显下调.ERK信号传导通路可能是乳腺癌侵袭和转移的重要途径,ERK1/2和bFGF的表达可为乳腺癌治疗的靶点提供理论依据.     

Genistein对CAOV3细胞增殖的抑制作用

目的观察酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂genistein对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人卵巢上皮性浆液性癌细胞株CAOV3细胞增殖的抑制作用,探讨其信号传导机制.方法以不同浓度的bFGF和genistein诱导CAOV3细胞,通过MTT比色法观察genistein对细胞增殖的抑制作用;利用[γ-32P]ATP掺入外源性底物的方法,液体闪烁测定TPK和蛋白激酶C(PKC)活性的变化.结果bFGF使该细胞株增殖比明显增加,细胞内TPK、PKC活性升高;genistein使细胞增殖比明显下降,抑制细胞内TPK、PKC活性,且genistein对bFGF诱导的TPK和PKC活性抑制更显著.结论bFGF可能通过TPK途径激活PKC来调控CAOV3细胞增殖,genistein可有效阻滞此传导途径,从而抑制细胞增殖.     

Genistein对CAOV3细胞增殖的抑制作用

目的 观察酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂genistein对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的人卵巢上皮性浆液性癌细胞株CAOV3细胞增殖的抑制作用，探讨其信号传导机制。方法 以不同浓度的bFGF和genistein诱导CAOV3细胞，通过MTT比色法观察genistein对细胞增殖的抑制作用；利用[γ-^32P]ATP掺入外源性底物的方法，液体闪烁测定TPK和蛋白激酶C(PKC)活性的变化。结果 bFGF使该细胞株增殖比明显增加，细胞内TPK、PKC活性升高；genistein使细胞增殖比明显下降，抑制细胞内TPK、PKC活性，且genistein对bFGF诱导的TPK和PKC活性抑制更显著。结论 bFGF可能通过TPK途径激活PKC来调控CAOV3细胞增殖，genistein可有效阻滞此传导途径，从而抑制细胞增殖。     

ERK1/2介导的bFGF对肝癌细胞系Bel-7402细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察Ras-Raf-ERK1/2途径介导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对肝癌细胞系Bel-7402细胞增殖和凋亡的影响,探讨bFGF及其信号转导途径与肝癌发生发展的关系。方法:以bFGF和PD98059处理Bel-7402细胞,流式细胞术检测细胞周期与凋亡情况;MTT法检测细胞增殖情况;Western blot检测细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)的活化。结果:bFGF处理,诱导细胞进入S期[S期细胞比例(27.49±0.72)%→(42.45±1.06)%];细胞增殖比明显增加,且与bFGF水平成剂量依赖关系,bFGF浓度为25 ng/ml时细胞增殖比最高为129%;使无血清饥饿诱导的凋亡细胞比例下降[(28.89±3.13)%(→1.70±2.10)%];时、量效依赖性地诱导ERK1/2活性增高。ERK激活性蛋白激酶(MEK1)抑制剂PD98059可抑制bFGF的这些作用。结论:bFGF通过Ras-Raf-ERK1/2途径介导,加速肝癌Bel-7402细胞的细胞周期进程,促进细胞增殖,抵抗无血清饥饿诱导的凋亡。在肝癌发生发展过程中,bFGF信号传递发挥了重要的作用。     

尾加压素Ⅱ对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞外信号调节激酶1/2蛋白磷酸化的影响

目的 研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖及细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)蛋白磷酸化的影响,探讨肺动脉高压肺血管重塑的可能机制.方法 采用消化法培养大鼠PASMC,WST-8测定不同浓度UⅡ诱导的大鼠PASMC的增殖活性及ERK1/2特异性抑制剂PD98059对UⅡ诱导的大鼠PASMC增殖活性的影响.Western blot法检测不同浓度UⅡ诱导的PASMC胞内ERK1/2蛋白磷酸化水平及PD98059对UⅡ诱导的ERK1/2蛋白磷酸化的抑制作用.结果 UⅡ在一定浓度范围(10-9～ 10-7mol/L)能浓度依赖性提高大鼠PASMC的增殖活性,并且能促进细胞内ERK1/2蛋白磷酸化.PD98059可阻断UⅡ诱导的PASMC增殖及PASMC胞内ERK1/2蛋白磷酸化.结论 UⅡ可促进大鼠PASMC增殖,ERK1/2通过磷酸化在其中发挥重要作用.     

溶血磷脂酸促卵巢癌细胞增殖机制的研究

目的 探讨溶血磷脂酸(LPA)促进卵巢癌细胞增殖的机制。方法 体外培养人卵巢上皮癌细胞株SKOV3,选用促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导通路特异性阻断剂PD98059,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定LPA和PD98059对SKOV3细胞增殖活性的影响;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定LPA单独或合用PD98059对SKOV3细胞表达环氧化酶-2(COX-2)的影响;应用流式细胞仪（FCM）测定细胞的凋亡及细胞周期的变化。结果 LPA(浓度＞10μmol／L)以剂量依赖方式促进SKOV3细胞增殖,PD98059抑制LPA促增殖作用（P＜0.05）。RT-PCR结果显示,LPA能促进COX-2的表达（P＜0.05）,而合用PD98059后COX 2的表达降低（P＜0.05）。FCM结果显示,LPA能促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,增加S期比率,而合用PD98059后LPA促增殖作用消失,且G0/G1期比率升高,S期比率降低。结论 LPA通过MAPK信号传导通路促进卵巢癌细胞增殖,且与COX-2表达有关。     

尾加压素Ⅱ对自发性高血压大鼠血管外膜成纤维细胞增殖活性及细胞外信号调节激酶1/2磷酸化的影响

目的研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)对自发性高血压大鼠(SHR)血管外膜成纤维细胞增殖活性的影响,并进一步探讨其可能涉及的信号转导通路。方法用胸腺嘧啶掺入法(3H-TdR)观察UⅡ诱导的SHR大鼠血管外膜成纤维细胞的增殖活性,及UⅡ受体拮抗剂Urantide、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)特异性的抑制剂PD98059对UⅡ诱导SHR大鼠血管外膜成纤维细胞增殖活性的影响;用免疫印迹技术观察UⅡ诱导后ERK1/2的磷酸化,及Urantide、PD98059对ERK1/2磷酸化的影响。结果UⅡ可以剂量依赖性地诱导SHR大鼠血管外膜成纤维细胞的增殖活性,且这一作用可以完全及部分被Urantide、PD98059抑制;UⅡ可以时间依赖性地诱导血管外膜成纤维细胞ERK1/2的磷酸化,且这一作用可以完全被Urantide、PD98059抑制。结论UⅡ可以诱导SHR大鼠血管外膜成纤维细胞的增殖活性,且该过程部分由ERK1/2信号通路所介导。     

纤维连接蛋白诱导人胚胎肺纤维细胞增殖的MAPK信号转导通路研究

目的 探讨纤维连接蛋白(FN)诱导人胚胎肺纤维细胞(HFL1)增殖的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路.方法 采用不同浓度FN刺激HFL1,观察细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059、p38蛋白激酶抑制剂SB203580对FN诱导HFL1增殖作用的影响.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖情况.结果 FN对HFL1诱导增殖作用呈剂量依赖性升高趋势,在50 ng/ml时作用显著;PD98059和SB203580可抑制FN诱导的HFL1细胞增殖.结论 FN诱导HFL1的细胞增殖可以通过MAPK信号转导途径实现.     

姜黄素对Tca8113细胞周期各时相的影响

目的:探讨姜黄素对Tca8113(人舌癌细胞株)细胞株的诱导分化作用及对细胞周期各时相的影响.方法:应用MTT比色法和流式细胞仪检测姜黄素对Tca8113细胞的增殖抑制率及细胞周期的改变,并通过电子显微镜观察其亚细胞结构的改变.结果:姜黄素对Tca8113细胞增殖有明显抑制作用,且呈剂量依赖性.流式细胞仪分析,G1期细胞增高,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多.亚细胞结构:细胞空化,核仁不规则.结论:姜黄素能够抑制Tca8113细胞增殖,阻止G1期细胞向S期的进程.S期细胞减少,G2/M期细胞增多,促进Tca8113细胞凋亡.     

表达HCV NS3蛋白肝细胞中ERK与NF-κB信号转导通路间的cross-talk研究

目的:研究表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3(hepatitis C virus non-structural protein 3, HCV NS3)的肝细胞中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)与核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号转导通路间的cross-talk.方法:真核表达质粒pcDNA3.1-NS3转染人源永生化肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV NS3蛋白的细胞株QSG7701/NS3.在丝裂原活化蛋白激酶的激酶(MAP kinase kinase, MEK)抑制剂PD98059(0,30,50,100μmol/L)处理细胞QSG7701/NS3前后,利用Western免疫印迹检测ERK的磷酸化水平及细胞周期素D1(cyclin D1)蛋白的表达;凝胶电泳阻滞迁移试验检测转录激活因子1(activator protrin 1, AP-1)、NF-κB等转录因子活性的改变;流式细胞术检测细胞周期各期百分数的改变;MTT比色法观察其对细胞增殖的影响.结果:HCV NS3蛋白能上调QSG7701细胞的ERK磷酸化水平及cyclin D1的表达水平;PD98059抑制HCV NS3蛋白介导的细胞增殖,下调AP-1和NF-κB的活性及cyclin D1的表达.结论:在表达HCV NS3蛋白的肝细胞中,ERK抑制剂能抑制肝细胞增殖,并呈明显的剂量依赖关系.ERK与NF-κB信号转导通路间可能存在cross-talk,并在肝细胞的增殖和恶性转化中发挥协同作用.     

bFGF对NIH3T3细胞TPK,PKC,ERK活性的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NIH3T3细胞酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)及胞外调节蛋白激酶(ERK)活性的影响,探讨其信号转导机制.方法:分别加入bFGF及PKC抑制剂H-7、MEK1抑制剂PD98059孵育细胞,利用[γ-32P]ATP掺入外源性底物的方法测定活性.结果:bFGF可使细胞膜TPK、细胞质PKC及ERK活性明显升高.H-7 bFGF、PD98059 bFGF组与只加bFGF组比较TPK活性保持不变,而PKC及ERK活性均下降.结论:TPK、PKC、ERK介导bFGF的信号转导.ERK与PKC是TPK受体下游的两个分支,PKC与ERK可以互相激活.     

ROLE OF ERK1／2 KINASE IN CISPLATIN-INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN OVARIAN CARCINOMA CELLS

Objective To investigate the role of extracellular regulated kinase (ERK1/2) pathway in cisplatin-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells.Methods Cisplatin-induced apoptosis were stained with DAPI and was assessed microscopically in human epithelial adenocarcinoma ovarian cell line SKOV3 cells. ERK activation was determined by Western blotting using an anti-phosphoERK antibody to detect ERK activity. The effect of PD98059 on ERK activity induced by cisplatin was detected by MTT assay.Results Marked apoptosis of SKOV3 cells resulted from 48 hours treatment with 20 μg/mL cisplatin. Strong activation of ERK was led to by 15 μg/mL cisplatin. Dose response and time course of cisplatin induced apoptosis in SKOV3 cells.Cisplatin-induced ERK activation occurred at 12 hours and increased to highest induction at 24 hours by Western blotting.The effect of PD 98059 on ERK activity induced by cisplatin at the concentration of 100 μmol/L PD 98059. Statistically significant decreased in cell survival were observed with 100 μmol/L PD 98059 at 15 and 20 μg/mL cisplatin (P＜ 0.05).Conclusions Cisplatin activates the ERK signaling pathway in ovarian cancer cell line SKOV3. Inhibition of ERK activity enhances sensitivity to cisplatin cytotoxity in ovarian cancer cell line SKOV3. Evaluation of ERK activity could be useful in predicting which ovarian cancer will response most favorably to cisplatin therapy.     

酸性成纤维细胞生长因子在卵巢癌中的表达及其信号传导途径

目的　探讨酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)在卵巢癌发生发展中的作用及其信号传导机制。方法　应用逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和Western印迹方法对 40例上皮性卵巢癌组织aFGF及其受体FGFR1的表达进行了分析 ;并以不同浓度的aFGF和酪氨酸蛋白激酶 (TPK)抑制剂 genistein诱导卵巢癌细胞株CAOV3细胞 ,利用 [γ 32 P]ATP掺入外源性底物的方法 ,液体闪烁测定蛋白激酶C(PKC)及细胞外信号调节激酶 (ERK)的活性。结果　aFGFmRNA和FGFR1mRNA在上皮性卵巢癌组织中的半定量检测结果分别为 0 981± 0 1 30和 1 0 4 7± 0 1 4 8,与正常卵巢、卵巢瘤样病变及卵巢良性肿瘤相比 ,差异有显著意义 (P <0 0 5) ,且在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期 (P <0 0 5) ;Western印迹检测见上皮性卵巢癌组织中aFGF和FGFR1条带均深于正常卵巢组织 ;随着aFGF浓度的增加 ,CAOV3细胞PKC及ERK活性随之升高 ,与aFGF浓度呈剂量依赖效应 ;Genistein抑制细胞内PKC及ERK活性 ,与 genistein浓度亦呈剂量依赖效应。 结论　aFGF与上皮性卵巢癌的发生、发展、浸润呈正相关 ,其受体具有TPK活性 ,TPK激活后可进一步激活PKC和ERK ,进一步证明PKC及ERK确是TPK的下游信号分子     

Effects of ursolic acid on the proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cells

This study examined the effects of ursolic acid （UA） on the proliferation and apoptosis of a human ovarian cancer cell line, CAOV3. The CAOV3 cells were cultured in the RPMI 1640 media and treated with different concentrations of UA （0, 10, 20, 40 μmol/L）. The proliferation rate of the CAOV3 cells was determined by MTT assay. The apoptosis rate was measured by flow cytometry. ERK activity was detected by immunoprecipitation and the expressions of p-ERK1/2, MKP-1, Bax and Bcl-2 by Western blotting. The results showed that the proliferation rate was significantly decreased in the cells treated with UA as compared with that in the non-treated cells （P〈0.05）. The intracellular ERK activity and p-ERK1/2 expression were also reduced in the UA-treated cells, while the MKP-1 expression was elevated. Moreover, the apoptosis was found in the CAOV3 cells exposed to UA; the Bax expression was increased and the Bcl-2 expression decreased. The apoptosis rate in the UA-treated cells was much higher than that in the non-treated cells （P〈0.05）. It is concluded that UA can inhibit the proliferation of CAOV3 cells by suppressing the ERK activity and the expression of p-ERK1/2. And it can also induce the apoptosis of the CAOV3 cells by up-regulating the Bax expression and down-regulating the Bcl-2 expression.     

PD98059通过诱导PUMA表达增强肠癌LoVo细胞对奥沙利铂的敏感性

目的 体外实验探讨MEK1特异性抑制剂PD98059对奥沙利铂药物治疗作用的影响及PUMA在这一过程中的作用.方法 MTT法检测转染MEK1 active质粒后及不同药物处理后对LoVo细胞增殖率的影响;Western blot检测奥沙利铂和/或PD98059处理后PUMA蛋白的表达和ERK的活性;利用表达反义PUMA基因的细胞克隆抑制PUMA的表达后检测对PD98059和奥沙利铂诱导凋亡作用的影响.结果 在肠癌LoVo细胞中,ERK的激活增加细胞的增殖率;奥沙利铂可以抑制ERK的活性,并呈剂量依赖关系;PD98059可以协同奥沙利铂抑制细胞增殖率的作用;奥沙利铂和PD98059可以协同诱导PUMA的表达;抑制PUMA的表达可以减弱奥沙利铂和PD98059诱导的LoVo细胞的凋亡.结论 PD98059通过诱导PUMA表达增强肠癌LoVo细胞对奥沙利铂的敏感性.     

细胞外信号激酶在泰素引起的卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的探讨细胞外信号激酶(ERK)在紫杉醇引起的卵巢癌细胞调亡中的作用.方法用紫杉醇处理人卵巢上皮性腺癌细胞株Caov-3 and Skov-3,应用二氨基联苯染色,在显微镜下观察其凋亡.应用蛋白印迹法技术,用特异性识别双磷酸化ERK1/2的抗体,检测卵巢癌细胞经泰素作用后ERK1/2的活化情况.用MTT法检测PD98059对泰素引导的卵巢癌细胞毒性的影响.结果在80 nM泰素导致Caov-3和Skov3细胞凋亡和ERK1/2激活,泰素作用9h后,出现ERK的激活,15h后活性最大.用100μM的PD 98059作用于不同药物浓度(60nM和80nM)的泰素作用的细胞,细胞存活率显著降低(P＜0.05).结论泰素能激活卵巢癌Caov-3和Skov3细胞ERK.抑制ERK的活性能提高Caov-3和Skov3细胞对泰素的敏感性.阻断MEK1/ERK信号转导通路,可以增加泰素对卵巢癌的细胞毒作用.     

哇巴因诱导血液肿瘤细胞增殖的信号通路研究

目的揭示哇巴因诱导急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat增殖的信号传导途径.方法采用MTT、Western Blot等方法,观察哇巴因及不同激酶抑制剂对Jurkat细胞生长的影响,同时检测酪氨酸活化水平和丝裂原活化蛋白激酶MAPK（ERK1/2）的磷酸化程度.结果哇巴因促使Jurkat细胞膜酪氨酸磷酸化水平增高,并激活ERK1/2.激酶抑制剂PD98059,PP2,HerbimycinA和PP3均可阻断哇巴因诱导ERK1/2 的活化并抑制哇巴因诱导Jurkat细胞的增殖.结论哇巴因激活钠泵的信号传导功能,引起细胞膜酪氨酸磷酸化水平增高,MAPK（ERK1/2）信号途径级联样活化,从而导致Jurkat的增殖反应.Src激酶和EGFR参与了钠泵介导的信号传导.     

阻断MAPK通路对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：研究前列腺癌进展中细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的变化，探讨阻断此通路对前列腺癌细胞增殖的影响。方法：用MTT法检测表皮生长因子（EGF）、PD98059对前列腺癌细胞系LNCaP、PC 3和DU145增殖的影响；用Western blot法检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）表达和磷酸化ERK1/2水平的差异，以及EGF、PD98059对细胞ERK1/2磷酸化水平的影响。结果：EGF促进LNCaP、PC 3和 DU145的增殖，PD98059抑制细胞增殖；Western blot结果显示，3株前列腺癌细胞的总ERK1/2无明显差异。在血清饥饿的状态下，LNCaP细胞无ERK1/2的活化,而PC 3和 DU145细胞ERK1/2处于持续活化的状态。PD98059能够阻断EGF对3株前列腺癌细胞ERK1/2的激活。结论：MAPK通路的持续活化在前列腺癌的恶性进展中起重要作用，阻断此通路可以抑制前列腺癌细胞的增殖。