2009年肠道病毒71型广州分离株的全基因组序列分析

目的分析2009年肠道病毒71型广州分离株GZHY09的全基因组序列,并与GenBank中的序列进行分析比对。结论从GenBank上选不同地区的EV71全基因组序列,设计相互重叠的覆盖病毒整个基因组序列的12对引物,采用RT-PCR扩增出12个基因片段,通过测序获得全基因组序列,并参考国内外各EV71基因型的分离毒株,用MEGA4软件进行进化树分析,用DNAStar软件中的MegAlign进行同源性分析。结果 12个重叠基因片段序列拼接获得EV71全基因组序列,共7404个核苷酸,同源性分析结果表明在VP1区,GZHY09株与中国大陆的Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08的核苷酸序列同源性比较高,其中以Anhui08最高（97.7%）。结论 GZHY09属EV71病毒的C4亚型,与近年我国大陆地区流行的EV71株在进化上属于同一基因型,与Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08具有高度的同源性。     

肠道病毒71型山东临沂分离株全基因组序列分析

目的 自1例死亡患儿的标本中分离EV71,并分析其全基因组序列特点,研究其基因序列的改变是否与其神经毒力有关.方法 咽拭子标本采自山东临沂市人民医院1例死亡患儿,在人横纹肌瘤细胞(RD)上分离EV71,分段扩增获得EV71的全序列,用BLAST、Bioedit和MEGA 4进行序列分析.结果 获得1株EV71分离株SDLY107,基因组全长7405 bp,全基因组核苷酸序列与2008年的阜阳株Fuyang.Anhui.P.R.C/17.08/2同源性最高,为98.6%,与原型株BrCr/70的同源性为80.0%,与神经毒型株MS/87的同源性为86.5%.系统进化分析表明,SDLY107与中国大陆的北京株、河南株、广西株、深圳株、兰州株、阜阳株、重庆株、浙江株的亲缘关系较近,按照传统的VP1基因分型方法,可归为C4亚型,是近年来我国大陆流行的主要基因亚型.氨基酸序列分析发现,SDLY107与其他毒株相比,有2个特有的突变(E947D,K1873R).结论 SDLY107分离株属于C4亚型,氨基酸突变E947D和K1873R可能与EV71的致病性有关.

Abstract：

Objective To isolate enterovirus 71 from a death children,and analyze whether the neurovirulence was related to the variation of nucleotide and amino acid. Methods Enterovirus 71 was isolated from throat swabs which were colleted from Shandong Linyi People's Hospital. The full length genome was sequenced by amplification with RT-PCR and sequencing of 9 overlapped gene fragments covering full length of the genomes. The nucleotide and amino acid sequenced was aligned by BLAST, Bioedit and MEGA 4. Results A strain of enterovirus 71 was isolated and named as SDLY107. The full length was 7405 bp. The results of homology analysis of overall nucleotide sequence showed that strain Fuyang. Anhui. P. R. C/17.08/2 had highest homology (98.6%)with strain SDLY107, and the homology was 80.0% between strain SDLY107 with prototype strain BrCr/70,and 86. 5% between strain SDLY107 with nerve strain MS/87. Phylogenetic analysis showed that the phylogeny was close between SDLY107 with some isolated strains from Chinese Mainland, such as Beijing, Henan, Guangxi, Sbenzhen, Lanzhou, Fuyang, Chongqing and Zhejiang strains, which was clustered for C4 subtype. The results of amino acid sequence analysis showed that there were 2 mutations, E947D and K1873R, for strain SDLY107. Conclusion SDLY107 belonged to C4 subtype, amino acid mutations E947D and K1873R of which may be relevant to the pathogenicity of EV71.     

2008年广东省肠道病毒71型分离株全基因组核苷酸序列分析

目的 了解2008年广东省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征.方法 选择2008年广东省分离的1株EV71毒株(GDFS-3),进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析.结果 GDFS-3株与其他EV71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5'UTR和3'UTR的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与中国台湾流行株(TW984)的同源性最高(为96.0%),与新加坡流行株SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81.0%左右.氨基酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与TW984同源件最高(99.0%).根据VP1基因序列构建亲缘性关系树,GDFS-3株与C4亚型(subgenogroup)聚为一簇,与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性为91.0%～95.0%.结论 遗传进化分析表明,GDFS-3株和中国台湾2004年流行的EV71毒株的亲缘关系最为密切,属于C4亚型,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.5'UTR的突变对于EV71毒力增强可能有重要作用.上述结果 有助于EV71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.     

2008-2009年北京分离的肠道病毒71型基因组3'末端序列分析

目的 了解2008-2009年北京分离的肠道病毒71型(EV71)基因组3'末端的基因特征(未包括多聚腺苷尾),探讨是否与病毒的致病性有关.方法 于2008-2009年手足口病流行期间采集来首都儿科研究所附属儿童医院就诊的普通手足口病患儿和合并重症神经系统并发症患儿的咽/鼻拭子或疱疹液标本.将标本接种Vero细胞进行肠道病毒分离,同时设计肠道病毒通用引物、EV71和柯萨奇病毒A组16型(CA16)特异性引物通过巢式RT-PCR对分离到的肠道病毒进行型别鉴定.对引起不同临床类型感染的10株EV71分离株的基因组3'末端进行序列测定和分析.结果 10株EV71的3'末端均包含1386 nt的3D、终止密码子TGA和81 nt的3'UTR,由3D核苷酸序列所推导的3D蛋白含462个氨基酸.10株EV71的3D和3'UTR核苷酸同源性分别为95.8%～99.6%和96.3%～100%,重症来源的4株毒株中有3株在3Dpol第140位和第263位同时出现了相同的氨基酸变异(R140K和I263V).10株EV71的3D与C4亚型代表株具有最高的核苷酸和氨基酸同源性,分别为92.7%～94.2%和96.8%～97.6%;在3'UTR与CA16/G10具有最高的核苷酸同源性(88.9%～91.4%).3D区的遗传进化分析表明10株EV71在亲缘关系上与C4亚型最密切,与CA16/G10较密切,而与EV71其他基因型和亚型较疏远.结论 基因组3'末端在EV71进化中可能有一定的作用.     

肠道病毒71型实验室诊断研究进展

人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA,最早是于1969 -1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢神经系统症状的婴儿粪便中分离得到[1],之后世界上许多国家相继报道了EV71感染的流行,HFMD与EV71感染的关系也受到了广泛的重视.EV71与柯萨奇病毒(coxsackievirus)引起的手足口病不同,其感染性强、致病率高,是目前除脊髓灰质炎病毒以外导致婴幼儿神经系统疾病感染最重要的病原体,感染后可导致手足口病、无菌性脑膜炎、肺炎、疱疹性咽峡炎等,以上症状在患者中所占的比例分别为83％、11.1％、0.6％和1.2％[2].     

肠道病毒71型的分子病毒学研究进展

肠道病毒71(Enterovirus71,EV71)是导致婴幼儿感染的重要病原之一,自1974年首次报道以来,在世界范围内引起多次暴发与流行并且在我国地区的流行也呈上升趋势,该病毒感染具有较广的疾病谱,除引起大规模的手足口病暴发,也可引起严重的中枢神经系统感染,并可导致死亡,近年来受到人们的广泛关注.本文对EV71病毒生物学特征、分子流行病学、致病毒力及预防控制等方面的研究进展作一概述.     

肠道病毒71型中国分离株基因组3区的分析

目的 测定我国分离的肠道病毒71型(EV71)SHZH98株3C基因的核苷酸序列，进行遗传进化途径的分析。方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增我国分离的EV71-SHZH98株3C基因cDNA，测定PCR产物的核苷酸序列。结果 SHZH98株3C基因为549bp，和已发表的肠道病毒71型3C基因序列比较，SHZH98株与MS株同源性为78．7％，与BrCr株的同源性为76．7％，与台湾分离株POLY、NCKU、TW2086、TW2272株的同源性分别为74．0％、73．8％、71．9％、69．8％。由其核苷酸序列推导的氨基酸序列同源性比较显示与MS的同源性为93．45％，与BrCr、POLY、NCKU、TW2086、TW2272株的同源性分别为89．1％、90．7％、90．2％、84．2％、82．5％。遗传进化分析显示SHZH98株3C片段在亲缘关系上与Coxsackievirus A16 G-10株及欧美分离株MS、BrCr株较密切，而与台湾分离株相差较远。结论 推测EV71病毒中国分离株非结构蛋白的进化途径可能与台湾流行株不同。     

抗肠道病毒71型感染药物的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)的主要病原体,临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症[1].5岁以下的儿童感染后易发生严重的并发症,如无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等,这些并发症可导致死亡或永久性麻痹[2].至今,在全球许多国家发生了EV71感染的暴发,造成病例大量死亡[3-4].目前对于EV71感染既无有效的疫苗,也无明确有效的抗病毒药物[5-6].该病毒的复制周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配与释放,这些过程都可能成为抗病毒药物设计的靶点,按照作用的靶点不同将目前研究的抗EV71药物分为以下几个方面进行综述.     

广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体水平调查

目的调查广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体IgG（EV71-IgG）的水平,分析与EV71所致手足口病（HFMD）发病的关系。方法以来源于广州市妇女儿童医疗中心（我院）中心实验室分离到的EV71 C4亚型标本,制备EV71诊断抗原,建立EV71-IgG抗体诊断试剂盒方法,并进行实验室评价。收集2010年1~3月在我院儿保科抽血进行常规保健检测的标本,筛选出无发热、无HFMD症状的健康儿童血清标本,检测EV71-IgG抗体。选取我院2010年全年门诊及住院HFMD患儿的咽拭子标本进行EV71特异性核酸检测。结果①本研究建立的试剂盒EV71-IgG抗体检测临界值为0.148;与细胞中和实验方法阳性符合率为100%,阴性符合率为92%,与柯萨奇A16病毒抗体无交叉反应。②819名健康儿童血清标本中,男481名,女338名。〈1岁组（60%,60/100名）和~2岁组（39.3%,72/183名）EV71-IgG抗体阳性率显著高于其他各年龄组[~3岁、~4岁、~5岁和~14岁组分别为12.9%（15/116名）、27.1%（38/140名）、14.2%（16/113名）和22.8%（38/167名）]。EV71-IgG抗体阳性率无显著性别差异。③4 780例EV71阳性HFMD患儿中,男3 070例,女1 718例。〈1岁310例（6.5%）,~2岁1 157例（24.2%）,~3岁1 337例（28.0%）,~4岁1 094例（22.9%）,~5岁450例（9.4%）,~14岁432例（9.0%）。④各年龄组EV71-IgG抗体阳性率与EV71阳性年龄构成比呈相反趋势,〈1岁组EV71-IgG抗体阳性率最高,EV71阳性年龄构成比最低;~3岁组EV71-IgG抗体阳性率最低,EV71阳性年龄构成比最高。结论 〈1岁健康儿童EV71-IgG阳性率最高,EV71阳性年龄构成比与EV71-IgG阳性率呈相关现象。     

北京市2008年肠道病毒71型的RT-PCR鉴定及VP1区基因特征分析

目的 研究2008年北京市手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Human enterovirus 71,HEV71）的VP1编码区基因特征.方法 采集北京市朝阳区医院和幼儿园的HFMD患者标本共285份,进行HEV71特异性RT-PCR鉴定和病毒分离,随机选取10株HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析.结果 129份标本RT-PCR鉴定结果 为阳性,阳性率为45.26%.10株HEV71在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上的差异分别在94.6%～99.6%和95.9%～100%之间.北京朝阳HEV71分离株属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 RT-PCR法可以快速、准确地鉴定HEV71.引起本次HFMD流行的HEV71为C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,提示自1998年起,C4亚型的HEV71在中国大陆有较广泛的传播.加强对HEV71的分子流行病学监测,了解HEV71的基因特征,对预防和控制HEV71在中国的暴发具有重要意义.     

深圳5例肠道病毒71型手足口病病毒株遗传衍化分析

目的调查来源于2008年深圳5例EV71（Enterovirus71,EV71）型手足口病患者的5株肠道病毒71型的分子流行病学特点及其分子进化关系。方法通过病毒分离培养得到5株肠道病毒71型分离株,并对其进行全基因组核苷酸序：列测定,通过生物信息学软件分析,与既往其他国家地区分离株进行全基因序列分析比较,以及进化树分析。结果通过对VP1和VP4基因序列分析,5株病毒株均属于C4基因亚型。5株EV71分离株在全长核苷酸和氨基酸水平上差异都较小,其核苷酸和氨基酸同源性分别高于93．0％和98．0％,进化树分析提示2008深圳分离株与2004深圳株同源性最为接近,与2008安徽阜阳流行株和1998深圳株亦相距很近,死亡病例株与2008安徽阜阳株距离同源性最近（同源性为99．1％和96％）。结论推测这起疫情是由同一个病毒传播链引起的,本次流行株可能系1998深圳株演变而来。     

西安地区2008年肠道病毒71型基因特征分析

目的 研究西安地区2008年引起手足口病病原构成及EV71的基因特征.方法 采集124例临床诊断手足口病病例标本,RT-PCR检测肠道病毒血清型别;挑选EV71阳性标本进行病毒分离,扩增7株EV71病毒,扩增其VP1区,测序并与EV71各血清型代表株序列比对,进行进化分析.结果 2008年西安地区手足口病（HFMD）的病原中CA16占49.45%,EV71占30.76%,其他肠道病毒占19.78%.7株EV71 VP1区与标准株序列比对,亲缘进化分析显示本地区EV71与中国大陆其他地区毒株相似.结论 2008年西安地区引起手足口病的病原以CA16为主,而EV71属于C4亚型.     

肠道病毒71型手足口病的疫苗筛选和观察

目的 筛选安全有效新型EV71候选疫苗,为将来EV71疫苗开发应用奠定基础.方法 以重组蛋白VP1为疫苗设计靶点,不同候选疫苗包括灭活疫苗、DNA疫苗、VP1蛋白疫苗在0、2周、4周分别按照不同剂量和肌内注射途径免疫BALB/c雌性小鼠,在0、2周、4周、6周、8周、10周、16周分别采集小鼠尾静脉血,16周处死小鼠,收集小鼠脾脏细胞,检测小鼠体液免疫和细胞免疫功能,筛选评价候选疫苗的疗效和安全性.结果 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗免疫小鼠2周后IgG抗体滴度即开始升高,4周后明显升高,8周后达高峰,至少维持16周以上;IgG亚类以IgG2a和IgG1为主.三种疫苗能诱导以γ-IFN和IL-4为主的细胞免疫反应.灭活疫苗疗效优于其他候选疫苗,未发现疫苗相关不良反应.结论 灭活病毒疫苗、VP1 DNA质粒疫苗、VP1蛋白疫苗均能诱导持久的特异性细胞免疫和中和抗体反应,以灭活病毒疫苗疗效较好,需要将来攻毒实验可进一步验证其免疫力.     

宁夏2009年肠道病毒71型基因特征分析

目的 分析2009年宁夏回族自治区手足口病（Hand-Foot-and-Mouth Disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）分离株的基因特征.方法 2009年,从宁夏自治区344例HFMD病例中采集的385份标本,用人横纹肌肉瘤（Human Rhabdomyosarcoma,RD）细胞对标本进行肠道病毒分离培养;采用型特异性RT-PCR对阳性分离物中的EV71病毒进行鉴定;对鉴定的EV71毒株VP1编码区进行核苷酸序列测定分析.结果 共分离到肠道病毒126株,其中58株为EV71（46%）,对其中46株EV71的VP1编码区序列进行测定和分析.宁夏分离株与EV71的A和B基因型代表株核苷酸序列同源性分别为81.7%～82.8%和83.1%～85.2%,氨基酸序列同源性分别为93.9%～95.9%和96.2%～97.9%;与C基因型的C1、C2、C3、C4a、C4b和C5亚型代表株核苷酸序列同源性分别为88.3%～90.6%、88.3%～90.1%、87.8%～89.0%、94.2%～98.9%、91.8%～94.1%和86.7%～89.1%;氨基酸序列同源性分别为97.9%～99.6%、97.9%～99.3%、97.6%～98.9%、97.9%～100%、98.6%～99.6%和97.9%～98.9%.在系统发生树上,这46株毒株与C4基因型代表株聚为一簇,属于C4亚型中的C4a分支.结论 2009年EV71的C4a亚型在宁夏有较广泛的流行,是宁夏流行的绝对优势基因亚型,C4a也是我国2005年以来流行的优势基因亚型.     

Sequence analysis of the first C2 subgenogroup strain of enterovirus 71 isolated in Korea

BackgroundEnterovirus 71 (EV71) is an important causative agent of hand-foot-and-mouth disease with severe neurological complications, which may lead to death in children. Large outbreaks caused by EV71 have frequently occurred in Asia-Pacific region.ObjectivesIn Korea, the outbreaks have been caused by EV71 subgenogroups C3, and C4. Only genogroup C, especially subgenogroup C1, C3, C4, and C5, has been detected by the national enterovirus surveillance system in Korea. This study reports the first isolation of EV71 A1451 strain, which belongs to subgenogroup C2.Study designEV71 was isolated from a Korean patient with meningoencephalitis. Complete genome analysis and phylogenetic analysis was performed to identify the characteristics of the strain.ResultsComparative genome analysis of the A1451 strain indicated that this novel C2 strain is associated with the Taiwan strains, which are recombinant virus combined with subgenogroup C2 and B3.ConclusionsBecause the subgenogroup B3 was not previously detected in Korea, the A1451 strain is regarded as an imported recombinant virus. Periodic surveillance of EV71 is required to control the spread of this disease and its introduction from overseas.     

吉林省2009-2010年引起手足口病流行的肠道病毒71型基因特性的研究

目的分析引起吉林省2009--2010年手足口病（hand foot and mouth disease，HFMD）流行的肠道病毒71型的基因进化特征。方法选择31株2009-2010年分离于吉林省8个地市（州）HFMD病例的EV71代表株，对VP1编码区基因进行逆转录．聚合酶链反应扩增、扩增产物的序列测定，使用Bioedit软件和MEGA4．0软件对VP1基因进行同源性、基因亲缘关系分析。结果吉林省2009-2010年的31株EV71分离株均属于C4a基因亚型，3l株EV7t株在VP1区的核苷酸的同源性在94．5％～100％之间，分属于5个分支，其中25株病毒（分离于8个地市）形成一个大的分支，属于绝对优势传播链，其余6株形成4个小分支。结论2009-2010年在吉林省内有多个EV71C4a基因型的传播链同时存在，其中分支1为绝对优势传播链，在8个地市持续传播，引起HFMD的暴发流行。