MicroRNA-340在肝细胞肝癌中抑制细胞增殖并促进凋亡

目的 探讨微RNA-340(miR-340)在肝细胞肝癌中的表达特点及其对细胞生物学行为的影响.方法 收集重庆医科大学附属第一医院肝胆外科2015年3月至2016年9月收治的40例肝细胞肝癌患者手术后切除的癌组织和癌旁组织标本.通过qPCR检测组织标本中miR-340的表达,并分析miR-340表达与临床病理学指标的关系.分别培养肝癌细胞株Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721以及正常肝细胞株HL-7702,48 h后使用qPCR检测5种细胞中miR-340的表达水平.通过转染增加或抑制SMMC-7721细胞中miR-340的表达,然后分别于细胞培养24、48、72 h后采用CCK-8法检测SMMC-7721细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡.通过生物信息学软件预测miR-340的靶基因,并使用qPCR和蛋白质印迹法进一步验证miR-340对靶基因的作用.结果 癌组织中miR-340的表达低于癌旁组织(P＜0.01),并且miR-340的表达与乙肝表面抗原、HBV DNA载量、肿瘤大小以及临床TNM分期有关(P＜0.01).正常肝细胞HL-7702内miR-340的表达高于4种肝癌细胞Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721(P＜0.05,P＜0.01).增加miR-340表达可抑制SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01),而抑制miR-340的表达则促进SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01);增加miR-340的表达可促进SMMC-7721细胞的凋亡(P＜0.01),而抑制miR-340则减少凋亡(P＜0.01).生物信息学分析显示S期激酶相关蛋白2(SKP2)基因是miR-340下游的一个靶基因.qPCR和蛋白质印迹分析结果显示增加SMMC-7721细胞中miR-340的表达可抑制SKP2的mRNA和蛋白表达,抑制miR-340表达则增加SKP2的mRNA和蛋白表达.结论 miR-340的异常表达可能与乙肝病毒的感染有关,其异常表达有助于评价病情以及预后.在肝癌细胞系SMMC-7721细胞中,miR-340能够抑制细胞增殖并促进凋亡,这一作用结果可能是通过miR-340对SKP2的抑制而实现的.     

MACC1基因在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的 探讨MACC1基因在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其临床意义.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法 检测42例肝癌组织、对应癌旁肝组织以及17例正常肝组织中MACC1 mRNA的表达情况,并分析MACC1基因的表达与相关临床参数的关系.结果 MACC1基因在肝癌组织的表达水平显著高于癌旁肝组织(P＜0.01),在癌旁肝组织的表达水平显著高于正常肝组织(P＜0.05),且MACC1基因的表达水平与肝癌的TNM分期、肝内或淋巴结转移、门静脉癌栓等均明显相关(均P＜0.05),而与肿瘤个数、血清甲胎蛋白(AFP)水平、有无肝硬化等无明显关系(均P＞0.05).结论 MACC1基因可能在肝细胞癌的侵袭转移中发挥着重要作用,有可能成为肝癌治疗的新靶点之一.     

ARK5在肝癌组织中的表达及其对肝癌SMMC-7721细胞生长的影响

目的： 检测ARK5在肝癌组织及肝癌SMMC-7721细胞中表达水平,探讨其对肝癌细胞生长的作用。 方法： 采用PCR和Western blotting法检测30例肝癌组织及癌旁组织、正常肝细胞LO2及肝癌SMMC-7721细胞中ARK5 mRNA和蛋白表达水平;合成ARK5 的小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA,转染至SMMC-7721细胞分别为实验组和阴性对照组,同时设空白对照组,采用MTT法和流式细胞术检测各组肝癌细胞的增殖活性和细胞凋亡率。 结果： PCR和Western blotting法检测,肝癌组织和肝癌SMMC-7721细胞中ARK5 mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织和LO2细胞(P＜0.05)。MTT法检测,实验组24、48和72　h细胞生长抑制率分别为(19.39±5.42)%、(23.19±0.53)%和(20.74±1.23)%,均高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01);流式细胞术检测,实验组细胞凋亡率为(15.017±0.945)%,与空白对照组［(8.770±0.656)%］和阴性对照组［(8.763±1.201)%］比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论：ARK5在肝癌组织和肝癌SMMC-7721细胞中表达水平明显升高,抑制其表达可抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡,提示ARK5可能作为一种癌基因促进肝癌的形成。     

Research of the relationship between liver cancer stem cells and vasculogenic mimicry

目的 研究肝癌血管生成拟态(VM)形成与肝癌干细胞的关系.方法 在体外分别建立肝癌细胞株HCC97H、SMMC7721以及正常肝细胞L02三维培养,观察它们各自形成VM的能力.利用激光捕获显微切割技术分离出形成VM的肝癌细胞,RT-PCR和Western blot分别检测内皮相关分子VE-cadherin、CD31及肝癌干细胞标志物CD133和CD34表达水平.结果 ① HCC97H细胞在三维培养下形成VM; SMMC7721和正常肝细胞L02不形成VM;②激光捕获显微切割成功捕获目的 细胞;③各组中VE-cadherin mRNA和蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05).CD31在肝癌细胞中不表达.CD133 mRNA和CD34 mRNA在各组中表达差异有统计学意义(P＜0.05);CD133和CD34蛋白在各组间表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肝癌干细胞表达与肝癌细胞VM的形成有关.     

Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1促进肝癌细胞的转移

目的:探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)在肝癌中的表达及在肝癌侵袭中的作用?方法:荧光定量PCR(real-time PCR)检测肝癌及癌旁组织中ROCK1的mRNA表达水平,同时检测肝癌细胞系及正常人肝细胞中ROCK1mRNA表达水平,免疫组织化学染色(IHC)法检测肝癌及癌旁组织中ROCK1蛋白的表达量,并通过在肝癌细胞株中过表达及干扰ROCK1分析ROCK1蛋白对肝癌细胞转移的作用?结果:60对样本中有42对ROCK1的mRNA表达水平在肝癌组织中高于癌旁组织,免疫组织化学染色提示肝癌组织中ROCK1蛋白表达量高于癌旁组织?在体外肝癌细胞的功能实验中,过表达ROCK1能促进HepG2细胞的侵袭和转移,而干扰ROCK1的表达能减少SMMC-7721细胞的侵袭和转移?结论:ROCK1在肝癌组织中高表达,过表达ROCK1能促进肿瘤的侵袭及转移,ROCK1可能成为临床治疗中抑制肿瘤侵袭和转移的靶点?     

LETM1在肝癌中的表达及其对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨亮氨酸拉链EF-hand结构域跨膜蛋白1(leucine bnzipper/EF-hand-containing transmembrane proteinl,LETMl)在肝癌组织中的表达水平及通过RNAi技术靶向LETM1基因对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖及凋亡的影响.方法 采用免疫组织化学方法、Western blot检测重庆医科大学附属第一医院肝胆外科2012年9月至2013年4月共60例肝癌组织及其癌旁肝组织中LETM1蛋白表达情况.Western blot检测人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2及人正常肝细胞株LO2中的LETM1蛋白表达情况.将LETM1 siRNA经Lipofectamine 2000TM脂质体转染SMMC-7721(实验组为si-LETM1、对照组为si-NC),实时荧光定量PCR及Western blot分别检测LETM1转染后肝癌SMMC-7721细胞株中LETM1 mRNA及蛋白的表达.CKK-8及流式细胞术检测LETM1低表达对肝癌细胞增殖及细胞凋亡的影响.结果 ①免疫组织化学结果显示,LETM1蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为73.33％(44/60),明显高于癌旁组织中的表达率28.33％(17/60,P＜0.01);Western blot检测结果显示,LETM1蛋白在肝癌组织中的表达相对量(2.335±0.221)较癌旁组织(1.386±0.081)明显增高(P＜0.01).②LETM1蛋白表达与肝癌肿瘤直径及门静脉侵犯有关(P＜0.05),而与肝癌患者性别、年龄、甲胎蛋白、HBsAg、Edmondson分级及TNM分期无关(P＞0.05).③LETM1蛋白在SMMC-7721及HepG2中的表达相对量[(分别为(1.447±0.149)、(1.190 ±0.113)]均明显高于LO2[(0.918 ±0.027),P＜0.05].④si-LETM1组与si-NC组和空白组比较,si-LETM1组细胞的增殖受到抑制(P＜0.01),尤以72 h及96 h最为显著;si-LETM1早期细胞凋亡数(14.6±2.3)％与si-NC早期细胞的凋亡数(6.3±0.7)％比较,差异有统计学意义(P=0.04).结论 LETM1蛋白在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织;基因沉默LETM1后的肝癌细胞其增殖能力明显减弱,凋亡能力明显增强.     

不同类型原发性肝癌中干细胞的表达及其预后

目的 探讨不同类型的原发性肝癌组织中干细胞表达及其预后。方法 回顾性分析2015 年1 月～2017 年1 月期间在我院接受治疗的125 例原发性肝癌患者的诊治资料。选取患者的手术切除肝细胞性肝癌、肝内胆管细胞癌、肝硬化结节、混合型肝癌和癌旁组织标本,每组25 例。对五组标本进行免疫组织化学检测,比较上皮细胞黏附分子（EpCAM）、CD133 和CD90 在不同类型的组织中的表达及与临床特征和生存期的关系。结果 肝内胆管细胞癌、肝细胞性肝癌和混合型肝癌中CD133、EpCAM、CD90 的阳性率明显高于肝硬化结节、癌旁组织,差异有统计学意义（P＜0.05）。在三组肝癌组织中,CD90 表达阳性率明显高于EpCAM、CD133 阳性率,但差异无统计学意义（P＞0.05）。EpCAM、CD133 和CD90 阳性表达患者的肿瘤低分化比例、淋巴结转移比例和临床分期为Ⅲ/Ⅳ期的比例明显高于阴性表达者,其中位生存期短于阴性者,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 干细胞在原发性肝癌中高表达,但在不同类型的肝癌组织中的阳性率接近,干细胞参与了肝癌的发生和进展,是不良预后的标志之一。     

肾母细胞瘤过表达基因促进肝癌细胞的侵袭与转移

目的:探讨肾母细胞瘤过表达基因(NOV CCN3)在肝癌中的表达及在肝癌侵袭中的作用?方法:荧光定量PCR(real-time PCR)检测肝癌及癌旁组织中的CCN3的mRNA表达水平,同时检测肝癌细胞系及正常人肝细胞中CCN3的mRNA表达水平,Western blot检测肝癌及癌旁组织中CCN3蛋白的表达量;通过肝癌细胞过表达CCN3分析CCN3蛋白对肝癌细胞转移的作用;运用Transwell侵袭实验和划痕迁移实验研究CCN3过表达对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响?结果:50对样本中有39对CCN3的mRNA表达水平在肝癌组织中高于癌旁组织,Western blot提示肝癌组织中CCN3蛋白表达量高于癌旁组织?体外肝癌细胞的功能试验中,过表达CCN3能促进MHCC-97H?SMMC-7721细胞的侵袭与转移?结论:CCN3在肝癌组织中高表达,过表达CCN3能促进肝癌的侵袭与转移,CCN3发挥作用机制的研究能为肝细胞肝癌的治疗提供新的思路?     

MUC15在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨黏蛋白MUC15 在肝细胞癌中的表达及临床意义,并分析其和患者预后之间的关系。方法应用实时定量
RT-PCR法及Western blot法检测肝细胞系L02、肝癌细胞系HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721,以及122例肝癌组织、对应癌旁
非肿瘤组织中MUC15的表达情况;并分析MUC15的表达与相关临床参数及患者预后的关系。结果肝细胞系L02中MUC15
表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721（P<0.05）;MUC15在肝癌组织的表达水平显著低于癌旁非肿
瘤组织（P<0.05）,且MUC15 的表达与肿瘤的TNM分期、肝内或淋巴结转移、门静脉癌栓、病理分级等明显相关（P<0.05）;
Kaplan-Meier生存曲线表明MUC15的低表达是肝细胞癌患者预后差的指标。结论MUC15的表达与肝癌患者的临床病理特
征及预后密切相关,很有可能是肝癌患者预后的一个新的预测指标。
     

大肠癌CD133（＋）、Musashi-1（＋）干细胞与临床病理学因素及MGMT、ERCC1、TS关系的研究

目的探讨大肠癌CD133（＋）、Musashi-1（＋）干细胞与临床病理因素及MGMT、ERCC1、TS的关系。方法应用免疫组织化学方法（SP法）检测42例大肠癌组织的CD133、CD138、Musashi-1、MGMT、ERCC1、TS蛋白,对各指标之间的相关关系及其与临床病理学因素之间的关系进行分析。结果①CD133与组织类型、Dukes分级、静脉侵袭、远处转移及毛细血管密度（MVD）等有关（P〈0.05）;CD138、Musachi-1与组织类型、浆膜侵犯、静脉侵袭、淋巴管侵袭、淋巴结转移、远处转移及MVD等有关（P〈0.05）,CD138并与神经纤维间隙侵袭（NI）有关（P〈0.05）;CD133与CD138的表达呈负相关（P〈0.01）,与Musashi-1的表达呈正相关（P〈0.01）。②MG-MT、ERCC1与组织类型有关（P〈0.05）;TS与组织类型、Dukes分级、淋巴管侵袭、淋巴结转移有关（P〈0.05）;MGMT表达与ERCC1、TS表达呈负相关（P〈0.01）,ERCC1表达与TS表达呈正相关（P〈0.01）。③CD133、Mu-sashi-1的表达均与MGMT的表达呈负相关（P〈0.01）,与TS、ERCC1的表达呈正相关（P〈0.01）。结论①CD133（＋）、Musashi-1（＋）细胞在大肠癌的浸润与转移中起重要协同作用。②CD133（＋）、Musashi-1（＋）细胞与MGMT、TS、ERCC1耐药基因蛋白的表达具有密切关系,后者在大肠癌的侵袭中也具重要作用。     

N -甲基- D -天冬氨酸受体在肝细胞癌中表达与临床病理、预后的关系

 【目的】通过探讨N -甲基- D -天冬氨酸受体（NMDAR1）蛋白在肝细胞癌组织及其相应癌旁组织中的表达,分析其与肝癌患者临床病理因素及预后的关系。 【方法】采用免疫组织化学方法,检测135例肝细胞癌组织及其相应癌旁组织中NMDAR1蛋白的表达,通过统计分析其与临床病理因素和预后的关系。 【结果】在135例肝癌组织中NMDAR1阳性表达的有107例（79.3%）,且明显高于相应癌旁组织;相关性分析结果显示,NMDAR1在肝癌中高表达与肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤包膜、卫星结节和血管侵犯相关 (P < 0.05)。NMDAR1蛋白阳性表达的患者无复发生存期(P < 0.05)与总生存期(P < 0.001)明显较短。Cox多因素分析结果揭示,NMDAR1表达水平是肝癌患者术后无复发生存期与总生存期的独立危险因素之一 (P < 0.05),且具有重要的预后预测价值。 【结论】 NMDAR1蛋白在肝细胞癌组织中表达增加,且与肿瘤分化程度和侵袭转移相关;NMDAR1可作为预测肝癌患者预后的独立分子标志物。     

microRNA-133a在复发性肝细胞癌中差异表达及其生物学功能研究

目的 探讨miR-133a在不同复发时间间隔复发性肝癌中的表达差异,并研究其对肝癌细胞侵袭、迁移、增殖等生物学功能的影响。方法 通过miRNA芯片筛选复发性肝细胞癌病例差异表达的miRNA;将miR-133a mimic及inhibitor转染入人肝癌细胞株SMMC-7721,通过CCK8检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力;利用生物信息学方法预测miR-133a的可能靶基因。结果 芯片结果发现miR-133a在早期复发肝癌样本中表达明显升高;转染miR-133a的mimic或inhibitor入肝癌细胞SMMC-7721后,细胞增殖能力无显著差异(P>0.05);转染mimic后,细胞的侵袭及迁移能力明显增强(P<0.05),而转染inhibitor后,细胞的侵袭及迁移能力明显减弱(P<0.05)。结论 miR-133a的表达在不同复发间隔的肝细胞癌组间有显著差异,在短期复发肿瘤组织内明显升高;miR-133a可以促进肿瘤细胞的侵袭和迁移,而对增殖无明显作用,提示miR-133a水平升高可能通过促进肿瘤细胞侵袭从而增加肝细胞癌肝内转移复发风险。     

免疫负调控基因A20在肝癌中的表达及其真核表达载体的构建

目的 探讨免疫负性调控基因A20在肝癌中的表达并构建A20真核表达载体。 方法 采用免疫组化技术, 检测46例肝癌患者癌组织和癌旁组织中A20的表达情况, 并进一步构建A20真核表达载体, 测序正确后以脂质体法转染至SMMC-7721肝癌细胞系中, RT-PCR和Western blot检测转染后A20的mRNA和蛋白表达。结果 免疫组化结果显示, A20在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织, 差异具有统计学意义（P＜0.05）。A20的表达与肝癌分级分化和肿瘤大小有关（P＜0.05）, 成功构建A20真核表达载体, 并在SMMC 7721肝癌细胞系中获得高表达。结论 免疫负调控基因A20可能参与了肝癌的发生机制, 成功构建的A20真核表达载体可作为进一步研究的重要工具。     

CD105/CD133筛选鉴定SMMC-7721株干细胞表面标志物的实验研究

目的：观察人肝癌细胞株 SMMC-7721中膜抗原CD133、CD105的表达情况并对不同亚群的生物学性状进行体内外实验研究。方法以含10%胎牛血清的 DMEM 对SMMC-7721株细胞培养;采用流式细胞仪方法分选检测CD133、CD105在SMMC-7721中表达情况并分选出CD133+/CD105+、CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4个亚群;CCK-8和 Transwell侵袭实验分别检测4个亚群和未分选细胞组的增殖及侵袭能力,软琼脂克隆实验检测5组细胞成球能力;裸鼠成瘤实验了解 CD133+/CD105+、CD133-/CD105-亚群和未分选组的成瘤能力。结果流式细胞仪分选的 CD133+/CD105+、 CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4种细胞亚群的比例分别为1．61%、0．01%、97．88%和0．50%。 CD133+亚群的增殖和成球能力较 CD133-亚群及未分选细胞组强,而CD105+亚群侵袭能力较 CD105-亚群及未分选细胞组强。CD133+/CD105+组与CD133-/CD105-组及未分选细胞组相比成瘤所需的时间短、所需细胞数少、成瘤的体积大。结论 CD133在人肝癌细胞株 SMMC-7721中的表达与其增殖成球能力有关,CD105与其侵袭能力有关,CD133+/CD105+具有体内高度的成瘤能力。 CD133+/CD105+亚群在人原发性肝癌细胞株SMMC-7721中具有肿瘤干细胞特性。     

Inhibition of connective tissue growth factor overexpression decreases growth of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo

Background  We have previously found that connective tissue growth factor (CTGF) is highly expressed in a rat model of liver cancer. Here, we examined expression of CTGF in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells and its effect on cell growth.

Methods  Real-time PCR was used to observe expression of CTGF in human HCC cell lines HepG2, SMMC-7721, MHCC-97H and LO2. siRNA for the CTGF gene was designed, synthesized and cloned into a Plk0.1-GFP-SP6 vector to construct a lentivirus-mediated shRNA/CTGF. CTGF mRNA and protein expression in HepG2 cells treated by CTGF-specific shRNA was evaluated by real-time PCR and Western blotting. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized to evaluate the growth effect, and a colony formation assay was used for observing clonogenic growth. In vivo, tumor cell proliferation was evaluated in a nude mouse model of xenotransplantation. Statistical significance was determined by t test for comparison between two groups, or analysis of variance (ANOVA) for multiple groups.

Results  Immunohistochemical staining of CTGF was seen in 35 of 40 HCC samples (87.5%). CTGF was overexpressed 5-fold in 20 HCC tissues, compared with surrounding non-tumor liver tissue. CTGF mRNA level was 5–8-fold higher in HepG2, SMMC-7721 and MHCC-97H than in LO2 cells. This indicated that the inhibition rate of cell growth was 43% after knockdown of CTGF expression (P <0.05). Soft agar colony formation assay showed that siRNA mediated knockdown of CTGF inhibited colony formation in soft agar of HepG2 cells (P <0.05). The volume of tumors from CTGF-shRNA-expressing cells only accounted for 35% of the tumors from the scrambled control-infected HepG2 cells (P <0.05).

Conclusions  CTGF was overexpressed in human HCC cells and downregulation of CTGF inhibited HCC growth in vitro and in vivo. Knockdown of CTGF may be a potential therapeutic strategy for treatment of HCC.

     

Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究

目的 研究环状RNA hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的表达以及对肝癌细胞生物学功能的影响.方法 利用RT-qPCR检测环状RNA hsa_circ_0000711在肝癌细胞系的表达;通过小干扰RNA特异性敲低hsa_circ_0000711的表达;通过CCK-8实验检测肝癌细胞系的增殖情况;利用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡.Western blot检测下调hsa _circ _0000711后Cyclin D1、CDK4、 cleavaed Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达水平.结果 Hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC- 7721中明显高表达(P＜0. 05) .与对照组相比,hsa_circ_0000711干扰组的肝癌细胞增殖能力显著降低(P＜0. 05),处于G1期细胞增多(P＜0. 05),且凋亡细胞显著增加(P＜0. 05) .干扰hsa_circ_0000711的表达后,肝癌细胞中Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P＜0. 05),cleavaed Caspase 3蛋白表达量显著升高(P＜0. 05) .结论 Hsa_circ_0000711可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖.