排卵前成熟卵泡液对卵母细胞体外成熟的影响

目的 :探讨成熟卵泡液、促性腺激素对人类生殖泡期 (germinalvesicle,GV)不成熟卵母细胞体外成熟 (invitromaturation ,IVM)的影响。方法 :在基本培养液中加入 5 0 %成熟卵泡液 (folliclefluids ,FF) (Ⅰ组 )、或促性腺激素 (gonadotrophin ,Gn) (Ⅱ组 )或单用基本培养液即对照组 (Ⅲ组 )用于GV期卵母细胞的体外培养 ,观察成熟率及进一步发育能力。结果 :三组之间GVBD(生殖泡期破裂 )率差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,MⅡ期率和受精率 ,Ⅰ、Ⅱ组明显高于Ⅲ组 (P <0 .0 1)、Ⅰ组与Ⅱ组之间无差异 (P >0 .0 5 ) ;Ⅰ组卵裂至 8细胞的比例为 6 2 .5 % ,明显高于Ⅱ组的33.3% (P <0 .0 1)。结论 :GV期卵母细胞尽管在基本培养液中可完成核成熟 ,但胞质不成熟 ,加入 5 0 %FF或Gn均能促卵母细胞的成熟 ,两者相比 5 0 %FF效果更好。     

ICR小鼠卵母细胞通过旁分泌机制促进排卵关键过程

目的:利用国内医学研究常用ICR品系小鼠,在构建用于研究卵母细胞-卵丘细胞交互作用培养模型的基础上,研究卵母细胞及其产生的旁分泌因子生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)对排卵过程中的关键事件——卵丘扩展的调控作用?方法:通过显微手术制备摘除卵母细胞后的卵丘细胞复合体(OOX),并通过与卵母细胞共培养或GDF9和BMP15 处理研究卵母细胞及其特异释放的旁分泌因子对表皮生长因子(EGF)诱导卵丘扩展过程的调控?结果:成功构建了ICR小鼠OOX培养模型,发现卵母细胞及其释放的旁分泌因子GDF9和BMP15为EGF诱导卵丘扩展所必需?结论:ICR小鼠卵母细胞通过旁分泌机制促进排卵关键过程?     

小鼠生殖泡期卵母细胞体外培养成熟、受精和胚胎发育的研究

为研究性成熟小鼠生殖泡期(GV)卵母细胞的体外成熟,同时比较体外成熟(IVM)和体内成熟组卵子的受精、胚胎发育情况,机械法分离性成熟小鼠卵巢中的GV期卵母细胞及刺激后的成熟卵母细胞,直接培养于[α-MEM+1 mg/ml Fetuin+10％FCS+1.5 IU/ml rHCG±5 ng/mlrEGF]中,16 h后移入f-HTF+10％FCS体外受精4 h,再在M16+10％FCS中培养72 h。记录其成熟、受精和胚胎发育情况,并与体内成熟的卵子比较。结果:GV期卵母细胞在含HCG培养液中成熟率为89.68％,培养液中添加EGF后,卵子成熟率无显著上升,但受精率、卵裂率均有显著提高(P<0.05)。体内成熟卵子的受精率可达62.83％,卵裂率60.18％;IVM组受精率仅48.92％,卵裂率36.69％,明显低于前者(P<0.01)。结论:小鼠GV期卵母细胞可体外培养成熟、受精和胚胎发育。培养液中添加促性腺激素和EGF都促进卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育能力。但IVM组卵母细胞的受精率、卵裂率低于体内成熟组,培养系统仍需改进。     

氯化锌对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨氧化锌对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法采用细胞体外培养的方法,观察卵母细胞在分别含有低、中、高浓度(0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)氯化锌的M199培养液中体外成熟率和减数分裂的变化情况。结果1μg/mlZnCl2组GVBD发生率在4、8h明显高于对照组(P<0.01),16、24h高于对照组(P<0.05);而10μg/mlZnCl2组GVBD发生率在各时间点均明显低于对照组(P<0.01)。8h后,1μg/mlZnCl2组PB1排出率明显高于对照组(P<0.05),而10μg/mlZnCl2组PB1排出率明显低于对照组(P<0.05)。结论锌对体外小鼠卵母细胞成熟和减数分裂有重要的影响。     

LH与hCG对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的研究促黄体素（LH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法小鼠经注射孕马血清促性腺激素（PMSG）48h后，摘取卵巢获得未成熟卵母细胞，分别在含不同浓度的LH和hCG的成熟液中，或将LH和hCG以不同的浓度组合加入到成熟液，进行体外成熟。结果经15.16h的成熟培养，5个浓度LH组中的极体率均高于对照组，其中200IU/mL组显著高于50IU/mL、400IU/mL、300IU/mL组和对照组（P〈0.05）；5个浓度hCG组的极体率与对照组极体率无显著差异（P〉0.05）；协同组中15IU/mL hCG＋200IU/mL LH组的极体率显著高于对照组和其它各处理组。结论LH对小鼠卵母细胞的体外成熟有一定的促进作用。     

表皮生长因子对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的 探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对小鼠卵母细胞体外成熟及受精的作用.方法 在体外成熟液中分别添加0、0.1、1、5、10ng/Mlegf,12h后检查成熟率,并观察EGF对体外受精的影响.结果 添加5ng/Ml和10ng/Mlegf组卵母细胞第一极体排出率较对照组显著提高(P<0.05),并且5ng/Ml组的效果显著高于其他各组(P<0.05);比较培养液中添加以上浓度EGF对体外受精胚发育的影响,结果发现添加5ng/Ml EGF虽不能显著提高囊胚发育率(P>0.05),但可显著提高其通过二细胞阻滞率和囊胚孵化率(P<0.01).结论 EGF对小鼠卵母细胞体外成熟及受精有促进作用,可提高体外成熟率及囊胚孵化率,还可促进受精卵通过二细胞阻滞.     

卵母细胞体外成熟培养液的改良及研究

目的探讨卵母细胞体外成熟培养液的改良及研究。方法选取昆明小鼠50只作为研究对象,根据培养液的不同将50只小鼠分为A组和B组,每组各25只。A组采用低糖细胞培养基（DMEM）培养,B组采用含15％～20％胎牛血清的人类输卵管液培养,两组在相同条件下进行培养,比较两组的体外受精率、正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、可移植胚胎率、妊娠率及活产率。结果A组小鼠的体外受精率（71．4％）、正常受精率（65．7％）及卵裂率（89．1％）与B组（67．6％、68．1％、85．1％）比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;A组小鼠的优质胚胎率（31．7％）和可移植胚胎率（56．1％）均优于B组（25．0％、42．5％）,差异有统计学意义（X2=8．26、10．17,P〈0．05）。A组小鼠的妊娠率（23.3％）低于B组（32．6％）,差异有统计学意义（X2=7．58,P〈0．05）;但A组小鼠的活产率（17．8％）稍低于B组（18．9％）比较,差异无统计学意义（P〉O．05）。结论低糖DMEM培养液具有较好的应用效果,但仍需进一步的研奔．     

小鼠窦前卵泡的体外培养

目的 观察性成熟前小鼠的窦前卵泡体外培养的形态学改变,同时评价激素及生长因子等添加物对窦前卵泡体外发育的影响。方法 机械法分离性成熟前小鼠卵巢中的窦前卵泡,分2组培养于20μL培养液滴内。(1)Gn组:α-MEM 10％FCS 100 mU/mL rFSH±ITS(5 μg/mL insulin,5 μg/mL transferrine,5 ng/mLselenium)±10 mU/mL rLH,第12天移入 α-MEM 1.5 U/mL rHCG 5 ng/mL rEGF 10％ FCS。(2)nGn组:α-MEM 10％ FCS。每天换液观察,记录GC增生、窦形成等形态学改变和卵母细胞成熟情况。结果 激素组窦前卵泡增长明显,92.92％存活,28.65％形成窦,培养14d后40.35％排出成熟卵;而无激素组窦前卵泡生长缓慢,生存6d后开始萎缩、变黑,存活率仅10.91％,无窦卵泡形成,仅11.11％排出成熟卵,差异有显著意义(P<0.01)。激素组在添加ITS、LH后,窦前卵泡的窦形成率和排出成熟卵母细胞率均显著上升(P<0.05)。结论 α-MEM可作为窦前卵泡体外培养液,但必须添加rLH/rFSH、ITS、rHCG/rEGF以促进膜细胞黏附、颗粒细胞增生和卵母细胞成熟。     

卵母细胞体外成熟技术在体外受精-胚胎移植中的补救应用

目的对未成熟卵的体外成熟(IVM)技术在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的补救性应用进行总结,探讨影响其治疗结果的因素。方法在IVF-ET治疗中,对卵巢反应不良、卵泡发育迟缓和卵泡过多生长有发生过度刺激可能需要取消治疗周期的患者,在B超引导下经阴道卵泡穿刺术取卵后,对未成熟卵进行体外培养成熟后进行IVF或卵胞浆内单精子显微注射,良好胚胎进行移植。结果取卵周期33个,共获未成熟卵214个,进行体外培养后126个成熟;32个周期进行常规胚胎移植,8例临床妊娠,移植周期临床妊娠率为25.00%(8/32);7例分娩8个健康婴儿。结论未成熟卵IVM技术是IVF-ET治疗不孕不育中有效的补充方法,可以补救未成熟的卵,减少患者取消IVF-ET治疗周期的发生。     

降钙素基因相关肽对卵母细胞体外成熟的影响

目的:探讨降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法:6 周龄雌性昆明小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)10 U 48 h 后处死, 取出卵巢收集卵母细胞以30~40 枚/ 孔的密度接种于培养板内, 以不同浓度CGRP(0, 10^-10, 10^-9, 10^-8 mol/L) 处理24 h后检测生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD) 率和第一极体(polarbody I, PBI) 排出率;收集、培养人卵巢颗粒细胞, 以不同浓度CGRP(0, 10^-10, 10^-9, 10^-8 mol/L) 处理24 h 后测定颗粒细胞内cAMP 浓度。结果:外源性CGRP处理小鼠卵母细胞可浓度依赖性地降低GVBD 率及PBI 排出率;外源性CGRP 处理人颗粒细胞, 可浓度依赖性地增高细胞内cAMP 浓度。结论:CGRP 抑制小鼠卵母细胞成熟可能与其增加颗粒细胞内cAMP 浓度有关。     

冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取

目的 探求冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取。方法 取手术切除的5例患者的卵巢皮质，放入1．5mol／L的二甲基亚砜＋10％血清中，应用可控程序冻冰仪逐渐降温，移入液氮中冻存。3个月后，将融解的卵巢皮质移植入90只裸鼠皮下，注射hFSH12周，刺激卵泡生长。注射hCG36h后，用18号针头穿刺提取卵细胞。结果 卵巢直径为3～9mm，穿刺获19个卵细胞，放入TC-199培养基，加20％胎牛血清。25mmol／L丙酮酸，75mIU／mLFSH和LH培养，获15个分裂中期的次级卵母细胞。结论 人卵巢组织冻融后可异体移植生长，且其卵细胞可在体外发育成熟。     

表皮生长因子促进小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的实验研究

目的 了解表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟、受精及胚胎发育的影响.方法 将生殖泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞分别在EGF浓度为0(对照)、0.5、1、2.5、5、10 ng/ml的培养液中进行体外培养,观察生殖泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)和第一极体(the first polar body,PB1)排出的情况.将达到MⅡ期的卵母细胞进行体外受精,观察原核和胚胎发育情况.结果 EGF浓度为1、2.5、5、10 ng/ml组GVBD发生率高于对照组;EGF浓度2.5、5、10 ng/ml组PB1排出率高于对照组,其中EGF浓度5 ng/ml组的GVBD、PB1发生率最高(P＜0.01).卵母细胞在1、2.5、5、10 ng/ml EGF培养浓度下的退化率低于对照组(P＜0.05,P＜0.01).卵母细胞的体外受精率、2-细胞和4-细胞胚胎的发生率在EGF浓度为5 ng/ml时明显高于对照组(P＜0.01).结论 EGF可促进GV期卵母细胞的成熟,对其受精能力和胚胎发展也有促进作用,也可能有抑制卵母细胞凋亡的作用,而EGF以上作用与剂量有关.     

未成熟卵母细胞体外培养治疗不孕症的临床研究

目的:评价未成熟卵母细胞体外培养成熟(IVM)治疗不孕症的临床价值.方法:40例不孕患者接受54个IVM周期治疗,包括26例难治性多囊卵巢综合征(PCOS)和14例月经周期正常但经其他辅助生育技术失败的患者.测定卵泡早期的性激素、抑制素-A(INH-A)、抑制素-B(INH-B).未经任何药物刺激,于月经周期的9～12 d在超声引导下经阴道对两侧卵巢内的小卵泡进行穿刺获卵.体外培养24～48 h,进行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI),18 h后观察受精情况,继续培养24～48 h,直至胚胎移植,移植前行激光辅助孵化.结果:7个周期取消,取消率为13%(7/54).1例生化妊娠,19例临床妊娠,每取卵周期的临床妊娠率为35.2%(19/54),每移植周期的临床妊娠率为40.4%(19/47).47个移植周期共获得未成熟卵母细胞857个,平均每周期18.2个,体外培养48 h后总成熟率为73.7%(632/857),正常受精率为75.3%(476/632),卵裂率为91.2%.妊娠组的获卵数显著多于非妊娠组[(22.4±16.2)个vs(15.2±7.1)个,P＜0.05],取卵日和胚胎移植日的子宫内膜厚度显著大于非妊娠组[(8.0±1.5)cm vs(6.8±0.9)cm;(9.5±1.6)cm vs(8.3±1.3)cm,P＜0.05],但两组患者的年龄、不孕年限、体重指数、基础性激素、INH-A、INH-B各参数相比均无显著性差异.结论:未经药物刺激的IVM技术是治疗不孕症的一种有效方法,获卵数和子宫内膜厚度与成功率有关.     

The role of brain-derived neurotrophic factor in mouse oocyte maturation <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) can promote developmental competence in mammalian oocytes during in vitro maturation (IVM),but the role of BDNF in oocyte maturation at cellular level is not still clear.In this study,mouse cumulus-enclosed oocytes subjected to IVM were fertilized and cultured to blastocyst stage.Meiotic spindle configuration and cortical granules distribution during oocyte maturation in vitro were assessed by using immunofluorescence and laser confocal microscopy.The results showed that BDNF contributed to the complete preimplantation development of mouse oocytes compared to the control oocytes (13.78% vs.5.92%;P<0.05).Further,BDNF did not accelerate nuclear maturation of IVM oocytes.For the BDNF-treated oocytes at meiosis Ⅰ,Meiotic spindle areas were significantly smaller and the number of cytoplasmic microtubule organizing centers was greater than that in the control,and the percentages of oocytes showed spindles positioned near the oolemma and a well-formed cortical granule-free domain were significantly higher than that of the control.These morphological characteristics of the BDNF-treated oocytes were much closer to the oocytes matured in vivo than those of the control oocytes.In conclusion,BDNF can promote the developmental competence of mouse IVM oocytes,by improving the meiotic spindle configuration and location and cortical granules distribution at meiosis Ⅰ.     

逍遥丸对体外培养小鼠腔前卵泡卵母细胞骨形成蛋白6及其膜受体表达的影响

目的观察逍遥丸对体外培养第6天小鼠腔前卵泡卵母细胞骨形成蛋白6(BMP6)及膜受体的影响,探讨其干预卵母细胞质量的可能机制。方法12只雌性SD大鼠随机分为逍遥丸高、中、低剂量组和对照组,分别灌服逍遥丸混悬液2.7、1.8、0.9 g/kg和等量蒸馏水,第4天股动脉采血,得到逍遥丸高、中、低剂量大鼠含药血清和正常大鼠血清。机械法显微分离12日龄雌性昆明小鼠腔前卵泡,分为逍遥丸高、中、低剂量组和对照组。逍遥丸组分别以高、中、低剂量逍遥丸大鼠含药血清孵育,对照组以正常大鼠血清孵育,血清浓度均为10%。细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR分别检测体外培养第6天卵母细胞中BMP6、骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPRⅡ)、激活素受体样激酶(ALK)2、ALK6蛋白和mRNA表达。结果各组卵母细胞中均有BMP6、BMPRⅡ、ALK2、ALK6蛋白表达。与对照组比较,逍遥丸高、中、低剂量组BMP6、BMPRⅡ、ALK2、ALK6蛋白和mRNA表达均升高(P<0.05),以逍遥丸高剂量组最高(P<0.05)。结论逍遥丸可能通过上调卵母细胞中BMP6、BMPRⅡ、ALK2、ALK6表达,提高体外发育卵母细胞质量。     

高龄不孕症患者经自然周期排卵后继续黄体期促排的可行性分析

目的 对高龄患者经自然周期促排卵后继续黄体期促排的结果进行可行性分析.方法 收集在该院生殖中心进行体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)助孕的夫妇资料,分别采用经自然周期排卵后继续黄体期促排方案和常规方案,统计分析对照组和试验组基本资料和实验室各指标的差异.结果 两组的周期数、年龄、不孕年限、基础小卵泡数、基础卵泡雌激素及基础雌二醇比较差异均无统计学意义(P＞0.05);对照组的获卵数、成熟卵子数、第3天优质胚胎数、成囊率、冷冻胚胎数低于试验组,差异具有统计学意义(P＜0.05);对照组的两原核受精率略高于试验组,但二者之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 自然周期排卵后继续黄体期促排方案可提高高龄患者胚胎的数量和质量.