细胞因子诱导小鼠骨髓间充质干细胞跨越分化肝细胞的研究

目的 探索骨髓问充质干细胞(MSCs)体外跨越分化为肝细胞的诱导体系.方法 从单核细胞中分离间充质干细胞,用添加20 ng/ml HGF、10 ng/ml FGF-4、10 ng/ml OSM和10%NBS的IMDM培养液诱导间充质干细胞向肝细胞分化.结果 经细胞因子诱导的细胞出现肝细胞样变化,随诱导时间延长体积逐渐增大、形态往上皮样转变,胞浆丰富,出现双核或多核细胞.RT-PCR和免疫荧光检测结果显示,AFP在诱导初期表达,在诱导后期表达下降;CKl8、ALB和TAT的表达与诱导时间呈线性关系.第20天达到表达高峰;诱导20 d后免疫荧光检测,AFP、CKl8、ALB和TAT均为阳性;诱导20 d细胞的PAS糖原合成反应呈阳性,即具备糖原合成和储存的肝细胞特有功能.结论 HGF、FGF-4和OSM三种细胞因子组合,可诱导小鼠间充质干细胞向肝细胞分化,该结果为间充质干细胞跨越分化肝细胞的分子机制探讨和临床应用打下了基础.     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）联合成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor-4，FGF4）诱导人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HMSCs）向肝细胞方向分化的能力。方法分别用HGF、FGF4、HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞。在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）；免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、白蛋白（albumin，ALB）的表达；RT—PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果HMSCs经诱导向肝样细胞转化。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达，图像分析表明HGF＋FGF4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高，HGF次之，FGF4则较弱；免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达；各诱导组RT—PCR均可检测出AFP和ALBmRNA的表达，而阴性对照组则没有表达。结论HGF、FGF4、HGF＋FGF4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞，分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高。     

单层分步法诱导人胚胎干细胞定向肝样细胞分化

目的采用单层分步法诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)分化为肝样细胞,建立hESCs分化为肝细胞的诱导体系。方法将hESC株H1细胞接种到Matrigel包被的培养板上,早期(细胞贴壁4d后)加入含有细胞因子活化素A(Activin A)的分化液诱导5d;中期将诱导液换为含FGF-1和BMP-4的肝分化液诱导6d;最后添加肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和制癌蛋白M(Oncostatin M,OSM)继续诱导分化5～7d。采用免疫细胞化学染色、RT-PCR、过碘酸-雪夫(Periodicacid-Schiff,PAS)反应鉴定分化细胞的性质。结果经Activin A、FGF-1、BMP-4、HGF和OSM连续诱导的hESCs呈多角形、卵圆形或圆形,排列紧密;部分细胞出现二核或三核,呈现肝细胞所特有的形态。分化细胞在诱导早期表达SOX17、叉头框(Forkhead box,FOX)A2、GATA-4,中期表达甲胎蛋白(αfetoprotein,AFP)、白蛋白、角蛋白18,晚期表达成熟肝细胞特异性基因乙醇脱氢酶1C、细胞色素P4501B1。免疫细胞化学染色示,Activin A诱导后,细胞呈SOX17和FOXA2阳性;经FGF-1和BMP-4诱导后,呈AFP和α1抗胰蛋白酶阳性。HGF和OSM诱导后,PAS糖原染色检测阳性。结论采用单层分步法逐步添加细胞因子,可诱导hESCs分化为肝样细胞。该分化体系可为肝细胞移植、肝组织工程等临床治疗提供一个有效的细胞来源。     

小鼠骨髓干细胞向肝细胞转化的体外实验研究

目的建立以30 ng/ml FGF-4和30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,研究体外骨髓干细胞向肝细胞的转化过程中细胞形态、结构、功能的变化.方法建立以30ng/ml FGF,30ng/mlOSM为主的小鼠骨髓干细胞诱导培养体系.观察细胞形态和数量的变化;RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测肝细胞特异性标记物的表达;通过PAS糖原染色、白蛋白ELISA、尿素合成试验,检测细胞的合成和代谢功能.结果诱导12 d,观察到多极性的肝细胞样细胞,且逐渐增多、集落不断增大.在诱导过程中,不同的时间点可以分别检测到HNF-3βmRNA、ALBmRNA、CK18mRNA、TTRmRNA、G6-PasemRNA和TATmRNA的表达.诱导21 d,细胞表达HNF-3β、ALB、CK18蛋白;免疫荧光定位示ALB表达于胞浆和胞膜,而CK18表达于胞浆.诱导21 d,细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒;在诱导过程中,不同的时间点检测到细胞分泌ALB、合成尿素的量的变化.结论我们建立的以30ng/ml FGF、30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,可以有效地促进骨髓干细胞体外定向转化为肝细胞.     

体外诱导小鼠骨髓干细胞转化为肝细胞的实验研究

目的模拟体内肝脏发生发育的环境和条件，建立以细胞因子为主的体外诱导培养体系，探讨骨髓干细胞体外转化肝细胞的可行性。方法获取小鼠骨髓干细胞，建立以细胞因子为细胞诱导的培养体系。在细胞培养过程中，观察细胞形态和数量，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测肝细胞特异性基因的表达。Western blot和流式细胞仪检测ALB和CK18在蛋白水平的表达情况。糖元染色法行细胞糖原染色、尿素合成试验检测细胞的合成和代谢功能。结果在诱导培养12d，可以观察到多极性的肝细胞样细胞。且细胞逐渐增多、集落不断增大。诱导细胞在培养7d开始表达AFP mRNA并维持到第21天。此后表达逐渐减弱；培养7天开始表达ALB mRNA和CK18 mRNA。随着培养时间的延长表达不断增强；培养14d开始表达TTR mRNA，随着培养时间的延长表达不断增强。通过Western blot检测，诱导21d的细胞表达ALB和CK18蛋白，流式细胞术分析ALB阳性细胞的比例为60．45％，CK18阳性细胞的比例为67％。诱导培养21d，细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒；诱导培养6d，细胞开始合成尿素，尿素合成功能随诱导时间的延长而增强，于第15天达到高峰。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系能促使骨髓干细胞定向转化为肝细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

多因子联合诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞

目的 建立有效的体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)分化为肝细胞样细胞的培养体系.方法 将H9 hESC细胞株接种到基底膜提取物包被的培养板上,序贯加入含有下列诱导因子的分化培养基诱导分化:100μg/L细胞因子活化素A( activin A)诱导3d,20 μg/L骨形成蛋白4(BMP-4)和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导4d,10μg/L肝细胞生长因子(HGF)诱导5d,最后以含10 μg/L制瘤素M(OSM)及1×10-7 mol/L地塞米松(Dex)的培养液继续诱导4d.于细胞诱导分化第16天,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测分化细胞肝脏特异性基因和蛋白表达水平;过碘酸-雪夫反应(PAS)试验和吲哚氰绿(ICG)摄取试验检测分化细胞是否具备肝细胞功能.结果 activin A、BMP-4、bFGF、HGF、OSM和Dex联合诱导的分化细胞具有类似肝细胞的形态结构,呈多角形或卵圆形;RT-PCR结果显示分化第16天的细胞表达甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子-4α(HNF4-α)、1-抗胰蛋白酶(AAT)等肝脏特异性基因;免疫荧光化学检测结果显示分化第16天的细胞表达AFP、ALB、CK19、CYP7A1等肝脏特异性蛋白;PAS试验及ICG试验显示分化细胞具备糖原合成和ICG摄取释放等肝细胞功能.结论 体外联合多种诱导因子可诱导hESCs定向分化为肝细胞样细胞.     

小鼠骨髓干细胞体外定向诱导为肝细胞样细胞的实验研究

目的来源于骨髓干细胞的有功能的干细胞,可能成为生物人工肝和肝细胞移植的细胞来源。我们建立恰当的体外诱导培养体系,促使骨髓干细胞转化为肝细胞。方法获取骨髓干细胞,建立以FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系。在细胞分化过程中,观察细胞形态和数量的变化,RT-PCR检测基因表达的变化,免疫荧光染色技术在蛋白水平检测ALB和CK18表达情况。PAS染色检测其糖代谢功能。结果在诱导过程中,多极性的肝细胞样细胞在12 d内可以观察到,且其随着细胞分化过程逐渐增多、集落增大。诱导细胞在7 d内表达AFPmRNA并维持到第21天,但后期表达减弱;在7天内表达ALBmRNA和CK18mRNA,随着分化时间的延长,其表达不断增强;在14 d内表达TTRmRNA,随着分化时间的延长,其表达不断增强。免疫荧光染色进行定位:在诱导组,诱导21 d的细胞表达ALB和CK18,其中ALB表达于胞浆和胞膜,而CK18表达于胞浆。糖原染色发现诱导组中,细胞胞浆内出现大小不等的红染的糖原颗粒。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系是有效的,通过诱导骨髓干细胞,我们获得了有部分肝细胞形态结构和功能的肝细胞样细胞。     

肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外是否可定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法采用梯度离心法,分离纯化SD大鼠的MSCs,流式细胞仪检测和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。根据培养基中肝细胞生长因子(HGF)浓度不同,将MSCs分为4组进行诱导分化：A组0 ng／ml,B组10ng／ml,C组20ng／ml,D组40ng／ml。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的1,3,7,14,21,28 d,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞免疫组化检测各组细胞甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)和白蛋白的基因和蛋白表达。结果分离纯化的SD大鼠MSCs的表面标志为CD29^ ,CD44^ ,CD34^-,CD45^-和CD90^ ,细胞的碱性磷酸酶染色阴性,细胞纯度达98％以上。C组与D组的MSCs,于培养第7天出现AFP基因表达,第14天表达增强,第28天表达减弱;第14天始出现白蛋白、CK18基因表达,而后持续。B组和A组在培养过程中,未出现AFP、CK18和白蛋白的表达。C组与D组MSCs的AFP细胞免疫组化染色培养第7天即出现阳性,第14天白蛋白和CK18免疫组化染色阳性。A组和B组的MSCs的AFP、白蛋白和CK18的免疫组化染色均阴性。结论成年大鼠MSCs在较高浓度的HGF的诱导下,可分化为肝细胞。     

DNT细胞对肿瘤细胞作用的研究进展

DNT细胞(CD4-CD8-double-negative T cells)是新发现的一种免疫细胞,其特点是细胞表而既不表达CD4分子同时也不表达CD8分子.近年来,通过免疫疗法可以使肿瘤患者的愈后及生存质量得到很大的改善和提高.免疫细胞可以通过免疫调节或直接杀伤的途径作用于肿瘤细胞,因此研究DNT细胞对肿瘤细胞的作用将有重要意义.     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

Dendritic cells

Dendritic cells (DC) are the most effective or 'professional' of the antigen-presenting cells (APC) that initiate primary immune responses. They are located at surveillance sites where they capture and process antigens. They then initiate and regulate T- and B-cell responses by expressing lymphocyte costimulatory molecules, migrating to lymphoid organs and secreting biologically active molecules. Dendritic cells not only activate lymphocytes to induce the immune response, but they also minimize autoimmune reactions by tolerizing T cells to self-antigens. Recent Phase I and II clinical studies have shown promise in the use of antigen-pulsed autologous DC for vaccination of cancer patients. Dendritic cells also have applications in preventing rejection after transplantation, immunization against viral infections and immunosuppression in autoimmune diseases.     

干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展

睾丸间质细胞是男性体内产生雄激素的主要细胞。干细胞可被诱导分化为具有雄激素分泌功能的睾丸间质样细胞,从而使其功能受到下丘脑与垂体调控,精确分泌维持生理功能需要的激素。故建立一套可靠高效的将干细胞诱导为雄激素分泌细胞的方法,对于治疗由于睾丸间质细胞异常引起的性腺功能低下意义重大。本文对近年来关于干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展予以综述。     

T cells and B cells in lupus nephritis

T and B lymphocytes play diverse roles at multiple stages in the development and progression of lupus nephritis. Disruption of T- and B-cell regulatory functions by environmental and genetic influences permits pathogenic effectors to emerge in disease. New insights into the biology of these multifunctional cells offer novel targets for intervention in lupus nephritis and systemic autoimmunity.     

Stem cells and progenitor cells in renal disease

Stem cells and progenitor cells are necessary for repair and regeneration of injured renal tissue. Infiltrating or resident stem cells can contribute to the replacement of lost or damaged tissue. However, the regulation of circulating progenitor cells is not well understood. We have analyzed the effects of erythropoietin on circulating progenitor cells and found that low levels of erythropoietin induce mobilization and differentiation of endothelial progenitor cells. In an animal model of 5/6 nephrectomy we could demonstrate that erythropoietin ameliorates tissue injury. Full regeneration of renal tissue demands the existence of stem cells and an adequate local "milieu," a so-called stem cell niche. We have previously described a stem cell niche in the kidneys of the dogfish, Squalus acanthus. Further analysis revealed that in the regenerating zone of the shark kidney, stem cells exist that can be induced by loss of renal tissue to form new glomeruli. Such animal models improve our understanding of stem cell behavior in the kidney and may eventually contribute to novel therapies.