人源性甲状腺类器官的构建、鉴定及体外培养方案的优化

目的：构建及鉴定人源性甲状腺类器官(Adult-derived thyroid organoid, ADTO)模型;优化ADTO的体外培养方案。方法：选取甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma, PTC）患者癌旁正常甲状腺组织,消化得到解离的甲状腺细胞,以基质胶包埋,设计并加入不同甲状腺类器官条件培养基,显微镜下记录和比较一代和二代ADTO形成率和出芽情况。H-E染色观察ADTO模型的组织病理学形态,免疫组化染色检测甲状腺特异标志物NKX2-1、PAX8和TG表达情况,评估ADTO模型与正常甲状腺组织的一致性。结果：从7例PTC患者的手术标本中成功建立8例ADTO模型。ADTO培养体系中,提高Noggin和EGF浓度以及联用多种小分子抑制剂后,一代和二代ADTO出芽更多,球体更大,类器官形成效率更高。HE染色显示,ADTO模型具有滤泡结构、腺体样结构,且滤泡腔内含有胶质,与人体甲状腺组织结构特征相似。免疫组化染色显示,甲状腺标志物NKX2.1、PAX8和TG阳性,与来源组织生物标志物特征一致。 结论：成人甲状腺组织构建ADTO模型稳定、可行,此模型将为再生医学治疗甲状腺功能减退症提供方向。     

人肺鳞癌细胞系CHLH-1建立

目的:建立人肺鳞癌细胞系,探讨其生物学特性.方法:取人肺鳞癌新鲜手术标本,经组织块体外培养并克隆建系,命名为CHLH-1.采用光镜、电镜、染色体核型分析及异种移植瘤实验对细胞系生物学特性进行观察.结果:原位肿瘤、细胞系及移植瘤标本经光镜、电镜证实该细胞系具有鳞状上皮性恶性细胞特征,并观察了其体外生长曲线、倍增时间和分裂指数;染色体核型分析众数为60～68,为亚三倍体;裸鼠皮下异种移植形成移植瘤.结论:根据细胞系特征显示该细胞系是一新建的肺鳞癌细胞系.     

腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养

目的建立从腹膜透析(PD)流出液中培养人腹膜间皮细胞(HPMC)方法。方法从10例PD患者PD流出液标本中收集HPMC并在体外进行原代培养,采用相差倒置显微镜、扫描电镜和免疫组化染色对培养的细胞进行鉴定。结果8例PD患者流出液中HPMC在体外原代培养成活,经相差倒置显微镜观察原代培养的HPMC呈典型的铺路石样外观;免疫组化显示培养的HPMC胞浆角蛋白、波形蛋白表达均阳性,白细胞CD45抗原阴性;扫描电镜见培养细胞表面有许多长短不一呈丝状的微绒毛。结论成功建立了从PD流出液中HPMC原代培养方法,该方法将对进一步PD的研究提供实验基础。     

腹膜透析流出液中人腹间膜皮细胞的培养

目的建立从腹膜透析（PD）流出液中培养人腹膜间皮细胞（HPMC）方法。方法从10例PD患者PD流出液标本中收集HPMC并在体外进行原代培养,采用相差倒置显微镜、扫描电镜和免疫组化染色对培养的细胞进行鉴定。结果8例PD患者流出液中HPMC在体外原代培养成活,经相差倒置显微镜观察原代培养的HPMC呈典型的铺路石样外观;免疫组化显示培养的HPMC胞浆角蛋白、波形蛋白表达均阳性,白细胞CD45抗原阴性;扫描电镜见培养细胞表面有许多长短不一呈丝状的微绒毛。结论成功建立了从PD流出液中HPMC原代培养方法,该方法将对进一步PD的研究提供实验基础。     

小鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定

目的:建立小鼠肺微血管内皮细胞体外分离培养方法及对微血管内皮细胞的鉴定.方法:取小鼠肺组织边缘剪成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90μg/mL、L-谷胺酰胺4 mmoL/L、青霉素200 U/mL和链霉素200μg/mL的RPMI-1640培养基进行培养.纯化细胞进行Ⅷ因子相关抗原间接免疫组化染色和透射电镜观察Weilel-palade小体.结果:获得的内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态,Ⅷ因子相关抗原间接免疫组化染色阳性而且在透射电镜观察到Weilel-palade小体.结论:成功建立了小鼠肺微血管内皮细胞体外培养方法,并为体外研究肺微血管内皮细胞提供实验模型.     

小鼠小肠类器官体外培养体系的建立与应用

目的 建立一种研究肠上皮细胞的体外模型—小肠类器官培养体系，探索其相关病理检测技术方法，为肠道相关疾病的体外研究提供便利平台。方法 将小鼠肠上皮隐窝分离并培养成小肠类器官，体外模拟肠上皮的生长发育过程。通过制作石蜡切片，探索应用免疫组化技术以及基于基质胶中类器官三维水平免疫荧光技术对相应的增殖与分化信号进行检测。结果 探索并建立了小肠类器官体外培养体系，应用石蜡切片免疫组化技术与三维水平免疫荧光技术能够准确检测小肠上皮结构的生长发育状态。结论 小肠类器官体外培养体系的建立与免疫检测技术的应用，将逐渐使其成为人们研究肠道相关疾病最为有利的技术手段。     

携带TP53和ERBB2突变的肝细胞癌类器官的建立和培养

目的 探索肝细胞癌类器官的建立和培养,进行靶向测序和药物筛选,为患者个体化治疗提供参考。方法 将肝细胞癌患者肿瘤组织消化为单细胞后种于基质胶Matrigel中培养。HE染色观察类器官与原代肿瘤组织细胞形态,采用免疫组化验证类器官与原代肿瘤组织中细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白8(CK8)、p53、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)等分子表达情况,靶向测序检测类器官中肿瘤相关基因突变情况,根据靶向测序结果进行药物筛选,检测varlitinib、sorafenib、顺铂和nutlin3四种化合物对类器官活性的影响。结果 成功建立了携带TP53和ERBB2突变的肝细胞癌类器官,HE染色结果显示,类器官与原代肿瘤组织具有极为相似的结构和细胞特征。免疫组化结果显示类器官与原代肿瘤组织的CK7均为阴性,CK8、p53和GPC-3均为阳性。靶向测序结果显示类器官中突变基因有TP53(E271K, 100%), ERBB2(A1232V, 62.29%), RUNX1(E395A, 20.21%), AR(Q91dup, 70%)。细胞活力检测(CellTiter-Glo)结果显示,ERBB1/2特异性的抑制剂varlitinib和激酶多靶点抑制剂sorafenib对类器官的IC50分别为2.81μM和1.327μM,顺铂组的IC50为40.98μM,nutlin3对类器官生长无明显影响。结论 我们成功建立了一例携带TP53和ERBB2突变的肝细胞癌类器官,该类器官保留了原代肿瘤组织的结构和分子特征,药物筛选结果可能为该患者的个体化治疗提供参考。     

肺癌人源性肿瘤组织异种移植模型的组织学变化及其p63、napsinA和TTF-1的表达差异

目的建立肺癌人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived tumor xenograft,PDX)裸鼠模型,检测原代肺癌组织标本和第三代(F3)PDX模型组织标本内组织形态结构的变化和p63、napsin A和TTF-1的表达差异性。方法取临床肺癌新鲜手术切除标本12例,裸鼠皮下移植建立PDX模型,HE染色比较原代患者肿瘤组织与移植瘤组织结构和细胞形态变化与否;免疫组化的方法检测原代组织和F3代组织标本内p63、napsin A和TTF-1的表达水平的差异性。显微镜观察。结果成功建立传至第三代的PDX模型5例,4例肺鳞癌,1例肺腺癌。PDX模型和患者原代肿瘤具有相同的组织学特点和排列结构;p63在肺鳞癌患者及其PDX模型癌细胞中表达阳性率为84.3%和96%,两者之间差异无显著性(P0.05),而在肺腺癌中呈阴性表达。Napsin A在肺腺癌患者及其PDX F3癌细胞中阳性表达率分别为66%和72.4%,两者之间差异无显著性(P0.05)。TTF-1在肺腺癌患者及其PDX F3癌细胞中阳性表达率分别为91%和85%,两者之间差异也无显著性(P0.05)。Napsin A和TTF-1在肺鳞癌中均呈阴性表达。结论本实验室所建立的肺癌PDX模型基本保留了部分原代肿瘤的组织学特性,为临床前药效的个性化筛选评估以及生物标志物的鉴定提供了有效的研发资源。     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

胸腔积液细胞块切片免疫组化染色技术在肺腺癌诊断中的应用价值

目的：探讨胸腔积液细胞块切片免疫组化染色技术在肺腺癌诊断中的应用价值。方法：选取2017年1月—2023年5月南京市高淳中医院及宿迁市沭阳县中医院收治的80例疑似肺腺癌患者作为研究对象,采集患者的胸腔积液样本,分别行细胞涂片与细胞块苏木素-伊红染色法(HE染色),细胞块免疫组化染色技术检查,以病理检查结果为“金标准”,分析常规涂片HE染色、细胞块切片HE染色及细胞块切片免疫组化染色对肺腺癌的诊断效能。结果：病理检查显示恶性肺腺癌患者37例,占比46.25%。细胞块切片免疫组化染色准确率高于常规涂片HE染色与细胞块切片HE染色,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：胸腔积液细胞块切片免疫组化染色技术诊断肺腺癌的准确率较高,可以辅助临床诊断肺腺癌疾病。     

小鼠肠腺瘤类器官培养及其辐射敏感性

目的 建立小鼠肠腺瘤类器官的体外培养方法,观察其对电离辐射的反应。方法 采用氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和葡聚糖硫酸钠(detrain sodium sulfate,DSS)诱导小鼠产生肠腺瘤。体外分离腺瘤类隐窝结构,接种于基质胶。通过培养基筛选,确定肠腺瘤类器官的体外培养条件,采用免疫组化染色检测Ki67和β-catenin表达水平。进一步采用X线照射,观察肠腺瘤类器官损伤情况,比较其与大、小肠类器官的辐射敏感性。 结果 经AOM/DSS诱导,小鼠肠腺瘤成瘤率达95%,肿瘤均位于结肠靠近直肠处,肠腺瘤类器官在改良的小肠类器官中生长良好,Ki67阳性腺瘤细胞比例高且β-catenin入核特征明显。经X线照射,各类器官存活比例随辐射剂量增加而降低。9 Gy照射7天后,腺瘤类器官存活率为11.96%±1.42%,高于同剂量大肠类器官的5.46%±1.22% (t=6.0082,P＜0.01),小肠类器官几乎未见存活。腺瘤类器官剂量存活曲线较大、小肠类器官右移,提示其辐射敏感性低于大肠和小肠。 结论 在AOM/DSS诱导产生的小鼠肠腺瘤中成功分离培养出腺瘤类器官,其辐射敏感性低于大、小肠类器官。     

Clinical pathology of nodal micrometasteses in non-small cell lung cancer

ObjectiveTo explore whether the conventional pathologic stages of some non-small cell lung cancer (NSCLC) patients were underestimated.Methods195 lymph node samples were taken from 25 NSCLC patients during the operations. Firstly, each resulting tissue block was processed for routine paraffin embedding. Then the 6～10 serial sections were chosen, each 5 μm thick, from every paraffin block of the lymph node. Finally, the first and the second last sections of each lymph node were stained by hematoxylin eosin (HE), and the other serial sections were used for the immunohistochemical (IHC) staining examination with the monoclonal antibody against cyokeratin 19.ResultsWith HE staining, 30 of the 195 regional lymph nodes revealed dominant nodal metastases, and none showed micrometastases. IHC staining was performed on 135 lymph nodes that were identified as free of metastases by HE staining, 31 showed micrometastases; none showed gross nodal metastases. There was a significant difference between HE staining staging and IHC staining staging (P<0.05).ConclusionConventional HE staining can accurately detect gross nodal metastases in the lymph nodes of NSCLC patients, but is unfit for detecting lymph nodal micrometastases. IHC staining analysis can significantly facilitate the detection of occult micrometastatic tumor cells in lymph nodes, and its assessment of nodal micrometastases can provide a refinement of TNM stage for NSCLC patients. Our results provide a rationale for extensive lymph nodes sampling.     

CK19检测乳腺癌前哨淋巴结微转移的价值

目的 :探讨检测乳腺癌HE阴性的前哨淋巴结微转移对SNB预测腋淋巴结状态准确性的价值。方法 :以细胞角蛋白 19作为组织特异性标志 ,采用免疫组化的方法 ,对 32例HE阴性的 6 8枚前哨淋巴结的微转移灶进行检测。结果 :5例病人的 9个前哨淋巴结有微转移灶 ,其中 1例假阴性的 2枚前哨淋巴结均发现微转移灶。前哨淋巴结微转移灶的检出率是 13.2 % (9/ 6 8)。从而可使SNB预测腋淋巴结状态的敏感性从 95 .8%(2 3/ 2 4)提高到 10 0 % (2 8/ 2 8) ;准确性从 98.2 % (5 4/ 5 5 )提高到 10 0 % (5 5 / 5 5 )。结论 :应用CK19单抗检测乳腺癌HE阴性的前哨淋巴结微转移可提高SNB预测腋淋巴结状态的准确性     

肺和肺癌角蛋白免疫组化观察

本文比较正常肺组织和肺癌多克隆角蛋白免疫组化标记结果。10例围产儿尸检肺和31例癌旁组织的正常支气管及较大分支均阳性,程度由近端向末梢逐渐递减。支气管腺体中,浆液性腺泡阳性。鳞癌39例,每例均可查见数量不等的强阳性细胞;这对Ⅲ级鳞癌的诊断很有价值。腺癌20例,呈中度或弱阳性反应,分布较均匀;腺样结构和粘液分泌仍为诊断依据。差分化癌17例和小细胞癌6例以弱阳性为主。还结合文献进行讨论。     

Cal27裸鼠口腔癌转移模型的建立及其意义

目的 建立Cal27舌鳞癌动物正位移植瘤淋巴道转移模型, 为进一步研究口腔癌细胞转移的规律及分子机制提供帮助.方法 经口底将2×106 Cal27细胞悬液0.08 mL分别注射至24只裸鼠下颌舌骨肌与颏舌肌之间.成瘤后定期测量肿瘤体积, 记录裸鼠体重变化;14 d后处死裸鼠, 对组织切片型HE染色观察组织结构异型性和细胞异形性, 颌下淋巴结及肺、肝有无转移, 并统计转移率.结果 裸鼠在接种Cal27细胞第3天成瘤, 成瘤率100% (24/24) .HE染色示肿瘤组织呈典型鳞癌表现.颌下淋巴结内可见转移鳞癌细胞, 转移率70% (17/24) .肝、肺未见转移.结论 成功建立Cal27裸鼠正位移植瘤淋巴道转移模型.此动物模型能客观反应口腔癌生物学行为, 模拟口腔癌区域淋巴结转移的过程, 是研究口腔鳞状细胞癌侵袭转移较理想动物模型之一.     

CK19在口腔鳞状细胞癌转移淋巴结中的表达研究

目的：检测口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者淋巴结标本中细胞角蛋白19（CK19）的表达情况,寻找发现OSCC淋巴结转移及微转移的有效分子生物学手段。方法应用荧光定量RT- PCR检测8例OSCC患者的119枚淋巴结标本中CK19 mRNA表达水平,并与HE染色及免疫组化进行比较。结果 HE染色及免疫组化同时检测到CK19阳性淋巴结24枚,荧光定量RT- PCR检测到CK19阳性者48枚,HE染色及免疫组化结果CK19阴性而定量RT- PCR阳性的微转移淋巴结主要分布于颈Ⅱ区。淋巴结总体微转移率为20.17%。荧光定量 RT- PCR检测的CK19阳性淋巴结与 HE染色及免疫组化比较有统计学差异（χ2=22.04,P＜0.01）。结论对于OSCC淋巴结转移与微转移的检测,荧光定量RT- PCR对CK19 mRNA的检测较HE染色和免疫组化敏感,分子病理检测方法的应用可以有助于肿瘤的分期判断、预后评估及治疗方案的抉择。     

术中快速免疫组化检测早期乳腺癌前哨淋巴结的临床价值

目的 探讨术中快速免疫组化检测乳腺癌前哨淋巴结（SLN）CK19、端粒酶表达的临床实用价值.方法 以蓝染法对66例乳腺癌患者施行SLN活检,62例获得成功,该62例患者的117枚SLN进行快速免疫组化检测,以CK19、端粒酶为检测指标,以术中冰冻切片、术后连续石蜡切片和常规免疫组化以及术后腋淋巴结连续石蜡切片为对照.结果 SLN活检成功率达93.93%,冰冻切片对SLN的阳性检出率最低,连续石蜡切片次之,快速免疫组化检测SLN阳性检出率明显高于冰冻切片（P = 0.002）,而快速免疫组化检测与常规免疫组化检测SLN阳性检出率的差异无统计学意义（P = 0.961）.快速免疫组化检测预测腋淋巴结转移准确率达96.55%,CK19与端粒酶的灵敏度分别为96.36%、96.83%,特异度均为100%.结论 正确使用蓝染法可获得较高的SLN活检成功率,SLN的快速免疫组化检测方法具有快速、及时、准确的优点,能在术中即时为术者提供检测结果,从而拟定个体化治疗方案,使早期乳腺癌患者免受腋淋巴结清扫之苦.     

结直肠癌周围淋巴结CK20蛋白检测的临床应用研究

目的:探讨免疫组化(IHC)检测结直肠癌区域淋巴结微转移的细胞角蛋白20(CK20)对结直肠癌术后临床分期、预后判断和治疗干预的可行性和临床应用价值。方法:选取40例常规HE病理检查淋巴结转移阴性的结直肠癌患者为研究对象,术前抽取外周血行循环肿瘤细胞(CTCs)测定;术中、后沿亚甲蓝染剂标识的区域淋巴结按4站次淋巴结分别摘除、放置并标记,应用IHC技术检测淋巴结中CK20,统计淋巴结微转移患者的阳性例数及阳性率及其在各不同站次的分布情况,并对HE、CTC和IHC CK20方法检测的结果进行比较。结果:淋巴结CK20测定与HE染色法的淋巴结微转移阳性检出率间差异有统计学意义(P<0.01);不同站次间淋巴结微转移阳性检出率存在统计学差异(P<0.01或P<0.05);全组CK20检测有存在淋巴结微转移11例(11/40,27.5%);7例患者TNM分期提高,HE染色法重新分期率为17.5%(7/40)。全组CTC检测显现阳性7例,阳性表达率为17.5%(7/40),其中6例对应于IHC淋巴结CK20(+)患者,1例为IHC淋巴结CK20(-)患者,且CTCs细胞学分型表达与结直肠癌肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度呈正相关性。结论:CK20免疫组化法是检测淋巴结微转移可靠而敏感的方法,结合亚甲蓝染色法显影淋巴结可简便、快速地发现微转移灶,与CTC检测联用可达互补效能,进一步提高微转移检出率,减少假阴性发生。     

用激光捕获显微切割联合蛋白质芯片筛选肺鳞癌和腺癌组织差异蛋白

目的 应用激光捕获显微切割(LCM)联合表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)蛋白质芯片及支持向量机(SVM)方法筛选肺鳞癌和腺癌差异表达蛋白质,探讨二者在蛋白水平的差异,为筛选肺癌分型标志物提供依据.方法 将6例新鲜肺鳞癌及7例腺癌组织标本用LCM选择性获取1.4×105个同质鳞癌细胞和1.2×105个同质腺癌细胞.经PBS Ⅱ+型SELDI-TOF-MS分析仪(IMAC芯片)分析鳞癌及腺癌细胞蛋白质表达谱,比对差异峰;应用SVM筛选并验证候选标志蛋白的判别效能.结果 比较鳞癌和腺癌细胞的SELDI谱图,共筛选出87个蛋白峰.将差异最明显的10个蛋白峰作为候选标志蛋白.与腺癌相比,4种蛋白(相对分子质量分别为2505、4004、4847及11 412)在鳞癌中呈高表达;与鳞癌相比,6种蛋白(相对分子质量分别为3333、3592、3848、5036、5191及5211)在腺癌中呈高表达.其中相对分子质量为4847的蛋白在鳞癌和腺癌中表达差异有统计学意义.用SVM建立分类预测模型并评价各模型效能,筛选出一个由3种蛋白质(相对分子质量分别为4847、11 412和3592)组成的分型标志蛋白组合模式,其敏感度和特异度均为100%.结论 肺鳞癌和腺癌在蛋白水平存在差异;LCM联合SELDI蛋白质芯片技术有可能筛选出敏感性高、特异性强的肺癌分型标志蛋白组合模式.