噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽

目的：利用噬茵体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法：利用噬茵体展示技术体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective inter-activeligands,BRASIL）卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬茵体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬茵体竞争结合实验验证阳性噬茵体的亲和性。结果：噬菌体克隆Z3（短肽LRLRNTR）对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论：噬茵体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库中与受损内皮细胞特异性结合短肽的筛选

目的　筛选与受损内皮细胞特异性结合的短肽。方法　以氧化型低密度脂蛋白 (oxidizedlowdensitylipoprotein ,ox -LDL)损伤牛胸主动脉内皮细胞 ,用丝状噬菌体 (FUSE5 )表面展示的随机 6肽和 15肽文库进行混合筛选 ,通过DNA序列测定确定其插入的氨基酸序列。结果　经过 3轮筛选 ,得到一些特异性结合的噬菌体克隆 ,随机挑选 10个克隆 ,进行DNA序列分析 ,其中 8个克隆含 6肽序列 ,2个克隆含 15肽序列。结论　用噬菌体技术能筛到与受损内皮细胞亲和力高、结合力强的特异性短肽     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

肿瘤干细胞表面标记物CD133高亲和结合肽的筛选

目曲:应用噬菌体肽库技术筛选肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合短肽,为干细胞研究、肿瘤治疗及抗肿瘤转移研究提供新的技术和工具.方法:利用链霉亲和素与生物素的高度亲和力,以生物素标记的鼠CD133细胞外段(bio-CD133)为靶,对噬菌体七肽库进行液相筛选,应用夹心ELISA选择出结合较强的克隆,提取DNA并测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性.结果:通过三轮体外液相筛选,得到结合能力较强的高亲和结合肽,5条完全一致的重复序列为APSPMIW和3条完全一致的重复序列为LQNAPRS,竞争性阻断实验证实其特异性较强.结论:利用噬菌体肽库技术成功地筛选出具有较高亲和力和特异性的CD133结合肽,表明以生物素标记的小分子多肽为靶筛选结合肽的技术具有可行性.     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

从噬菌体肽库中筛选并鉴定CD13特异性结合肽

目的 筛选并鉴定可和单核细胞表面CD13分子特异性结合的特异性短肽.方法 以CD13为靶分子,用噬菌体展示十二肽库进行筛选,通过亲和富集法筛选表达有特异性结合肽的噬菌体,ELISA鉴定所挑选噬菌体和CD13的亲和力,根据噬菌体基因序列推导出多肽序列.对筛选到的并经比对分析认为有生物学特性的多肽进行人工合成,通过免疫荧光技术检测多肽和THP-1细胞的结合情况、位置及WM15对多肽和细胞结合的阻断作用.结果 经过四轮筛选,与CD13特异性结合的噬菌体得到有效富集并最终接近饱和状态.第4轮筛选后回收率与第1轮相比,富集了30倍.挑取的20个噬菌体单克隆中,经ELISA鉴定有10个和CD13的亲和力较高,有阳性意义.经比对得到2个有生物学功能的多肽序列P9、P7,它们分别和人巨细胞病毒(HCMV)UL38、UL105基因编码的相应氨基酸序列有83%、100%相似性.免疫荧光检测可见多肽P9、P7和THP-1细胞的结合位于细胞膜表面.WM15可以不同程度的阻断多肽和细胞的结合.结论 成功筛选出了2条可和CD13特异性结合的短肽P9、P7,而且P9、P7可以和THP-1细胞膜表面的CD13分子特异性结合.     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的：探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法：以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆（即实验组A450nm值高于对照组3倍以上）,并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果：经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高（P<0.05）;利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆（C4、C6、C7、C10、C11和C17）;通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性（P<0.05）;测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论：利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的:探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法:以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆(即实验组A450nm值高于对照组3倍以上),并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果:经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高(P<0.05);利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆(C4、C6、C7、C10、C11和C17);通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性(P<0.05);测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论:利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

津白Ⅱ小鼠体内筛选乳腺癌特异性结合噬菌体融合肽

目的：利用噬菌体随机肽库，筛选特异性靶向乳腺癌的肽段，为乳腺癌的定位诊断和靶向治疗提供理论依据。方法：建立津白Ⅱ（TAⅡ）小鼠自发乳腺癌模型，并在小鼠体内对噬菌体十二随机肽库进行4轮筛选，回收肿瘤和对照组织（肝）的噬菌体并计数，同时用免疫组织化学染色法，鉴定噬菌体展示肽的特异性。结果：筛选出自发乳腺癌特异性结合的噬菌体．其结合乳腺癌细胞的能力为对照组织的14倍，随机挑选克隆测序鉴定，结果表明十二肽ASANPFPTKALL出现次数最多．免疫组化染色进一步证明该噬菌体能特异结合于乳腺癌细胞。结论：4次小鼠体内筛选得到的短肽ASANPFPTKALL能够特异结合于乳腺癌组织。为下一步的定位诊断和靶向治疗研究奠定了基础。     

噬菌体肽库筛选转化生长因子βⅡ型受体亲和肽

目的:从噬菌体随机肽库中筛选转化生长因子β(TGF-β)Ⅱ型受体的亲和短肽。方法:以重组可溶性人TGF-βⅡ型受体作为靶标,应用噬菌体随机十二肽库进行筛选,经过3轮淘选,提取阳性噬菌体克隆ssDNA,测序并进行序列分析。结果:通过筛选噬菌体获得富集,挑选10个能与人TGF-βⅡ型受体特异性结合的噬菌体克隆,测序得到4个核酸序列,未发现共有保守序列。结论:通过噬菌体肽库技术能筛选出与TGF-βⅡ型受体结合的噬菌体展示肽,为进一步研究TGF-βⅡ型受体亲和短肽及在抗肝纤维化中的作用提供依据。     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的将激光显微分离(laser capture microdissection, LCM) 技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程,建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片,免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法,以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水,以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞,转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果利用LCM技术,可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽,应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选,可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽;同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染,为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。     

Endoglin特异性结合短肽筛选及功能分析

目的:对噬菌体随机12肽库进行筛选,寻求可与Endoglin结合的小分子短肽并测定其亲和常数.方法:经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定阳性克隆的DNA序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性,非竞争法ELISA固相法计算阳性噬菌体融合肽的亲和常数.结果:三轮生物筛选,噬菌体得到有效富集,竞争性ELISA显示6个阳性噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,测序获得5种多肽序列,优势序列为:AHKHVHHVPVRL,竞争抑制实验显示阳性噬菌体克隆与Endoglin有良好的亲和性,其亲和常数为:(1.431±0.293)×107 mol/L.结论:利用噬菌体肽库技术可以获得亲和力较强的Endoglin的结合肽,为今后进一步研究Endoglin在卵巢癌的早期诊断方面的作用奠定基础.     

应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的：将激光显微分离（laser capture microdissection，LCM）技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程，建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法：将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片，免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法，以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水，以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞，转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果：利用LCM技术，可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽，应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论：本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选，可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽；同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染，为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。