人胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

目的 建立纯度较高的适于试验研究的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶-DNase联合消化法培养人绒毛膜滋养层细胞，间接免疫染色进行细胞鉴定。透射电镜观察细胞内部结构。结果 倒置显微镜下，可见细胞呈不规则多角形，核大卵圆形，胞质透明，呈片状铺展生长，角蛋白染色阳性率超过95%，未检测到波形蛋白阳性细胞，表明不含污染细胞。透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构。结论 该法简便易行，可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞。     

人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

目的: 培养纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞, 为胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制研究提供细胞学基础.方法: 胰蛋白酶-DNase消化法培养人绒毛膜滋养层细胞,间接免疫染色进行细胞纯度检测,透射电镜观察细胞内部结构.结果: 倒置显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性,波型蛋白染色阴性,表明不含污染细胞.透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构.结论: 该法简便易行,可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞.     

米非司酮对孕7～9周人胎盘绒毛滋养细胞VEGF的影响

目的通过对比观察米非司酮对孕7～9周人胎盘绒毛滋养细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨米非司酮应用于人孕7～9周药物流产时的终孕机理,为临床上合理扩大米非司酮药流应用范围提供理论基础和实验参考依据。方法采用免疫组化法检测VEGF在米非司酮药流组与人流对照组(孕7～9周各12例)胎盘绒毛中表达的差异,了解米非司酮对孕7～9周人胎盘绒毛VEGF表达的影响。结果 VEGF主要表达于绒毛的滋养细胞和血管内皮细胞胞浆中,米非司酮药流组阳性表达较人流对照组弱(P0.01)。结论米非司酮作为孕激素受体拮抗剂,应用于人孕7～9周药物流产时,可通过降低VEGF在人早孕期绒毛滋养细胞中的表达,抑制胎盘血管的发育,进而不利于妊娠的维持。     

树突状细胞表面C型凝集素受体表达对绒毛外细胞滋养细胞生物学行为的影响

目的采用基因克隆技术构建C型凝集素受体（CLR）过表达／siRNA慢病毒载体,观察胎盘来源的树突状细胞表面CLR过表达或低表达对人绒毛外细胞滋养细胞（EVCT）侵袭力、黏附能力和凋亡的影响。方法通过质粒转染和RNA干扰技术获取过表达和低表达CLR基因的树突状细胞。将分离、培养及鉴定后的EVCT分别与过表达和低表达CLR基因的树突状细胞共培养（过表达组和低表达组）。采用体外侵袭试验、黏附能力实验和AnnexinV／PI双染法检测共培养对EVCT侵袭、黏附能力及凋亡的影响。以共培养前的EVCT作为对照组。结果过表达组EVCT的侵袭能力与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）,低表达组EVCT的侵袭能力明显弱于对照组（P〈0．01）。过表达组和低表达组与对照组的黏附率比值分别为（94．2±2．3）％和（52．8±1．5）％,低表达组EVCT的黏附能力明显下降（P〈0．01）。过表达组、低表达组和对照组的细胞凋亡率分别为（3．9±0．8）％、（8．2±1．4）％和（1．1±0．3）％,低表达组细胞凋亡率显著高于对照组（P〈0．01）。结论抑制树突状细胞表面CLR表达可使EVCT的侵袭力和黏附能力显著减弱,凋亡率显著增高;提示树突状细胞表面CLR表达异常可能是EVCT免疫损伤和子痫前期发病的重要机制之一。     

5-羟色胺对人胎盘滋养细胞L-型钙通道的影响

目的探讨5-羟色胺对胎盘滋养细胞钙通道的影响。方法将体外培养的胎盘滋养细胞分为对照组和低(1.0μmol/L)、高(10.0μmol/L)浓度5-羟色胺组。采用全细胞膜片钳实验方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入Nimodpine(10μmol/L)、Flunarizne(10μmol/L)和替曲朵辛(TTX10μmol/L),进行电流检测;同样的实验条件和方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入5-TH(1μmol/L和10μmol/L),测试电流值;在细胞外液中分别加入5-TH(1μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)、5-TH(10μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)后再检测电流。结果胎盘滋养细胞L-型钙通道开放在-60～-50mV之间,最大峰值电流在-40～-30mV为82.31±6.46(pA)。加入Nimodpine(10μmol/L),可阻断此电流大部分成份。Flunarizne(10μmol/L)和TTX(10μmol/L)不能抑制该电流成份。加入5-TH(1μmol/L和10μmol/L)峰值电流明分别为104.77±10.84(pA)和117.16±9.67(pA),与对照组相比有显著差异(P0.05);加入5-TH(1μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)、5-TH(10μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)后,峰值电流分别为85.35±6.54(pA)、89.42±7.62(pA),与对照组相比无显著差异(P0.05)。结论5-TH可激动胎盘滋养细胞L-型钙通道,促使钙电流值增加。     

miR-29b通过调控PTEN的表达对人绒毛膜滋养层细胞生物学行为的影响

目的:探讨microRNA-296(miR-29b)及PTEN对人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo)的增殖、迁移的作用以及两者之间的关系.方法:实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-29b和PTEN mRNA的表达;细胞增殖(EDU)检测miR-29b对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的情况;...     

人绒毛膜滋养细胞免疫血清制备的研究

人绒毛膜滋养细胞免疫血清制备的研究伍学洲，林淦柏（基础部微生物教研室）关键词人，绒毛细胞，免疫血清，制备方法人绒毛膜滋养细胞的免疫学的研究对于人类白细胞抗原的遗传、分化，及与生殖生理，包括胎儿同种移值、生殖病理、胎儿正常发育等具有重要理论意义，同时对...     

羟色胺对体外培养的人胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的：探讨5-羟色胺(5-HT)对胎盘滋养细胞凋亡的影响及其与妊娠高血压疾病发生、发展的相关关系。方法：将正常妊娠37~39周经剖宫产术获取的无菌胎盘滋养细胞分离、纯化、高糖型DMEM培养传代，第1～2代培养的细胞分成4组，加无菌蒸馏水对照组和加入0.1、1及10 μmol·L^-1浓度5-HT组，分别孵育培养3、6、12及24 h后，采用TdT末端转移酶介导的原位缺口末端标记法（TUNEL）检测各组培养的胎盘滋养细胞凋亡指数；采用电镜观察各组凋亡滋养细胞的超微结构。结果：10 μmol·L^-1 5-HT组培养3、6、12及24 h可使胎盘滋养细胞凋亡指数分别升至8.40±2.48、17.82±5.43、29.53±7.41及45.56±12.10，与对照组(1.21±0.97、2.30±1.24、3.89±2.32及7.34±5.59)比较，差异均有显著性（P<0.05）；1 μmol·L^-15-HT组在培养12及24 h可使胎盘滋养细胞凋亡指数升高至17.96±3.48、23.76±8.47，与对照组比较差异均有显著性（P<0.05）；0.1 μmol·L^-1 5-HT组胎盘滋养细胞凋亡指数与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。透射电镜下可见对照组及0.1、1和10 μmol·L^-1浓度5-HT处理组发生凋亡的胎盘滋养细胞均呈特征性的凋亡细胞改变：染色质固缩成块，核仁裂解消失，可见凋亡小体。结论：高浓度5-HT可促进胎盘滋养细胞凋亡，此机制可能与妊娠期高血压疾病的发生、发展有关。     

TNF-α对HBV体外感染人胎盘绒毛膜滋养层细胞的促进作用

目的:研究TNF-α对HBV体外感染人胎盘绒毛膜滋养层细胞的促进作用,建立HBV与人胎盘绒毛滋养层细胞相互作用的稳定体外感染模型.方法:绒毛膜癌细胞系JEGⅢ细胞作为滋养层细胞模型,分别在促感染因子TNF-α存在和不存在情况下,与HBV阳性血清(2×1012HBV DNA/L)共同孵育.感染后24 h,PBS充分洗涤感染体系,直至最后一遍洗液HBsAg阴性.加新鲜培养液继续培养,每隔12 h,收集培养标本,分别用Western blott,透射电镜,ELISA,和PCR检测培养物中HBV标志物.结果:在TNF-α不存在的感染环境下,细胞标本中HBV标志物呈阴性或弱阳性.而在TNF-α存在的感染环境下,细胞标本中HBV标志物呈阳性或强阳性,感染效率大大增强(P<0.01).但各时间点之间的感染效率差异不显著.结论:在TNF-α存在的环境下,HBV体外可以成功感染滋养层细胞.该体外细胞感染模型是深入研究HBV宫内传播机制的关键.     

全氟辛烷磺酸对人胎盘合体滋养细胞影响的研究

目的 研究全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)对人胎盘合体滋养细胞中糖皮质激素代谢酶11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ型(11β-HSD2)和胎盘合体滋养细胞凋亡的影响,探讨PFOS对胎儿的影响。方法 利用改良的Kliman法分离提纯原代人胎盘滋养层细胞,体外培养3 d,待滋养层细胞完全合体化为合体滋养细胞后,使用不同浓度的PFOS(0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)处理细胞,利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫印迹等方法检测PFOS对胎盘合体滋养细胞11β-HSD2的mRNA和蛋白质表达水平,以及酶活性的影响,检测PFOS对天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase3)蛋白质表达水平和酶活性的影响。结果 体外培养第1、2、3天,胎盘滋养层细胞中11β-HSD2的mRNA和蛋白质相对表达量逐渐升高,与未处理时(即第0天)比较的差异具有统计学意义(P值均<0.01)。0.01μmol/L PFOS处理的人胎盘合体滋养细胞11β-HSD2的mRNA和蛋白质相对表达量较未处理时显著降低,且11β-HSD2的mRNA和蛋白...     

米非司酮对LIF在人早孕期绒毛滋养细胞表达的影响

目的:通过对比观察米非司酮对白血病抑制因子(leukem ia inh ib itory factor,LIF)在人早孕期绒毛滋养细胞中表达的影响,探讨米非司酮对终孕的分子免疫机制。方法:采用免疫组化S-P法检测20例米非司酮药流终孕的早孕期绒毛滋养细胞中LIF的表达情况。20例人流终孕的正常早孕期绒毛为对照组。结果:米非司酮药流组滋养细胞中LIF的表达较人流对照组明显减少(P<0.01),其PU值(x-±s)分别为11.24±5.39,24.76±11.07。结论:米非司酮可明显降低LIF在人早孕期绒毛滋养细胞中的表达,进而不利于胚胎的生存。     

胎盘滋养细胞微绒毛膜和基底膜的制备

目的 改良制备胎盘滋养细胞微绒毛膜(microvillous membranes, MVM)和基底膜(basal membranes, BM)的技术,建立一个研究母胎界面物质交换的细胞分子模型.方法 在Illsley法基础上改良缓冲液成分,延长镁离子螯合BM的时间,低速离心后的上清液用于制备MVM,沉淀用蔗糖梯度纯化制备BM.结果 每克胎盘制备的MVM平均量为0.55 mg,其标记酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)为空白对照的16.87倍;BM的平均量为0.54 mg,其标记酶腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC) 为空白对照的11.19倍.结论 改良的Illsley法可以简单地同时制备较高质量的MVM和BM,有利于在细胞分子水平更好地研究胎盘滋养细胞功能.     

地塞米松对原代培养胎盘绒毛滋养细胞11β-HSD2表达影响的研究

目的 探讨地塞米松(DEX)对原代培养的早产胎盘绒毛滋养细胞11β-羟基类固醇脱氢酶2(11β-HSD2)表达的影响.方法 采用酶消化法和组织块培养法进行早产胎盘原代绒毛滋养细胞培养、纯化和鉴定;用DEX(100 nmol/L)模拟两疗程糖皮质激素给药干预原代堵养的绒毛滋养细胞,荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测滋养细胞11β-HSD2 mRNA及蛋白表达情况;此外在DEX干预的同时加入RU486(1 μmol/L),检测滋养细胞11μ-HSD2 mRNA和蛋白表达情况.结果 DEX干预原代培养滋养细胞,培养1 d后11β-HSD2 mRNA表达开始上升.第2 d和第3 d继续升高(P<0.05),第4 d改为无药物培养液后表达明显下降,第5 d～7 d重复给药后再次升高(P<0.05);在DEX干预的同时加入RU486(1μmol/L)共同作用,可见每天滋养细胞11β-HSD2蛋白和mRNA表达下降不显著(P>0.05).结论 重复给予DEX具有刺激原代培养的早产胎盘绒毛滋养细胞增加11β-HSD2蛋白和mRNA表达的作用}故早产胎盘滋养细胞可以通过词节11β-HSD2表达起到保护胎儿的屏障作用.     

抑制miR-206对子痫前期滋养细胞生物学行为的影响

目的 探究抑制miR-206对缺氧环境下子痫前期滋养细胞生物学行为的影响。方法 体外培养人绒毛膜滋养细胞HTR-8/Svneo细胞系,分为四组,分别为对照组、氯化钴(CoCl₂)组、CoCl₂+NC组和CoCl₂+miR-206 inhibitor组。miR-206表达量、细胞活力、形态、迁移、侵袭及上皮间质转化(EMT)情况分别采用实时荧光定量PCR(RTqPCR)、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、倒置显微镜、Transwell小室和蛋白免疫印迹(WB)法测定。结果 与对照组相比,CoCl₂组miR-206表达量和E-钙黏附蛋白(E-cadherin)表达水平升高,差异有统计学意义(t=9.838、22.013,P<0.05),而48 h细胞活力、迁移数、侵袭数、波形蛋白(Vimentin)和N-钙粘蛋白(N-cadherin)表达水平降低,差异均有统计学意义(t=4.349、17.657、5.503、20.937、11.137,P均<0.05)。与CoCl₂+...     

5一羟色胺对人胎盘滋养细胞L-型钙通道的影响

目的探讨5一羟色胺对胎盘滋养细胞钙通道的影响。方法将体外培养的胎盘滋养细胞分为对照组和低（1．01xmol／L）、高（10．0μmol／L）浓度5一羟色胺组。采用全细胞膜片钳实验方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入Nimodpine（10μmol／L）、Flunarizne（10μmol／L）和替曲朵辛（Trxl01．Lmol／L）,进行电流检测;同样的实验条件和方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入5-TH（1μmol／L和101xmol／L）,测试电流值;在细胞外液中分别加入5-TH（μmol／L）和Nimodpine（10μmol／L）、5-TH（10μmol／L）和Nimodpine（10μmol／L）后再检测电流。结果胎盘滋养细胞L-型钙通道开放在一60--50mV之间,最大峰值电流在一40～30mV为82．31±6．46（pA）。加入Nimodpine（10μmol／L）。可阻断此电流大部分成份。Flunarizne（10Ixmol／L）和’兀X（10肛m0ⅣL）不能抑制该电流成份。加入5-TH（1μmol/L和10μmol／L）峰值电流明分别为104．77±10．84（pA）和117．16±9．67（pA）,与对照组相比有显著差异（P〈0．05）;加入5-TH（1μmo]／L）和Nimodpine（101xmol／L）、5一TH（10μmol／L）和Nimodpine（10μmol／L）后;峰值电流分别为85．35±6．54（pA）、89．42±7．62（pA）,与对照组相比无显著差异（P〉0．05）。结论5-TH可激动胎盘滋养细胞L-型钙通道,促使钙电流值增加。     

人绒毛膜滋养层细胞的培养

取妊娠 ６～１０周的人妊娠早期绒毛膜,用胰酶／ＤＮＡ酶消化,换瓶纯化处理,经光镜和电镜检测证实,我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。     

人绒毛膜滋养层细胞的培养

取妊娠６～１０周的人妊娠早期绒毛膜,用胰酶／ＤＮＡ酶消化,换瓶纯化处理,经光镜和电镜检测证实,我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。     

胶原静电纺纳米纤维膜对人牙髓细胞生物学行为的影响

目的:比较人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)在胶原静电纺纳米纤维膜(collagen nanofibrous matrix,Col_NFM)与直接沉积胶原膜(collagen flat film,Col_FF)上的黏附、增殖和分化情况,探究胶原纳米纤维支架对hDPCs生物学行为的影响。方法:采用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察两种胶原膜的表面形貌,并比较其表面接触角和溶胀性能。将hDPCs分别接种于两种胶原膜表面共培养,SEM和激光共聚焦显微镜(laser scanning microscope,LSM)观察hDPCs在支架表面的生长形态,并用CCK-8法测定hDPCs的增殖情况。在诱导14 d后,比较成牙本质分化相关基因的表达变化,茜素红染色观察矿化结节的形成情况。结果:SEM图可见Col_NFM组纤维直径为(884±159) nm,纤维之间存在大量三维连通的孔隙结构,而Col_FF组表面平坦,未见孔隙结构。Col_NFM组瞬间表面接触角为85.03°±4.45°,溶胀度为3,Col_FF组瞬间表面接触角为98.98°±5.81°,溶胀度为1,Col_NFM组的亲水性和溶胀性能更佳。SEM和LSM结果显示,Col_NFM组hDPCs表现为不规则多角形,呈三维生长,Col_FF组细胞在二维平面上呈纺锤形生长。CCK-8结果显示,hDPCs在Col_NFM支架上增殖活性更高。在诱导14 d后,Col_NFM组成牙本质分化相关基因表达水平较Col_FF组显著升高(P<0.05),茜素红染色也更深。结论:Col_NFM具有纳米尺度的微观结构,并具备良好的亲水性和溶胀性能,相较于Col_FF,hDPCs在Col_NFM表面表现出更好的黏附、增殖和分化性能。     

人胎盘绒毛提取物体外对T细胞应答的抑制效应

目的:了解胎盘绒毛对T细胞应答的抑制能力及其在妊娠周期不同阶段的变化. 方法:制备孕10,20和37 wk的绒毛提取物,通过检测CD69和CD25分子的表达,评价其对T细胞活化的影响,WST-1法分析其对T细胞增殖的影响,流式微球阵列(CBA)法分析其对Th1/Th2细胞因子谱的影响,并以Western印迹法分析提取物中吲哚胺-2,3双加氧酶(IDO)的含量. 结果:孕早、中、晚期的胎盘绒毛提取物均能显著抑制植物血凝素(PHA)诱导的人T细胞活化,增殖,细胞因子分泌以及ConA诱导的小鼠T细胞活化(P<0.01). 但三个时期的提取物对上述不同T细胞行为的抑制强度不同,以20 wk提取物的抑制作用最强. 提取物中IDO蛋白的含量20 wk最高,37 wk次之,10 wk最低. 结论:妊娠不同时期的绒毛滋养细胞均能够抑制T细胞应答,但抑制强度不一致,且对T细胞不同行为的抑制存在分离现象,提示妊娠不同时期的绒毛滋养细胞表达抑制因子的模式不同.     

不明原因的胎盘绒毛炎时合体滋养细胞细胞间粘连分子-1的表达

目的:确定绒毛炎和足月(孕37～42周)伴或不伴绒毛炎胎盘的正常绒毛的合体滋养细胞细胞间粘连分子-1的表达。研究设计:进行横断面研究,以确定绒毛炎病例(n=16)和足月(孕37～42周)伴或不伴绒毛炎胎盘的正常绒毛(n=16)的合体滋养细胞细胞间粘连分子-1的表达。绒毛炎根据人白细胞抗原-DR和CD3诊断,并行苏木-伊红染色,应用细胞间粘连分子-1和细胞角蛋白抗体检测细胞间粘连分子-1在合体滋养细胞的表达。结果:绒毛损伤时,细胞间粘连分子-1的表达高于伴(19.9%vs3.5%,P<0.001)或不伴绒毛炎(19.9%vs0.31%,P<0.001)胎盘中的正常绒毛的表达。而伴绒毛…