miR-20a-5p调控成骨细胞分化相关靶基因的筛选及靶向关系验证

目的:筛选miR-20a-5p调控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p调控成骨分化的分子机制。方法:通过靶基因预测软件预测miR-20a-5p的靶基因,将靶基因的3′UTR及点突变序列插入荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）报告载体中,并与miR-20a-5p的模拟物或阴性对照共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶实验和GFP抑制实验检测荧光素酶活性及GFP阳性细胞比例,确定miR-20a-5p与靶基因的靶向关系。结果:通过生物信息学预测到Smad7是miR-20a-5p的靶基因,miR-20a-5p在不同物种的Smad7基因3′UTR区都有保守的结合种子序列;荧光素酶、GFP报告基因及点突变载体经PCR及测序鉴定均正确;双荧光素酶活性检测结果显示:miR-20a-5p显著降低Smad7 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性;GFP抑制实验及流式细胞仪检测结果显示:miR-20a-5p可以显著降低GFP阳性细胞的比例。结论:miR-20a-5p可以直接靶作用于Smad7 3′UTR的种子序列,提示其可能通过直接靶向Smad7基因来发挥促进成骨分化的调控作用。     

miRNA-375 靶向磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位 α 对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨miRNA-375 靶向磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位α（PIK3CA）对宫颈癌细胞增殖和 迁移的影响。方法 选取宫颈癌细胞系SiHa,分别转染miRNA-375 模拟基因、miRNA-375 抑制剂、对照模拟 基因及对照抑制剂,采用RT-PCR 法检测miRNA-375 表达,Western blot 检测PIK3CA 蛋白表达,MTT 法检 测细胞增殖活性,划痕实验检测细胞迁移能力。双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-375 与PIK3CA 的靶向 关系。结果 转染miRNA-375 模拟基因后miRNA-375 表达上调,PIK3CA 蛋白表达降低（P <0.05）;转染 miRNA-375 抑制剂后miRNA-375 表达降低,PIK3CA 蛋白表达增强（P <0.05）。转染miRNA-375 模拟基 因后SiHa 细胞增殖活性、迁移能力降低（P <0.05）;转染miRNA-375 抑制剂后SiHa 细胞增殖活性、迁移 能力增强（P <0.05）。miRNA 靶基因预测软件检测结果显示,miRNA-375 能作用于PIK3CA 3''-UTR。与转 染对照模拟基因比较,共转染miRNA-375 模拟基因与PIK3CA-WT 可使SiHa 荧光素酶活性降低（P <0.05）。 结论 miRNA-375 可抑制宫颈癌细胞增殖及迁移,其机制可能与靶向调控PIK3CA 有关。     

miR-455-5p在结直肠癌中的表达及生物学特性

目的探讨miR-455-5p在结直肠癌（CRC）中的表达及生物学特性。方法收集40例CRC患者经手术切除的结肠和直肠癌组织标本及癌旁10cm的正常黏膜组织标本。采用qRT-PCR法检测CRC组织及癌旁正常黏膜组织中miR-455-5p的表达水平;采用脂质体转染试剂转染CRC细胞,Brdu增殖实验检测转染后CRC细胞增殖能力,流式细胞仪检测转染后CRC细胞凋亡率。应用生物信息学方法预测并验证miR-455-5p的靶基因。结果CRC组织miR-455-5p的相对表达量低于癌旁正常黏膜组织（P＜0.01）。经转染后CRC细胞中,上调miR-455-5p可抑制CRC细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。数据库预测PIK3R1可能是miR-455-5p的靶基因,上调miR-455-5p可抑制PIK3R1mRNA及蛋白表达。结论miR-455-5p在CRC组织中呈低表达,其生物学特性是miR-455-5p具有抑制CRC细胞生长的作用,其机制可能与调控PIK3R1的表达有关。     

miRNA-4429靶向结合MCL1调控食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移与侵袭的机制研究

目的探讨miRNA-4429靶向结合髓样细胞白血病-1（MCL1）对食管鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。方法采用qRT-PCR法检测食管鳞状细胞癌细胞系和食管正常上皮细胞中miRNA-4429的相对表达量。采用脂质体转染法分别将miRNA-4429模拟物和模拟物对照转染至食管鳞状细胞癌EC9706细胞,分为实验组和对照组。应用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术和Transwell小室实验等探究miRNA-4429对食管鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。构建MCL1的3''非编码区（3''UTR）野生型和突变型荧光素酶报告基因载体,应用荧光素酶报告基因实验验证MCL1是否为miRNA-4429的靶基因。采用Westernblot法检测实验组和对照组MCL1蛋白的表达水平。结果4株食管鳞状细胞癌细胞中miRNA-4429相对表达量均明显低于食管正常上皮细胞（均P＜0.01）;而与对照组比较,实验组细胞中miRNA-4429相对表达量显著上调（P＜0.01）。实验组细胞OD值在72、96h均明显低于对照组（均P＜0.01）;与对照组比较,实验组细胞集落形成数明显降低（P＜0.01）。与对照组比较,实验组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。实验组细胞迁移数及侵袭数均明显低于对照组（均P＜0.01）。miRWalk、miRDB和miRTarBase预测结果表明,MCL1是miRNA-4429的作用靶基因。荧光素酶报告基因实验的结果表明,共转染MCL13''UTR-野生型荧光素酶报告载体后,与对照组比较,实验组荧光素酶相对活性降低（P＜0.05）;而共转染MCL13''UTR-突变型荧光素酶报告载体后,实验组与对照组荧光素酶相对活性比较差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组MCL1蛋白表达水平明显低于对照组（P＜0.01）。结论食管鳞状细胞癌细胞株中miRNA-4429相对表达量降低,上调miRNA-4429表达可减弱食管鳞状细胞癌EC9706细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,其作用机制可能与靶向结合调控MCL1的表达有关。     

COPD中MicRNA-320c-5p调节SERPINA1基因表达的研究

目的 通过双荧光素酶报告系统验证miR-320c-5p对SERPINA1基因的靶向调控关系。方法 从人正常肺上皮细胞基因组库中获取SERPINA1基因的3′UTR序列,并通过序列匹配拟定候选miRNA。利用3%香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)诱导人支气管上皮细胞(BEAS-2b细胞)建立慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)细胞模型作为实验组,正常培养的BEAS-2b细胞作为对照组,使用实时荧光定量聚合酶链反应(real time flurocent qualitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测两组SERPINA1和候选miRNA的表达水平。构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体,分别将双荧光素酶报告质粒(psiCHECK-2-SERPINA1-3′UTR和psiCHECK-2-SERPINA1-3′UTR mut)和miRNA质粒(miR-320-5p mimic)共转染到293T细胞,进行荧光活性测定。结果 通过序列...     

AKT2 3′-UTR荧光素酶报告基因载体构建及与miRNA-625靶向关系验证

目的: 通过构建荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系。方法: 通过生物信息学软件预测AKT2为miRNA-625靶基因;构建野生型AKT2基因3′端非翻译区荧光素酶报告基因载体及miRNA-625靶序列突变型载体;将HEK-293T细胞株随机分为野生型+miRNA-625组、野生型+miRNA内参组、突变型+miRNA-625组、突变型+miRNA内参组;Lipofectamine 2000转染相应的质粒与miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果： 构建野生型及突变型荧光素酶报告载体鉴定正确,双荧光素酶报告基因检测系统显示野生型+miRNA-625组相对荧光素酶活性较野生型+miRNA内参组明显降低(t=14.176 4,P<0.05)。结论： miRNA-625对野生型AKT2重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miRNA-625能够靶向调控AKT2基因。     

miR-98-5p靶向调控AKT2基因对人胃癌MGC803细胞增殖的影响

目的 探讨人胃癌MGC803细胞中miR-98-5p和AKT2基因的表达,阐明miR-98-5p对AKT2基因的靶向调控作用以及对MGC803细胞增殖的影响。 方法 培养MGC803细胞并应用免疫组织化学技术检测AKT2基因的表达;采用生物信息学方法对miR-98-5p和AKT2基因的匹配关系进行预测并用双荧光素酶报告基因系统鉴定;转染miR-98-5p模拟物后,行real-time PCR检测miR-98-5p和AKT2基因的表达,Western blotting检测AKT2蛋白的表达,MTT法和平板克隆形成实验检测癌细胞的增殖情况。 结果 倒置相差显微镜下可见人胃癌MGC803细胞呈梭形或多角形,少数呈类圆形;免疫组织化学染色显示胞质内有AKT2蛋白的表达,呈棕褐色。靶基因预测软件miRanda和TargetScan显示miR-98-5p和AKT2基因匹配良好,双荧光素酶报告基因系统鉴定发现miR-98-5p能够结合AKT2 mRNA 3'UTR并有效抑制其表达。Real-time PCR和Western blotting检测结果均表明miR-98-5p的过表达能够下调AKT2基因表达。MTT法和平板克隆形成实验表明,miR-98-5p的过表达能够抑制MGC803细胞增殖。 结论 miR-98-5p通过靶向作用于AKT2 mRNA 3’UTR负性调控人胃癌MGC803细胞中AKT2的表达,并抑制癌细胞的增殖。     

miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进脑出血大鼠神经元铁死亡

目的：探讨miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进脑出血（ICH）大鼠神经元铁死亡的机制。方法：使用大鼠神经元细胞为研究对象,采用氧合血红蛋白（oxyHb）刺激神经元细胞构建ICH体外细胞模型,分别将miR-152-3p inhibitor和（或）PIK3CA抑制剂分别处理细胞,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,RT-qPCR、Western blot检测相关基因和蛋白表达情况;并用细胞免疫荧光观察Nrf2蛋白的入核率;用双荧光素酶靶标实验验证miR-152-3p与PIK3CA的关系。结果：将miR-152-3p inhibitor转染的细胞构建ICH细胞模型后,细胞凋亡率明显降低（P<0.01）;SLC7A11、GPx4、PIK3CA、Nrf2蛋白表达水平以及p-AKT/AKT比率显著升高而GSK-3β蛋白表达水平显著降低（P<0.01）;同时,Nrf2蛋白入核量也显著升高（P<0.01）;而此作用在使用PIK3CA抑制剂干预后,miR-152-3p inhibitor的改善效果消失;荧光素酶靶标实验证实,miR-152-3p可靶向调控PIK...     

miRNA-126-3p 与先天性心脏病肺动脉高压发病机制相关性的临床研究

目的：探讨 miRNA-126-3p 与肺动脉高压（以下简称肺高压）发病机制的相关性。方法选取25例先天性心脏病患者,其中,肺高压患者11例,对照组14例,采用 qRT-PCR 法检测其肺组织 miRNA-126-3p 的表达,并采用 starBase 进行靶基因预测,并从 mRNA 水平和蛋白水平进行验证。结果肺高压患者与对照组在年龄、性别、生化指标检查等方面比较差异无统计学意义（P＞0．05）;肺高压患者 miRNA-126-3p 表达水平与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．01）;生物信息学预测发现 miRNA-126-3p 的生物学功能主要与结合蛋白、信号转导、细胞分化、调控细胞形态、调控 MAPK 和胰岛素受体信号通路等有关,其靶基因主要有 VEGFA 、SPRED1、PIK3R2等;肺高压组的 VEGFA 表达在 mRNA 水平和蛋白水平与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．01）;miRNA-126-3p 与 VEGFA 呈现正相关（P＜0．01）。结论 miRNA-126-3p 可能通过调控 VEGFA 参与先天性心脏病相关性肺动脉高压发病。     

MicroRNA-212-3p与靶基因转化生长因子-β2基因3'UTR的关系研究*

目的?构建转化生长因子-β2（TGF-β2）基因3''UTR双荧光素酶报告质粒,分析microRNA-212-3p（miR-212-3p）与其潜在靶基因TGF-β2的靶向关系。方法?将TGF-β2 3''UTR片段构建至双荧光素酶报告载体pYr-MirTarget上,随后将重组质粒与miR-212-3p核苷类、无核苷类及其抑制剂共同转染Saos-2细胞（人成骨肉瘤细胞）,通过双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性,RT-PCR检测Hsa-miR-212及TGF-β2基因的mRNA相对表达量,Western blotting检测TGF-β2蛋白相对表达量。结果?miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3''UTR共转染组荧光素酶活性较对照组低（P?<0.05）。miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3''UTR共转染组Has-miR-212 mRNA相对表达量最高,miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3''UTR共转染组最低（P?<0.05）。miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3''UTR共转染组TGF-β2 mRNA相对表达量最低,miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3''UTR共转染组最高（P?<0.05）。miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3''UTR共转染组TGF-β2蛋白相对表达量最高,miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3''UTR共转染组最低（P?<0.05）。结论?该实验成功构建了TGF-β2基因3''UTR荧光素酶重组质粒,而且miR-212-3p可以与TGF-β2基因的3''UTR结合,抑制荧光素酶活性,由此推断TGF-β2是miR-212-3p的靶基因。     

人 MicroRNA335的预测靶基因 CCL11 CCL26及 SOX4的鉴定

目的：验证人 MicroRNA335(hsa-miR-335)与嗜酸细胞趋化因子1(CCL11)、嗜酸细胞趋化因子3(CCL26)、SOX4的靶向调控关系。方法选择网络在线的生物信息学软件 miRanda 和 TargetScan 共同预测为 hsa-miR-335靶基因的 CCL11、CCL26、SOX4作为研究对象。构建 CCL11、CCL26、SOX4基因3′端非翻译区(3′UTR)双荧光素酶报告基因载体 pMIR-RE-PORT-CCL113′UTR、pMIR-REPORT-CCL263′UTR、pMIR-REPORT-SOX43′UTR;采用 Lipofectamine 2000将真核表达质粒pMIR-REPORT-CCL113′UTR、pMIR-REPORT-CCL263′UTR、pMIR-REPORT-SOX43′UTR、阳性对照质粒分别与 Pre-miRTM miRNA335 Precursor 或阴性对照质粒共转染到293 T7/17细胞;双荧光素酶报告基因检测系统检测 CCL11、CCL26、SOX4基因3′UTR 与 Hsa-mir-335共转染萤火虫(Firefly)和海洋腔肠(Renilla)荧光素酶活性,并与阴性对照对比。结果hsa-miR-335对SOX4的荧光表达有显著的抑制作用(P <0.01),但并不影响 CCL11、CCL26荧光素酶活性(P >0.05)。结论hsa-miR-335可靶向调控 SOX4,而对 CCL11、CCL26的表达无影响。     

miRNA-455-3p对HCT116结肠癌细胞迁移、侵袭的影响及机制研究

目的 探讨miRNA-455-3p对HCT116结肠癌细胞迁移、侵袭的影响及机制研究.方法 采用脂质体LipofectamineTM 3000将miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转入HCT116结肠癌细胞中,Real-time PCR检测细胞中miR-455-3p表达,MTT法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、MMP9、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路相关蛋白的表达.结果 与miR-455-3p NC组比较,miR-455-3p mimics组miR-455-3p表达量显著提高(P＜0.01),细胞活力、迁移能力、侵袭能力均显著降低(P＜0.01),MMP2、MMP9、PI3K及p-AKT表达量均显著下调(P＜0.01).结论 miR-455-3p mimics可能通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制HCT116细胞的迁移及侵袭.     

miR-483-5p靶向Timp2调控破骨细胞的生成

目的：miR-483-5p可促进破骨细胞分化和骨破坏，本研究探讨miR-483-5p是否通过靶向作用于Timp2调控破骨细胞的生成。方法：采用miRNAs靶基因预测软件Target Scan8.0对miR-483-5p的靶基因进行预测，并构建野生型和突变型3’UTR质粒，通过双荧光素酶报告基因验证靶基因是否与miR-483-5p存在靶向调控关系。用免疫印迹方法检测miR-483-5p的mimics或inhibitor转染细胞后靶蛋白表达水平的相应变化。用靶基因si RNA或靶蛋白慢病毒转染或感染细胞，RANKL诱导后分别进行TRAP染色和q-PCR检测。结果：运用生物信息学软件预测miR-483-5p的靶基因，发现具有调控破骨细胞作用的Timp2基因，且双荧光素酶报告基因检测系统发现miR-483-5p可以与预测的靶基因Timp2基因的3′-UTR位点互补，两者之间存在靶向调控关系。在RAW264.7细胞中上调miR-483-5p水平可减少Timp2的表达；敲低细胞中的Timp2，诱导后较正常组破骨细胞数量显著增多，且破骨细胞特异性基因表达升高。将靶基因和miR-483-5p共转染入细...     

miR-21在结肠癌细胞失巢凋亡调节中的作用及机制研究

目的:探讨miR-21在结肠癌细胞失巢凋亡调节中的作用及机制。方法:qRT-PCR检测30例结肠癌组织中的miR-21表达,并评估其与临床病理特征和预后的关系;利用结肠癌HT-29细胞及其失巢凋亡抵抗亚群HT-29/AR细胞探讨miR-21表达水平与失巢凋亡抗性的关系;Western blot检测PDCD4、PTEN蛋白表达水平变化,并利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-21对其3’UTR的直接结合作用。结果:miR-21在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移状态及TNM分期显著相关,其高表达患者预后较差;与HT-29细胞相比,HT-29/AR细胞miR-21明显上调,且miR-21模拟物转染可以明显提高HT-29细胞的失巢凋亡抗性;Western blot及双荧光素酶报告基因实验证实miR-21可通过抑制PDCD4和PTEN蛋白表达水平增加结肠癌细胞的失巢凋亡抗性。结论:miR-21可通过靶向抑制PDCD4和PTEN表达参与人结肠癌细胞失巢凋亡的调控。     

miRNA-224-5p靶向JAG1抑制乳腺癌细胞自噬活性的机制研究

目的探讨miRNA-224-5p靶向JAG1抑制乳腺癌细胞自噬活性的机制。方法收集2017年1月至2018年9月在台州市中心医院接受手术治疗的40例乳腺癌患者（乳腺癌组）及同期性别、年龄相匹配的40例健康体检者（健康对照组）的血清。采用实时定量逆转录-聚合酶链反应检测血清中miRNA-224-5p的表达;采用免疫印迹试验检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中miRNA-224-5p的表达与自噬活性的关系。采用生物信息学的软件TargetScan7.2和MiRDB预测miRNA-224-5p作用的下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验对预测的靶基因进行验证。结果乳腺癌组血清miRNA-224-5p相对表达量为188.51±59.26,明显高于健康对照组的41.63±14.29,差异有统计学意义（P＜0.05）。在MDA-MB-231细胞中,抑制miRNA-224-5p的表达后自噬活性增加。双荧光素酶报告基因实验验证JAG1为miRNA-224-5p的靶基因。结论miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中高表达,在MDA-MB-231细胞中miRNA-224-5p通过靶向JAG1抑制自噬活性。     

微小RNA-506-3p调控UHRF1抑制大肠癌细胞转移的机制

目的 探讨微小RNA-506-3p(miR-506-3p)通过调控含PHD及指环结构域的类泛素蛋白1（UHRF1）的表达,进而影响大肠癌细胞转移能力的机制。方法 利用生物信息学的方法预测并筛选UHRF1上游可能发挥调控作用的miRNA-506-3p;在大肠癌细胞及组织中分别检测miR-506-3p及UHRF1的表达水平并分析其相关性;运用荧光素酶报告基因技术检测miR-506-3p与UHRF1 3′非翻译区（3′UTR）特异性结合的情况;荧光定量PCR（qRT-PCR）及Western blot检测大肠癌细胞转染miR-506-3p类似物（mimics）后对UHRF1表达水平的影响;构建UHRF1过表达的大肠癌稳转细胞株,分别转染miR-506-3p mimics及其对照序列（mimics control）后,利用Transwell实验检测处理前后大肠癌细胞转移能力的变化。结果 相对于正常大肠上皮细胞及癌旁组织而言,miR-506-3p在大肠癌细胞及组织中的表达均下调（均P<0.05）,且与UHRF1的表达水平呈负相关（r=-0.456,P=0.044）;miR-506-3p通过其“种子序列”与UHRF1 3′UTR特异性结合（P<0.01）,并减少了UHRF1的mRNA及蛋白表达（均P<0.01）;转染miR-506-3p mimics抑制了大肠癌LoVo细胞的转移能力（P<0.01）,而在此基础上增加UHRF1的表达则逆转了miR-506-3p的抑制作用（P<0.01）。结论 miR-506-3p通过调控UHRF1抑制了大肠癌细胞的转移能力,在大肠癌中发挥抑癌基因的作用。     

miR-1275通过靶向〖STBX〗IGF 1R〖STBZ〗基因对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

【摘要】目的 探讨miR 1275靶向胰岛素样生长因子1受体（IGF 1R）对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响及作用机制。方法 通过在线生物信息学软件预测miR 1275和IGF 1R的靶向关系,采用双荧光素酶报告基因实验进行验证。Western blot检测转染miR 1275 模拟物（mimics）或抑制物（inhitior）后的鼻咽癌HONE 1细胞IGF 1R表达。MTT法、流式细胞术及Western blot检测miR 1275/IGF 1R分子轴对HONE 1细胞增殖、凋亡及蛋白激酶B（AKT）、磷酸化的蛋白激酶B（p AKT）、细胞增殖核抗原( PCNA)和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase 3）表达的影响。结果 HONE 1细胞转染miR 1275 mimics后,miR 1275表达明显升高,细胞增殖活力明显降低,凋亡率明显升高,p AKT和PCNA表达明显降低,cleaved caspase3表达明显升高（P＜005）。miR 1275可靶向作用于IGF 1R并下调其表达。抑制IGF 1R表达可明显降低HONE 1细胞增殖活力,促进细胞凋亡,下调p AKT和PCNA,上调cleaved caspase3表达（P＜005）。抑制miR 1275和IGF 1R表达可逆转IGF 1R对细胞增殖、凋亡及p AKT、PCNA和cleaved caspase3表达的影响。结论 过表达miR 1275可抑制鼻咽癌HONE 1细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制AKT信号途径。IGF 1R是miR 1275的靶基因,miR 1275可靶向IGF 1R并调控AKT信号途径影响鼻咽癌细胞增殖和凋亡,miR 1275/IGF 1R分子轴可能成为鼻咽癌治疗的重要靶点。     

Let-7a负性调控肺癌A549细胞中NIRF基因的表达

目的：探讨肺癌A549细胞中let-7a对其靶基因NIRF表达的调控作用.方法：运用生物信息学方法对let-7a进行靶基因预测并分析其靶基因NIRF;构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定转染后A549细胞中荧光素酶的表达;A549细胞分别转染let-7a mimics和control mimics,Western Blot检测NIRF蛋白的表达.结果：NIRF3′UTR含有一个let-7a结合位点,而且该结合位点在多个物种高度保守;经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7amimics,pRL-TK-NIRF3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低（P〈0.01）,为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的50%;Western Blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低（P〈0.01）,而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P〉0.05）.结论：肺癌A549细胞中,let-7a可以结合到NIRF 3′UTR,负性调控NIRF的表达.     

miR-28-5p靶向Nrf2调控LPS诱导的急性肺损伤机制研究

目的 探究miR-28-5p在LPS诱导的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）进程中的功能和分子机制。方法 利用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠急性肺损伤3h,6h,12h,取肺组织进行荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-PCR）检测miR-28-5p表达;同时体外利用LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7发生炎症反应,RT-PCR检测细胞中miR-28-5p表达;巨噬细胞中过表达miR-28-5p mimic后利用LPS刺激,RT-PCR检测巨噬细胞炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）表达情况;RT-PCR和蛋白免疫印迹（western blotting,WB）检测抗氧化关键分子核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶（HO-1）、醌氧化还原酶（NQO1）表达水平;Targetscan 7.0预测miR-28-5p靶向基因,突变结合位点后,并通过荧光素酶报告基因系统检测miR-28-5p对靶基因的转录调控作用。结果 LPS诱导小鼠ALI 3h,6h,12h,肺组织中miR-28-5p的表达水平明显升高（***P＜0.001）;LPS刺激巨噬细胞炎症反应时,细胞内miR-28-5p的表达水平也明显升高（***P＜0.001）;巨噬细胞中过表达miR-28-5p mimic后,炎症因子TNF-α（###P＜ 0.001）和IL-1β（&&&P＜0.001）表达水平明显升高;同时抗氧化关键分子Nrf2（###P＜ 0.001）及其下游HO-1（&&&P＜0.001）、NQO1（$$P＜0.01）表达的明显降低;Targetscan 7.0预测发现miR-28-5p靶向Nrf2基因3'' UTR序列,荧光素酶报告基因实验进一步明确miR-28-5p通过靶向 基因3'' UTR序列调控其转录。结论 miR-28-5p在LPS诱导的ALI中表达上调,并进一步加剧ALI病理进程,其作用机制可能是通过靶向巨噬细胞Nrf2,从而减弱胞内抗氧化能力,促进炎症因子分泌和巨噬细胞的活化。     

miR-141-3p靶向MYT1L促进结肠癌细胞的恶性进展

目的：探究微小RNA-141-3p(miR-141-3p)通过靶向作用髓磷脂转录因子1(MYT1L)蛋白对结肠癌细胞迁移、增殖、凋亡的影响。方法：在结肠癌HCT8细胞中转染miR-141-3p模拟物(miR-141-3p mimic),qRT-PCR检测miR-141-3p的mRNA表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell法检测侵袭和迁移,Western blot检测MYT1L的蛋白表达水平。生物信息学软件预测MYT1L可能是miR-141-3p的靶基因后用荧光素酶报告基因鉴定。结果：miR-141-3p在结肠癌组织细胞中显著上调且对患者预后有显著影响,在转染了miR-141-3p的HCT8细胞中,细胞的增殖、迁移能力均显著提高,而细胞凋亡显著下降。双荧光素酶报告基因的结果显示miR-141-3p与MYT1L基因可以靶向结合。共转染MYT1L过表达载体和miR-141-3p mimic的细胞中,相对于只转染了MYT1L过表达载体的细胞来说,细胞表型恶化程度显著升高。结论：miR-141-3p通过靶向调控MYT1L的表达促进结肠癌细胞表型的恶化。