siRNA下调NF-κB p65 基因表达影响人胆管癌QBC939细胞凋亡

目的运用RNA干扰技术下调胆管癌细胞株QBC939中核转录因子κB(NF-κB)p65基因表达对其肿瘤细胞生长的抑制作用。方法以阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000作为转染试剂,将体外合成的人NF-κB p65的siRNA转染入胆管癌细胞QBC939。RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA的表达。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变。运用免疫组化、流式细胞仪、激光共聚焦法检测p65基因表达下调对QBC939细胞凋亡的影响。结果体外合成的人NF-κB p65 siRNA有效抑制了QBC939细胞中NF-κB p65 mRNA的表达(P0.01),同时ELISA结果显示,靶向NF-κB p65 siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组(P0.05),免疫组化DAPI核染色、流式细胞仪及激光共聚焦检测观察显示下调p65基因表达能够诱导QBC939细胞凋亡。结论 NF-κB p65的siRNA在胆管癌细胞QBC939调控方面起重要作用,通过沉默其表达可诱导胆管癌细胞凋亡抑制其生长增殖。     

盐酸戊乙奎醚预先给药对失血性休克大鼠急性肺损伤时TLR4 mRNA表达的影响

目的 探讨盐酸戊乙奎醚预先给药对失血性休克大鼠急性肺损伤时Toll样受体4(TLR4)mRNA表达的影响.方法 健康SD大鼠40只,体重200～250 g,随机分为5组(n=8):假手术组(S组)、失血性休克致急性肺损伤组(ALI组)和低、中、高剂量盐酸戊乙奎醚预先给药组(P1～3组).S组仅行动静脉穿刺,不放血,ALI组股动脉放血至35～45 mm Hg制备急性肺损伤模型,P1～3组分别于放血前30 min股静脉注射盐酸戊乙奎醚0.3、1.0、3.0 mg/kg,随后制备急性肺损伤模型.各组复苏后4 h时处死大鼠取肺,称重后计算肺湿干重比,检测TLR4 mRNA和NF-κB p65蛋白的表达水平,观察病理学结果.结果 与S组比较,ALI组和P1组TLR4 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平及肺湿干重比升高(P＜0.05或0.01),P2.3组差异无统计学意义(P＞0.05);与ALI组比较,P2,3组TLR4 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平及肺湿干重比降低(P＜0.05或0.01);P2组和P3组上述指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).P2,3组肺组织病理学损伤程度较ALI组明显减轻.结论 盐酸戊乙奎醚预先给药可通过抑制肺组织TLR4 mRNA表达上调,进而降低NF-κB活性,从而减轻失血性休克诱发大鼠的急性肺损伤.     

TLR4在高糖诱导的HK-2细胞凋亡中的作用

目的:探讨TLR4在高葡萄糖诱导的HK-2细胞凋亡中的作用及机制。方法:设置不同的葡萄糖干预浓度梯度和时间梯度,采用WB的方法检测TLR4和NF-κB的表达情况以研究TLR4和NF-κB的表达与葡萄糖刺激的浓度和时间关系;使用TLR4和NF-κB特异性阻断剂处理HK-2细胞以探究阻断TLR4/NF-κB后对下游的影响,实验分为对照组、高糖组、TLR4阻断组和NF-κB阻断组,采用RT-PCR和WB的方法检测PGC-1α和剪切的caspase-3的表达,采用免疫荧光技术在共聚焦显微镜下观察Cyt C的分布,并用荧光显微镜观察细胞核及DNA的损伤情况。结果:TLR4的蛋白表达与葡萄糖刺激呈浓度和时间依赖关系(P 0. 05),高葡萄糖环境下磷酸化的NF-κB p65蛋白表达升高,以干预2 h组升高最为显着(P 0. 05);高葡萄糖刺激后PGC-1α的表达减少、Cyt C重分布、剪切的caspase-3的表达增多、细胞核碎裂及细胞DNA损伤增加,而TLR4/NF-κB阻断后上述高葡萄糖导致的变化被逆转(P 0. 05)。结论:TLR4/NF-κB在高葡萄糖环境中被激活并介导高葡萄糖所致PGC-1α的下调、线粒体功能障碍及细胞凋亡。     

TLR4-siRNA对高氧诱导人肺腺癌细胞株A549炎性因子分泌的影响

目的 评价Toll样受体4(TLR4)-小干扰RNA(siRNA)对高氧诱导人肺腺癌细胞株A549炎性因子分泌的影响.方法 人肺腺癌细胞株A549接种于培养板,培养24h后,采用随机数字表法,将其随机分为4组:对照组(C组)、高氧组(H组)、TLR4-siRNA转染组(TR组)和阴性siRNA转染组(NR组).TR组和NR组分别将TLR4-siRNA或阴性siRNA转染至细胞内.H组、TR组和NR组细胞置于独立培养小室中,通入95％ O2-5％ CO2的混合气体1 L/min 30 min制备高氧模型.采用RTPCR法检测TLR4 mRNA表达,采用流式细胞仪检测TLR4蛋白表达,采用Western bolt法检测NF-κB活性,采用ELISA法检测IL-6和IL-8的浓度.结果 与C组比较,H组和NR组TLR4 mRNA及其蛋白表达上调,NF-κB活性、IL-8和IL-6的浓度升高(P＜0.01),TR组TLR4 mRNA及其蛋白表达、NF-κB活性和IL-8、IL-6的浓度差异无统计学意义(P＞0.05);与H组比较,TR组TLR4 mRNA及其蛋白表达下调,NF-κB活性、IL-8和IL-6的浓度降低(P＜0.01),NR组TLR4mRNA及其蛋白表达、NF-κB活性和IL-8、IL-6的浓度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TLR4-siRNA可显著地抑制高氧诱导人肺腺癌细胞株A549炎性因子的分泌.     

血管紧张素Ⅱ诱导Toll样受体4在腹膜间皮细胞的表达及其对脂多糖诱导CD40表达的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对原代培养大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）Toll样受体4（TLR4）表达的影响及其在脂多糖（LPS）诱导的核转录因子κB （NF-κB）活化及CD40表达中的作用。 方法 分离及培养RPMC。用不同浓度AngⅡ（10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L）刺激细胞及用10-7 mol/L AngⅡ刺激细胞不同时间（mRNA为1、2、4、8、12、24、48 h和蛋白为6、12、24、36、48 h），观察血管紧张素1型受体（AT1R）阻滞剂洛沙坦（10－5 mol/L）和血管紧张素2型受体（AT2R）阻滞剂PD123177（10-5 mol/L）对AngⅡ诱导TLR4表达的影响。将细胞随机分为下列4组：对照组、AngⅡ (10－7 mol/L)组、LPS(1 mg/L)组、AngⅡ (10－7 mol/L)+LPS(1 mg/L)组，观察AngⅡ对LPS诱导的NF-κB激活和CD40表达的影响。RT-PCR检测TLR4、CD40 mRNA表达；Western印迹检测TLR4、IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白表达；免疫荧光检测细胞NF-κB p65亚单位的表达及分布。 结果 (1)10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L AngⅡ作用RPMC 12 h，TLR4 mRNA表达分别增加70.5%、89.5%、102.9%和121.9%；作用24 h TLR4蛋白表达分别增加12.1%、27.7%、51.2%和41.6%。AngⅡ（10－7 mol/L）作用RPMC不同时间，TLR4 mRNA表达高峰为8 h和12 h（P < 0.01），蛋白表达高峰为12 h和24 h（P < 0.01）。(2)洛沙坦阻断后，AngⅡ诱导的TLR4表达与未阻断组比较，下调33.5%（P < 0.05）。PD123177对AngⅡ诱导的TLR4表达无显著影响（P > 0.05）。(3) 与正常对照组比较，LPS作用60 min p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调362.6%（P < 0.01）和67.4%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调299.9%（P < 0.01）；与LPS组比较，AngⅡ预刺激24 h加LPS作用60 min，p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调49.1%（P < 0.01）和29.3%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调56.8%（P < 0.01）。(4)免疫荧光结果显示正常对照组与AngⅡ组细胞中，p65信号定位于细胞胞质；LPS作用60 min，p65信号从胞质进入胞核；AngⅡ+LPS组NF-κB p65胞核信号显著增强。 结论 AngⅡ呈浓度、时间依赖性诱导RPMC TLR4表达，并显著增强LPS诱导NF-κB激活及CD40的表达。提示腹膜组织局部产生的AngⅡ可能对LPS诱导的腹膜组织炎性反应具有放大作用。     

盐酸戊乙奎醚对内毒素血症大鼠全身炎性反应的影响

目的 探讨盐酸戊乙奎醚对内毒素血症大鼠血清TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS),肺组织NF-κB亚基p65亲和肽(NF-κB p65)含量的影响. 方法 健康SD大鼠60只,采用随机数字表法分为5组(每组12只):对照组(C组)、内毒素组(LPS组)、LPS+低剂量盐酸戊乙奎醚组(P1组)、LPS+中剂量盐酸戊乙奎醚组(P2组)、LPS+高剂量盐酸戊乙奎醚组(P3组).LPS组腹腔注射内毒素8 mg/kg制备内毒素血症模型,C组给予等量生理盐水,P1组～P3组给予相应剂量的盐酸戊乙奎醚5 min后注射LPS,给药6h后处死动物取标本.采用ELISA检测血清TNF-α含量,采用比色法测血清iNOS活力,Western blot检测肺组织NF-κB p65含量,并观察肺组织病理学改变. 结果 与C组比较,LPS组、P1组、P2组、P3组血清TNF-α含量显著升高(P＜0.05),iNOS活力水平明显升高(P＜0.05),肺组织NF-κB p65表达明显增高(P＜0.05);与LPS组比较,P2组、P3组血清TNF-α、iNOS活力水平和肺组织NF-κB p65含量均下降(P＜0.05),而P1组TNF-α、iNOS活力和NF-κB p65表达水平,差异无统计学意义(P＞0.05);P2组、P3组间各指标表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05);P2组、P3组肺组织病理学损伤程度明显轻于LPS组(P＜0.05). 结论 盐酸戊乙奎醚可能通过下调TNF-α、NF-κB p65的表达,减少iNOS活化来抑制内毒素休克大鼠全身炎症反应.     

雷公藤甲素对TNF-α诱导的肾系膜细胞MCP-1和ICAM-1表达干预及其机制的研究

目的：观察雷公藤甲素对TNF-α诱导的肾系膜细胞（GMC）MCP-1,ICAM-1表达的干预并探讨其作用机制。方法：把培养的GMC按刺激及干预情况分为正常对照组、TNF-α刺激组、雷公藤甲素低（5ng/ml）,中（10ng/ml）,高浓度（15ng/ml）干预组,以及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）干预组（阳性对照组）、PDTC与雷公藤甲素（10ng/ml）联合干预组。TNF-α刺激干预诱导24h后,分别提取细胞上清液、细胞质、细胞核等成分,采用ELISA法检测MCP-1,ICAM-1,IκB,IκBα,ELISA结合EMSA方法检测各组NF-κB p65,以RT-realtime PCR方法检测MCP-1,ICAM-1的mRNA。结果：TNF-α刺激组MCP-1、ICAM-1的mRNA及蛋白表达、NF-κB p65分子水平较对照组显著增高（P〈0.01）;各浓度雷公藤甲素或PDTC干预后上述指标显著下降（P〈0.01）,其中PDTC与雷公藤甲素联合干预组较单用PDTC干预组MCP-1、ICAM-1更低。相关分析表明NF-κB p65与MCP-1及ICAM-1的蛋白和mRNA表达水平呈正相关。GMC经TNF-α刺激后IκB有所下降,雷公藤甲素呈剂量依赖性上调κB,TNF-α刺激后磷酸化的IκBα较正常对照组显著升高（P〈0.05）,低浓度雷公藤甲素可显著下调其水平（P〈0.05）。结论：雷公藤甲素能显著抑制GMC分泌MCP-1、ICAM-1等促炎因子的mRNA及蛋白表达,其机制可能是促进IκB表达上调,并抑制IκBα磷酸化,从而阻断细胞核NF-κB p65活化所致。     

脂多糖对U937细胞中microRNA-107与NF-κB信号通路的影响

目的分析单核细胞在炎症状态下microRNA-107与NF-κB信号通路的相关性。方法经50ng/ml佛波酯(PMA)诱导成熟的U937细胞随机分为对照组和LPS(10μg/ml)刺激组,LPS刺激时间为1、3、6h,采用qRT-PCR检测各组细胞中microRNA-107、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL~(-1)β)的mRNA表达量;Western blot法检测细胞NF-κB(p65)与磷酸化p65(p-p65)蛋白含量。结果与对照组比较,LPS组细胞microRNA-107、TNF-α、IL~(-1)βmRNA表达量明显升高(P0.05);p-p65/p65蛋白含量比值明显升高(P0.01)。Spearman相关性分析显示,microRNA-107表达量与p-p65/p65蛋白含量比值呈中度正相关(r=0.69,P0.01);与TNF-αmRNA表达量(r=0.835,P0.01)、IL~(-1)βmRNA表达量(r=0.839,P0.01)呈高度正相关。结论脂多糖刺激PMA诱导的U937细胞后microRNA-107的表达升高可能与NF-κB信号通路有关。     

三七皂苷R1对高糖诱导肾小管上皮细胞NF-κB表达的影响及相关机制研究

目的:观察三七皂苷R1对高糖诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)核因子-κB(NF-κB)表达的影响,探讨其对糖尿病肾病的保护机制。方法:将细胞分为正常对照组、甘露醇组、高糖组、高糖+三七皂苷R1低、中、高浓度组,采用倒置显微镜观察48h后各组细胞形态;MTT法测其增殖;q RT-PCR法和Western blot法检测其NF-κB mRNA和蛋白表达。结果:高糖刺激使HK-2细胞由铺路石样变为梭形长条状。高渗组与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。与正常对照组相比,高糖组HK-2细胞增殖水平明显上升,细胞中NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显升高([表3、图2可以证明高糖组NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显的升高。]P0.05)。与高糖组比较,高糖+三七皂苷R1低、中、高浓度组HK-2细胞增殖抑制明显(P0.05),细胞中NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显降低,且干预作用呈浓度依赖性(P0.05)。结论:三七皂苷R1可减少高糖诱导HK-2细胞NF-κB的表达,对糖尿病肾脏疾病具有保护作用。     

吡格列酮对高糖诱导大鼠腹膜间皮细胞合成细胞外基质的作用及机制

目的　观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ配体吡格列酮对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）合成细胞外基质的作用以及调节机制。 方法 胰蛋白酶消化法分离培养RPMC。随机分为正常对照组、高糖组（2.5%葡萄糖）、吡格列酮干预组（10 μmol/L、20 μmol/L+2.5%葡萄糖）、二硫氨基甲酸吡咯烷干预组（PDTC,NF-κB抑制剂,25 μmol/L、50 μmol/L+2.5%葡萄糖）、姜黄素干预组[活化蛋白1（AP-1）抑制剂,15 μmol/L、30 μmol/L+2.5%葡萄糖]。RT-PCR方法检测纤连蛋白（FN）、Ⅰ型胶原（COLⅠ）、纤溶酶原激活抑制因子1（PAI-1）、c-fos、c-jun mRNA表达。ELISA方法检测细胞上清液中FN、COLⅠ和PAI-1蛋白水平。Western印迹方法检测IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65 （p-p65）蛋白表达。 结果 常规培养的腹膜间皮细胞表达基础量的FN、COLⅠ和PAI-1,高糖显著上调其蛋白及mRNA表达（P < 0.01）。吡格列酮预处理后,高糖诱导的FN、COLⅠ和PAI-1蛋白及mRNA表达显著低于高糖组（P < 0.01）。高糖作用后,磷酸化IκBα和NF-κBp65水平显著增高,c-fos、c-jun mRNA表达增加,与对照组差异有统计学意义（P < 0.01）。PDTC预处理后,高糖诱导RPMC的FN和PAI-1蛋白水平降低（P < 0.01）,COLⅠ蛋白表达无明显变化。AP-1抑制剂姜黄素预处理后,高糖诱导的RPMC FN、COLⅠ和PAI-1蛋白水平均显著降低,与对照组差异有统计学意义（P < 0.01）。吡格列酮抑制高糖条件下磷酸化IκBα和NF-κB p65水平,抑制c-fos、c-jun mRNA表达（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 NF-κB和AP-1信号通路参与高糖条件下RPMC的FN、COLⅠ和PAI-1表达的调节。吡格列酮通过NF-κB 和AP-1途径下调高糖诱导的RPMC的FN、 COLⅠ和PAI-1的表达,从而发挥抗纤维化作用。     

NF-κB信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用

目的 研究高糖尤其是波动性高糖对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响,以及NF-κB信号通路在高糖诱导HUVEC凋亡中的作用。 方法 构建针对NF-κBp65 mRNA序列1566位点的重组RNAi腺病毒表达载体,并利用RNAi腺病毒抑制HUVEC p65表达。应用流式细胞术及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）研究NF-κB信号通路在高糖诱导HUVEC凋亡的作用。 结果 高糖（20.5 mmol/L或30.5 mmol/L）可以促进HUVEC凋亡。NF-κBp65 特异腺病毒感染HUVEC后,可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核蛋白转录,使核内p65蛋白表达处于基础水平。TUNEL结果示高糖作用后5 d,高糖组细胞凋亡率显著高于正常葡萄糖组（25.81％±1.77％比8.20％±0.63％,P < 0.05）,Ad-DEST＋高糖组（26.10％±0.98％）与单独高糖组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P > 0.05）。Ad-1566＋高糖组的细胞凋亡率（11.49％±0.92％）比Ad-DEST＋高糖组显著下降（P < 0.01）。TUNEL法及流式细胞术检测结果均显示NF-κBp65 特异腺病毒可以降低高糖诱导的HUVEC凋亡。结论 高糖可以促进HUVEC凋亡。腺病毒感染HUVEC可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核转录,从而保护高糖作用的HUVEC凋亡。     

RNA干扰下调NF-κB p65基因表达诱导胰腺癌细胞株PANC-1的凋亡

目的运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术下调胰腺癌细胞株PANC-1中NF-κB p65基因表达,并评价其对肿瘤细胞凋亡的影响。方法利用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）转染入胰腺癌细胞株PANC-1中。采用RT-PCR法测定细胞内NF-κB p65mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变,运用Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测p65基因表达下调对PANC-1细胞凋亡的影响。结果化学合成的人NF-κB p65 siRNA能有效地抑制PANC-1细胞中NF-κB p65mRNA的表达（P〈0．01）,同时ELISA结果显示,RelA siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组（P〈0．05）。Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测发现下调p65基因表达能够诱导PANC-1细胞的凋亡。结论体外实验初步证明了NF-κB p65基因在胰腺癌细胞凋亡调控方面扮演重要角色．通过沉默其表达可诱导胰腺癌细胞的凋亡．     

全反式维甲酸对大鼠肾小管上皮细胞缺氧性损伤保护作用的体外研究

目的 探讨全反式维甲酸(atRA)对大鼠肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用及其相关机制.方法 对大鼠肾小管上皮细胞进行体外培养,根据研究需要分四组,分别为对照组、CoCl2刺激组、atRA刺激组以及CoCl2与atRA共同刺激组,做如检测:用凝胶电泳迟滞分析(EMSA)测定各组别细胞NFκB活性,用qRT - PCR和Western blo分别检测各组别细胞NFκB亚单位p65,Scpep1、VEGF mRNA与蛋白表达水平,用免疫共沉淀检测NFκB亚单位p65与Scpep1相互作用.结果 CoCl2刺激组中VEGF mRNA与蛋白水平的表达明显高于对照组(P＜0.01).atRA刺激组中VEGF的mRNA与蛋白水平表达明显低于对照组(P ＜0.05).CoCl2刺激组中p65 mRNA与蛋白水平的表达明显高于对照(P＜0.01).atRA刺激组中VEGF 的mRNA与蛋白水平表达明显低于对照组(P＜0.05).共同刺激组中p65的表达受到抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).CoCl2刺激组中NFκB的DNA结合力明显高于正常组(P＜0.01).而atRA刺激组中NFκB的DNA结合力受到显著抑制,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).在共同刺激组,NFκB的活性同样受到抑制,与对照组比,差异有统计学意义(P＜0.05).atRA刺激组中Scpep1mRNA与蛋白水平的表达水平显著高于对照组(P＜0.01).与对照组比较,CoCl2刺激组中Scpep1的mRNA与蛋白水平表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).免疫沉淀结果显示,p65与Scpep1存在相互关联.结论 atRA通过Scpep1对NFκB复合物形成及其活性产生抑制效应,从而减弱VEGF的表达,对缺氧性损伤的肾小管上皮细胞发挥保护作用.     

骨癌痛大鼠脊髓NF-κB、IL-6和TNF-α表达的变化

目的 评价骨癌痛大鼠脊髓NF-κB、IL-6和TNF-α表达的变化.方法 雌性健康SD大鼠72只,体重150～180 g,随机分为3组(n=24):对照组(C组)、假手术组(S组)和骨癌痛组(BP组).BP组于大鼠左侧胫骨干骺端骨髓腔内注射5μl Walker 256(1×105)乳腺癌细胞制备骨癌痛模型,S组左胫骨上端注射Hank液5μl.分别于肿瘤细胞接种前、接种后2、4、6、9、12、14、16、18和21 d时测定机械阈值.分别于肿瘤细胞接种后6、12和18 d时,处死3只大鼠,取L4-6脊髓组织,采用RT-PCR法测定NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的表达;另处死3只大鼠,取L4-6脊髓组织,计数NF-κBp65阳性细胞,采用免疫组化法测定NF-κB p65表达.结果 与C组和S组比较,BP组机械痛阈降低,脊髓NF-κB p65及其mRNA、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA的表达上调,NF-κB p65阳性细胞计数增加(P＜0.05或0.01);C组和S组间上述指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 大鼠胫骨骨髓腔内注射肿瘤细胞通过激活脊髓NF-κB,导致炎性细胞因子IL-6和TNF-α大量释放,从而诱发骨癌痛.     

血必净对尿源性SIRS猪肾组织细胞因子的影响

目的 观察血必净注射液对尿源性SIRS猪肾组织细胞因子表达的影响,探讨血必净治疗尿源性SIRS的作用机制. 方法 健康实验猪45头按随机数字表法分为假手术对照组、模型组和血必净治疗组3组,每组15只,每组所有动物按时间点又分为术后0、4、6、12和24 h5个时间点亚组.建立尿源性SIRS猪模型.应用RT-PCR法检测肾组织中TNF-α、IL-6、IL-10、NF-κB p65mRNA的表达;采用Western blot法检测肾组织中NF-κB的活性. 结果 模型组猪的SIRS表现最为明显,血必净治疗组SIRS表现明显较轻.模型组猪肾组织TNF-α、IL-6、NF-κB p65mRNA的表达以及NF-κB的蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.05);血必净治疗组较模型组的TNF-α、IL-6、NF-κB p65mRNA的表达以及NF-κB的蛋白表达显著降低(P＜0.01);IL-10 mRNA的表达情况则与之相反. 结论 血必净通过抑制NF-κB活性、上调IL-10、下调TNF-α,IL-6及NF-κB的表达而达到治疗尿源性SIRS的作用.     

TLR4和NF-κB在大鼠肾缺血再灌注损伤中的表达及意义

目的：观察大鼠肾缺血再灌注损伤后Toll样受体4（TLR4）和核因子-κB（NF-kB）的表达变化及其关系.方法：将40只SD大鼠随机等分为假手术组（S组）和肾缺血再灌注损伤组（I/R组）,建立肾缺血再灌注模型.在肾缺血再灌注后24 h切取肾脏.采用免疫组织化学法观察TLR4蛋自及NF-κB蛋白在肾脏组织中的表达变化及其相关性 采用半定肇逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组肾组织中TLR4、NF-κB的mRNA水平表达变化.结果：TLR4蛋白在S组大鼠肾小管细胞中有少量表达,在I/R组24 h后肾组织中表达明显增加,与S组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.NF-κB P65蛋白在S组大鼠肾小管细胞胞浆和少量胞核中有表达.在I/R组24 h后肾小管细胞胞浆和胞核均可见NF-κB P65明显表达.差异有统计学意义（P〈0.01）.TLR4和NF-κB在肾缺血再灌注损伤组织中的表达具有明显的相关性.I/R组中的TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达均较S组上调,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论：大鼠肾缺血冉灌注损伤后,肾组织TLR4和NF-κB P65的表达明显上调,且有明显的相关性.TLR4有可能通过激活NF-κB继而引起下游的炎症因子募集,介导肾缺血再灌注损伤.     

益肾胶囊通过上调SIRT1抑制高糖诱导足细胞凋亡的机制研究

目的:探讨益肾胶囊通过调控SIRT1表达,抑制炎症反应,减轻高糖诱导的足细胞凋亡。方法:体外培养小鼠足细胞,(1)给予SIRT1及SIRT1siRNA质粒转染分为:(1)NC组(空白质粒组);(2)过表达组(SIRT1质粒);(3)si组(SIRT1siRNA质粒);(2)给予益肾胶囊干预,实验分为:(1)NG组(5.5 mmol/L葡萄糖);(2)HG组(30 mmol/L葡萄糖);(3)YS组(30 mmol/L葡萄糖+10%益肾胶囊含药血清);(4)R组(30 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L白藜芦醇),western blot及RTPCR检测SIRT1、NF-κBp65、BCL-2、MCP-1的蛋白和mRNA表达,流式细胞检测细胞凋亡。结果:(1) SIRT1过表达组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达升高(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1的蛋白和mRNA表达下降(P 0.05);SIRT1siRNA组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达下降(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1的蛋白和mRNA表达升高(P 0.05)。(2)高糖组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达较正常组下降(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1蛋白和mRNA表达升高(P 0.05)。益肾胶囊含药血清组和白藜芦醇组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达升高(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1蛋白和mRNA表达下降(P 0.05)。(3)高糖组足细胞凋亡率较正常组高(P 0.05),益肾胶囊含药血清组和白藜芦醇组的足细胞凋亡率低于高糖组(P 0.05)。结论:益肾胶囊可能通过上调足细胞SIRT1表达,抑制足细胞炎症及凋亡,修复足细胞损伤。     

NF-κB P65亚基siRNA增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡作用的实验研究

目的 探讨NF-κB P65亚基siRNA(NF-κB P65 siRNA)在体内外增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡的作用及机制.方法 培养人胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1,分为空白对照组、阴性干扰序列对照组、吉西他宾组、NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组.MTT方法检测细胞增殖情况;Western blot方法检测NF-κB P65及凋亡相关蛋白的表达水平;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测胰腺癌细胞凋亡情况;电泳凝胶迁移实验检测NF-κB的DNA结合活性.BxPC-3接种裸鼠皮下建立胰腺癌移植瘤模型.治疗后监测肿瘤体积;TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡指数.结果 转染后72 h,与其他组相比,联合治疗组显著降低了细胞活力指数(P<0.05),下调了Bel-2和proeaspase-3的表达水平,同时上调了Bax的表达水平;流式细胞仪检测结果显示,联合治疗组细胞凋亡率高于其他组(P<0.05);EMSA实验结果证实,NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组NF-κB的DNA结合活性低于对照组(P<0.05).联合治疗能够通过诱导凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长(P<0.01).结论 NF-κB P65 siRNA可以通过抑制NF-κB的DNA结合活性,调控凋亡相关蛋白的表达水平,激活线粒体凋亡途径,从而增强吉西他宾对胰腺癌细胞的促凋亡作用.     

肠内免疫微生态营养对大鼠重症急性胰腺炎急性肺损伤保护作用的研究

目的探讨肠内免疫微生态营养对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠急性肺损伤(ALI)的影响。方法将大鼠分为空白组、SAP-ALI组,肠内营养组(EN组)和肠内免疫微生态营养组(EIN组),大鼠SAP采用牛磺胆酸钠造模,EN及EIN组于造模成功后行相应肠内营养支持。72 h后处死大鼠后取肺脏,观察肺组织形态学变化、计算肺损伤评分和湿/干重比;免疫组化检测肺组织TLR 4、NF-κB p65的表达;ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β含量。结果与空白组相比,SAP-ALI组肺损伤评分、肺湿/干重比、TNF-α、IL-1β均明显升高(P0.05);免疫组化结果发现,与空白组相比,SAP-ALI组TLR 4、NF-κB p65表达显著增强(P0.05);与SAP-ALI组、EN组相比,EIN组TLR 4、NF-κB p65表达显著降低(P0.05);并且EIN组血清肺损伤评分、肺湿/干重比、TNF-α、IL-1β与SAP-ALI组、EN组比较均显著降低(P0.05)。结论肠内免疫微生态营养有助于降低肠源性内毒素(LPS)的产生,进而降低TLR 4/NF-κB信号通路的激活,从而减轻SAP-ALI的病情。