骨髓间充质干细胞对衰老大鼠的免疫调节作用

目的通过检测大鼠骨髓来源的间充质干细胞对D-半乳糖致衰老大鼠免疫功能的影响,探讨间充质干细胞(MSCs)延缓衰老的作用。方法选择清洁级SD大鼠,随机分为3组:正常对照组、衰老模型组、MSCs治疗组。衰老模型组和MSCs治疗组每日皮下注射D-半乳糖400 mg/kg,连续注射4个月。MSCs治疗组在衰老模型制备成功后,给予尾静脉输注3×106个MSCs,每周1次,连续4周。分别检测各组大鼠脾脏指数;MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖活性;酶联免疫吸附(ELISA)法测定脾脏中IL-2和IL-10水平。并观察3组大鼠脾脏组织结构的差异。结果间充质干细胞可增强衰老大鼠的细胞免疫功能。与衰老模型组相比,MSCs治疗组的脾脏指数显著提高,T淋巴细胞活性增强,同时脾脏IL-2表达水平明显升高;而IL-10的表达水平显著降低。与对照组相比,衰老模型组脾脏白髓比例相对较少,且白髓和红髓界限欠清晰;而MSCs组大鼠的脾脏损伤有明显修复。结论 MSCs可能通过提高细胞免疫功能来发挥其抗衰老作用,从而减轻D-半乳糖致衰老大鼠的脾脏损伤。     

骨髓间充质干细胞移植抗大鼠肝纤维化的作用及机制

目的：探讨骨髓间充质干细胞（ MSCs ）移植对大鼠肝纤维化模型的作用与机制。方法分离大鼠MSCs培养传代至第4代。采用大鼠腹腔注射四氯化碳制造肝纤维模型。将造模成功SD大鼠60只,随机分为3组,每组20只：（1）对照组：鼠尾静脉注射等量的生理盐水;（2） MSCs 组：鼠尾静脉注射MSCs 悬液;（3）诱导组：鼠尾静脉注射经肝细胞生长因子（HGF）诱导14 d后的MSCs悬液。于移植后第1周、2周、3周、4周分别处死大鼠5只,检测大鼠血清透明质酸（ HA）、层黏蛋白（ LN）、Ⅳ型胶原水平;光镜下观察肝组织纤维化程度;分别用PCR法及Western检测大鼠肝脏Col-Ⅰ、RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA基因及其蛋白质表达水平。结果（1）诱导组与MSCs组的纤维化程度评分随着时间延长逐渐下降,且在第4周诱导组评分明显低于MSCs组（ P＜0．05）。（2）移植3周后各组血清HA、LN、Ⅳ型胶原含量均显著下降,4周时诱导组和MSCs组各指标含量明显低于对照组,并且诱导组低于MSCs组（ P＜0．05）。（3） MSCs移植后诱导组、MSCs组大鼠肝脏组织Col-Ⅰ、RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA和蛋白表达均随时间延长而下降,移植4周时诱导组各项指标明显低于MSCs组和对照组（ P＜0．05）。结论 MSCs移植可抑制肝纤维化大鼠肝组织中HA、LN、Ⅳ型胶原的分泌,并可下调肝纤维化大鼠肝组织Rho信号通路相关因子RhoA,Cdc42,Rac1 mRNA及蛋白表达。 HGF诱导MSCs后抗大鼠肝纤维化作用显著增强。     

骨髓间充质干细胞促进大鼠皮肤创面愈合的作用及机制研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对大鼠皮肤创面的促愈作用及机制,为临床皮肤损伤修复提供新的治疗方法.方法 建立大鼠背部皮肤全层切割伤模型,将大鼠分为2组:空白对照组,MSCs处理组,分别于伤后3、6、9、12 d采用大体观察,常规组织学检查观察2组大鼠背部皮肤伤口愈合状况及RT-PCR观察转化生长因子(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)mRNA在愈合中的变化特点.结果 MSCs处理组大鼠皮肤愈合快,愈合指数高,创伤后第3天MSCs处理组大鼠皮肤TGF-β1上调明显,第6天EGF上调明显.结论 MSCs能促进大鼠皮肤创面愈合,其机制可能与其引起各种生长因子的合成和分泌有关.     

骨髓间充质干细胞抗肺泡上皮细胞凋亡作用研究

目的 研究骨髓间充质干细胞对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响及作用.方法 用人肺泡上皮细胞株(A549细胞株)与人骨髓间充质干细胞株(第3代hBMMSC株)建立Transwell非接触分层共培养体系,分4组:(1)空白对照组;PBS+A549; (2) LPS诱导组;LPS+A549; (3) BMMSC对照组:BS+A549+BMMSC; (4) BMMSC干预组:LPS+A549+BMMSC.采用Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测A549细胞凋亡率;Western blotting检测caspase 3、bcl-2和bax蛋白表达.结果 10 μg/mL LPS可体外诱导A549细胞凋亡;BMMSC干预组A549细胞凋亡率、caspase-3与bax蛋白表达水平明显低于LPS诱导组、空白对照组和BMMSC对照组(P＜0.01);bcl-2蛋白表达水平显著高于LPS诱导组、空白对照组和BMMSC对照组(P＜0.01).结论 与LPS诱导的A549细胞共培养,BMMSC能促进A549细胞表达抗凋亡蛋白bcl-2和抑制促凋亡蛋白caspase-3和bax的表达,具有抗细胞凋亡作用.     

骨髓间充质干细胞对大鼠急性一氧化碳中毒脑损伤的作用及机制研究

 目的  观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠急性一氧化碳（CO）中毒脑损伤的作用并探讨其机制。  方法 体外培养MSCs并标记,制备MSCs悬液;100～150mL/kg腹腔注射CO建立动物模型,随后将标记5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)的MSCs经颈内动脉移植入脑损伤的大鼠体内;采用Morris水迷宫实验检测大鼠神经系统功能;采用免疫组化、尼氏染色方法检测海马损伤区细胞变化。  结果 MSCs在脑内存活并减少神经细胞凋亡,促进神经细胞结构和功能恢复。MSCs移植1、4周后,MSCs组大鼠水迷宫实验显示空间学习能力有所提高,脑组织损伤明显改善(P＜0.05)。 结论 MSCs移植治疗大鼠CO中毒后的脑损伤具有较好的疗效。     

D-半乳糖对大鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响

目的：观察D-半乳糖(D-galactose,D-gal）对骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）衰老的影响,构建体外MSCs衰老诱导模型。 方法：分离SD 大鼠（7日龄）MSCs,传代培养至第3代后,细胞随机分为4组：分别为正常对照组,1 g/L,10 g/L和50 g/L D-gal衰老诱导组。对照组在正常的DMEM 培养液中继续培养;诱导组MSCs分别在含1 g/L、10 g/L、50 g/L D-gal的DMEM 培养液中培养48 h。各组细胞培养结束后,衰老相关β-半乳糖苷酶染色法观察细胞衰老变化、Western blot法检测衰老相关蛋白p53、p21和p16表达,AO/EB双染法检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖,超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛(MDA)含量检测细胞内氧化应激水平。 结果：10 g/L和50 g/L D-gal 诱导组衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数较对照组显著升高（P<0.01）,衰老相关蛋白p53、p21和p16表达明显增高：AO/EB染色结果显示50 g/L D-gal 诱导组细胞凋亡率较对照组显著升高（P<0.01）;MTT检测结果表明10 g/L和50 g/L D-gal均能抑制MSCs增殖活性,而10 g/L和50 g/L D-gal 诱导组MSCs内SOD活力较对照组明显降低（P<0.01）,MDA含量显著升高(P<0.01)。 结论：10 g/L和50 g/L D-gal均可诱导MSCs发生衰老变化,并促使细胞内衰老相关蛋白p53、p21和p16表达增加,细胞存活能力减弱,增殖能力降低,这可能与D-gal促使MSCs内氧化应激水平升高有关。10 g/L是D-gal诱导MSCs衰老的合适浓度。     

骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠的治疗作用

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠肺损伤的治疗作用.方法:将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内.将受体大鼠分为4组:肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组和正常对照组.2 wk后观察肺组织结构、植入细胞的变化,同时检测支气管肺泡灌洗液中层黏连蛋白、透明质酸以及肺组织羟脯氨酸含量的变化.结果:MSCs治疗组大鼠肺组织中可见少量DAPI标记的细胞,其中部分细胞表达广谱细胞角蛋白,肺间质增生减轻;支气管肺泡灌洗液中层黏连蛋白、透明质酸及肺组织羟脯氨酸的含量在肺损伤组均有明显升高(P＜0.01),而在MSCs治疗组均有所下降(P＜0.01).结论:MSCs可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞,降低支气管肺泡灌洗液中层黏连蛋白、透明质酸及肺组织羟脯氨酸的含量,减轻大鼠肺损伤及纤维化的形成.     

骨髓间充质干细胞对大鼠实验性肺气肿的作用

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）对肺气肿的治疗作用。方法：Wistar大鼠随机分为四组,分别为健康组（A组）、模型组（B组）、生理盐水对照组（C组）和治疗组（D组）。B、C、D组均利用烟熏的方法诱导其肺气肿的形成,之后D组采用DAPI标记的骨髓间充质干细胞进行治疗。结果：4周后取肺组织做病理切片,观察肺泡变化,进行肺泡计数,并计算单位面积平均肺泡数（MNa）和平均肺泡面积（MAA）。D组单位面积平均肺泡数明显高于B组（P〈0.05）和C组（P〈0.05）,但低于A组（P〈0.05）,B组和C组之间无显著性差异（P〉0.05）; B组和D组平均肺泡面积无显著性差异（P〉0.05）,B组和C组之间无显著性差异（P〉0.05）,D组平均肺泡面积明显低于B组（P〈0.05）和C组（P〈0.05）。MSCs治疗组大鼠肺组织中可见DAPI标记的细胞,并且观察到MSCs在受体肺组织内分化为上皮细胞。结论：经骨髓间充质干细胞治疗的肺气肿模型大鼠的肺泡数较B组和C组明显增加,平均肺泡面积明显减小,且MSCs在肺气肿模型大鼠肺组织中分化为肺泡上皮,说明骨髓间充质干细胞对治疗大鼠实验性肺气肿是有效的。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:分离培养和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞.方法:分离SD青年大鼠股骨,L-DMEM冲洗骨髓腔,制备细胞悬液接种培养,消化传代纯化细胞.传代的骨髓间充质干细胞进行增殖曲线、克隆形成能力测定,用免疫组化检测增殖细胞vimentin、laminin的表达.结果:传代的细胞在培养第1～2天为潜伏期,第3～6天是细胞快速增殖期,第6天达高峰,第 9天后速度减慢,进入平台期,并且随传代次数的增加,细胞增殖速度逐渐下降.随传代次数增多,克隆形成能力逐渐下降.第5代以后细胞基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈长梭形.免疫组化检测增殖细胞vimentin表达阳性、laminin表达阴性.结论:本实验方法能有效扩增大鼠骨髓间充质干细胞,而且简单易行.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法：应用贴壁筛选法分离培养Wistar大鼠髓间充质干细胞,用直接荧光抗体染色法对培养的细胞进行鉴定。结果：体外培养的原代MSC 9d融合,荧光抗体染色CD44、CD105表达阳性,CD14、CD34表达阴性。结论：贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增MSC,可作为获得MSC的一种有效手段。     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法。研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定MSCs生长曲线；并应用流式细胞术测定细胞周期和表面标记物。结果MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上；细胞周期显示有91．4％处于G0／Gl期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45。结论在实验条件下，体外培养8代以前的MSCs生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，可作为组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是一群均一的细胞，具有自身的增殖特征及组织化学特征．它在适宜的微环境中能分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和星状神经细胞等，它易于分离、扩增，易于外源基因导入表达，有望成为细胞治疗和基因治疗的新型靶细胞，具有广阔的应用前景。     

bFGF促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元转化及机制

目的探讨碱性成纤维生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用及信号通路.方法利用bFGF与不同生长因子和化学诱导剂组合诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向神经元转化,观察分化过程中细胞形态、数目的变化,观察免疫细胞化学检测分化后细胞神经细胞标志蛋白和部分神经功能相关蛋白以及FGFR的表达情况,并计算转化率.结果①3组不同条件诱导后,MSCs均能分化为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达NSE、MAP2和5-HT1D,但不表达GFAP;②bFGF预诱导组的转化率明显高于未预诱导组;③诱导后的神经元样细胞FGFR3表达明显增强.结论以DMSO和BHA为基础诱导剂,bFGF预处理可明显提高MSCs跨胚层分化为神经元样细胞的转化率,浓度为10 ng/ml的bFGF主要是通过FGFR3作用于MSCs.     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定

目的 建立一套简单易行有效的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养、纯化、鉴定的方案,初步了解BMSCs的基本性状和功能特点.方法 取4周龄雄性SD大鼠,全骨髓贴壁培养BMSCs,对细胞相关的性状进行观察及分析,流式鉴定表面抗原,诱导其成骨、成脂分化,并进行染色鉴定等.结果 流式检测结果CD29、CD90呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应,成骨诱导分化后茜素红染色呈阳性反应,成脂诱导分化后油红染色呈阳性反应.结论 全骨髓培养法是一种相对简单易行的BMSCs分离纯化的方法,可获得纯度高,活性好,性状均一的BMSCs.     

大鼠骨髓间充质干细胞的超微结构观察

目的 研究体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs,观察其生长规律及光、电镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快,细胞接种后1～2d为滞留期,3d后达对数生长期,第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CD44,不表达CD45;光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形,核居中,有1～2个核仁;透射电镜下可见MSCs胞质较丰富,有线粒体、粗面内质网和高尔基复合体等细胞器,核呈圆形或椭圆形,有明显核仁。结论 培养的骨髓MSCs有独特的超微结构特点;在体外培养条件下细胞生长性状稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养

目的：建立分离和培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的方法,观察大鼠MSCs(rMSCs)的生物学特性。 方法：用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,在含10%限定性胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养,并传代扩增MSCs。 结果：rMSCs是骨髓粘附细胞中形态均一的同源细胞群,组织化学结果显示rMSCs PAS-过碘酸雪夫氏染色阳性,苏丹黑-B及碱性磷酸酶染色阴性。 结论：所建立的大鼠MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓粘附细胞中一组独特的同源细胞群,该细胞群有其特殊的代谢特点。     

慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞研究

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stemcells,BMSCs）并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法利用密度梯度离心法分离、纯化、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。以脂质体法进行慢病毒感染大鼠BMSCs。结果分离培养出大鼠BMSCs,并用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒成功感染大鼠BMSCs。结论获得大鼠BMSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为骨髓间充质干细胞基因治疗研究奠定了基础。     

体外分离大鼠骨髓间充质干细胞方法研究

目的确定分离骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)过程中的各种条件对获得MSCs群的影响。方法应用不同的分离液、离心温度、速度、培养液及不同品种胎牛血清等条件分离培养细胞并进行对比分析。结果使用 2种分离液 ,在相同离散密度时 ,得到的细胞群相同 ;相同离散密度的 2种分离液 ,不同离心温度、速度及时间 ,如果培养条件相同 ,获得的细胞群也相同 ;用含国产或进口胎牛血清的培养基进行培养所获细胞有明显的不同 ;改良的最小必需培养基 (Dulbecco′sminimumessentialmedium ,DMEM )中添加F12与不添加F12获得的细胞克隆群基本相同。结论无论使用那种分离液 ,只要其离散密度在 10 73g/L均能获得较纯的MSCs;在确定温度、时间、速度等条件下 ,确定基础培养基、选择合适的胎牛血清是取得实验成功的关键。     

大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体T淋巴细胞的作用及其机制

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在混合淋巴细胞反应(MLR)中对同种异体T淋巴细胞免疫应答反应的影响,并探讨其作用机制。方法:建立MSCs和同种异体T淋巴细胞共培养体系,反应体系总量250μl。以SD大鼠的脾T淋巴细胞为刺激细胞,以W istar大鼠的脾T淋巴细胞为反应细胞,分为6组。组Ⅰ:对照组,1×105刺激细胞和1×105反应细胞共同培养;组Ⅱ:1×105反应细胞与1×104SD大鼠的MSCs共同培养;组Ⅲ:1×105刺激细胞和1×105反应细胞并加入1×104SD大鼠的MSCs共同培养;组Ⅳ:细胞种类及数量同组Ⅲ,另加1-甲基色氨酸(1-MT)(终浓度1 mol/L);组Ⅴ:细胞种类及数量同组Ⅲ,另加植物刺激素(终浓度2μg/m l);组Ⅵ:每孔加入反应细胞和刺激细胞各1×105及MSC 1×103。混合培养120 h,结束培养前13 h,每孔加入3H-TdR 20μl,以液闪测定仪测定各组的每分钟脉冲数。反相高效液相色谱法检测MSCs和MLR共培养体系中色氨酸含量。结果:MSCs可以抑制混合淋巴细胞培养体系中T淋巴细胞增殖,并呈现出剂量依赖关系;同时MSCs和MLR共培养体系中色氨酸含量明显降低。1-MT可以阻断这一作用。结论:MSCs在体外可抑制同种异体T淋巴细胞的免疫应答,吲哚胺2,3双加氧酶参与了这种免疫抑制作用。