缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究

目的 通过体外研究初步探讨缺氧可以诱导胶质瘤细胞逆分化形成肿瘤干样细胞.方法 ①采用CD133+细胞免疫磁珠分选法分离胶质瘤细胞得到CD133-细胞群.②缺氧处理CD133-细胞48 h后行免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞样标记蛋白(SOX2,OCT-4,KLF-4,Nanog,CD133)表达情况,并分别缺氧处理0、3、6、9、12、24 h及0、12、24、48、72 h行qRT-PCR及Western blot检测.流式细胞术检测胶质瘤细胞缺氧培养后CD133+细胞比例变化,检测时间为缺氧培养1、3、5、7d.③缺氧处理胶质瘤细胞1、3、5、7d后流式分析细胞周期及凋亡改变.结果 ①荧光检测结果表明,肿瘤干细胞样标记蛋白在CD133-胶质瘤细胞缺氧处理48 h后高表达;qRT-PCR及Western blot检测结果表明,缺氧处理胶质瘤细胞可以明显上调肿瘤干细胞样蛋白表达(P＜0.05),其中qRT-PCR显示SOX-2,OCT-4及Nanog最高表达在缺氧后9h,KLF-4及CD133在缺氧后12h表达最高.Westem blot蛋白检测显示OCT-4最高表达在缺氧后12 h,CD133表达最高在缺氧24h后,KLF-4及Nanog最高表达则在缺氧48 h后,SOX-2在缺氧72 h后表达量最高.另外随着缺氧时间的延长,CD133+细胞数比例逐渐升高(P＜0.05).②细胞周期结果提示缺氧处理肿瘤细胞后,Go/G1期延长,G2/M+S缩短(P＜0.05);凋亡结果提示常氧培养组更易凋亡(P＜0.05).结论 缺氧可以诱导CD133-胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成.     

兔骨髓成骨样细胞体外培养及生物学特性观察

目的建立一种体外培养兔骨髓成骨样细胞的生物学模型,并对其生物学特性进行研究.方法抽取日本大耳兔骨髓液经离心得骨髓单个核细胞,以1×106/ml的细胞浓度进行培养,2周后得到贴壁生长的单层细胞.随后进入传代培养,通过倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜、HE染色、碱性磷酸酶染色后光镜观察及I型、Ⅲ型胶原检测等手段对所获得的细胞进行生物学特性研究.结果获得的成骨样细胞呈多种形态,有长短不一、粗细不匀、互相连接的胞质突起,可互相重叠呈复层生长.胞质丰富,富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等.细胞经连续传代,形态与功能不变.细胞富含碱性磷酸酶活性,I型胶原染色阳性,与典型成骨细胞的生物学特性相似.结论用兔骨髓基质细胞在体外能培养出成骨样细胞,为成骨细胞复合人工骨移植修复骨缺损提供了理论依据.     

人结肠癌细胞株CW-2干细胞生物学特性研究

 目的从人结肠癌细胞株CW-2中分离癌干细胞,并观察其生物学特性。方法采用多重联合法分离人结肠癌干细胞,
应用流式细胞仪检测分离后细胞中CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞含量;细胞周期检测、体外侵袭实验、体内成瘤实验对癌干细胞进行
生物学特性研究。结果分离后细胞中CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞含量为89.57%;CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞的增殖能力、侵袭能力、
致瘤能力均强于非癌干细胞,各组间差异有统计学意义（p <0.05）。结论CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞具有低增殖性、高侵袭性、高
致瘤性,并可通过多重联合分离获得。     

人胆囊癌GBC-SD细胞系中干细胞样SP细胞群的分离及其ABCG2的表达

目的 探索在人胆囊癌GBC-SD细胞系中是否存在具有干细胞特性的SP细胞(side population cells)群.方法 采用荧光激活细胞分选技术(FACS)分选出人胆囊癌SP细胞、非SP细胞.培养3～5周后再次进行FACS,用以检测SP细胞的分化情况.利用流式细胞术检测ABCG2蛋白在SP细胞的表达.结果 SP细胞群在人胆囊癌GBC-SD细胞中占(0.64±0.08)%,分离出的SP细胞在培养3～5周后会产生SP细胞和非SP细胞,而非SP细胞则不具备此特性;并且ABCG2在胆囊癌SP细胞群中呈现出高表达状态[(89.56±3.86)%],在非SP细胞中几乎不表达[(1.32±0.49)%],两者之间的差异具有统计学意义(P<0.01).结论 人胆囊癌GBC-SD细胞系中存在着很少量的干细胞样SP细胞群,并且高表达ABCG2.     

卵巢癌侧群细胞流式分选方法的建立及探讨

目的:探讨分选卵巢癌细胞株SKOV3中的侧群(side population,SP)细胞的荧光染料Hoechst33342的最佳染色浓度及SKOV3的最适细胞密度.方法:制备SKOV3细胞悬液,以荧光染料Hoechst33342和7-AAD染色,维拉帕米拮抗对照,选择不同浓度的Hoechst33342(2.5,3,4,5,6 mg/L)孵育1×106个/mL SKOV3细胞90 min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例;选取不同细胞密度的SKOV3细胞悬液(6×105,7×105,8×105,9×105,1×106个/mL),3 mg/L的Hoechst33342孵育90 min,流式细胞仪检测SP细胞比例及活细胞比例.结果:通过Hoechst33342蓝光和红光双参数图,SP细胞位于左下角两种荧光均很弱的区域.Hoechst33342浓度不变时,SP细胞比例随细胞密度的增加而升高;SKOV3细胞密度不变时,SP细胞比例及细胞活性随hoechst33342浓度升高而降低.卵巢癌SKOV3细胞株在细胞密度为8×105个/mL,加入终浓度为3 mg/L的Hoechst33342,37℃水浴90 min,为最佳染色条件,此时SP细胞比例为(1.12±0.104)％,且细胞保持良好的活性.结论:人卵巢癌细胞株SKOV3中存在SP细胞,Hoechst33342浓度及SKOV3细胞密度是影响SP细胞比例及细胞活性的重要因素.     

基于SP细胞分选法初步鉴定卵巢癌干细胞表面标志

目的: 基于侧群(SP)细胞分选方法,初步鉴定卵巢癌干细胞(CSC) 表面标志,为临床靶向治疗卵巢癌提供靶分子.方法: 检测、分离卵巢癌细胞株A2780中的SP细胞,并对SP与Non-SP细胞作细胞生物学鉴定,包括克隆形成能力、致瘤能力、耐药性、定量ATP结合框蛋白家族G2蛋白 (ABCG2)检测等;进一步用免疫磁选方法筛出ABCG2+及ABCG2-细胞,同样作上述细胞生物学鉴定,探讨ABCG2分子能否作为卵巢CSC的表面标志.结果: 卵巢癌A2780细胞株中的SP细胞在体外强克隆形成能力、裸鼠体内的高致瘤性、对化疗药物长春新碱较强耐受性及高表达ABCG2分子等生物学特性基本符合CSC的特征.ABCG2+细胞的克隆增殖能力略强于ABCG2-细胞;ABCG2+细胞的耐药性与SP细胞的耐药性一致.结论: A2780细胞株中的SP细胞基本符合CSC的生物学特征,其高表达的ABCG2分子参与维持SP细胞表型,特别是多药耐药性.ABCG2分子可作为靶向治疗CSC的靶分子,逆转肿瘤的多药耐药性.     

人牙髓细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:从年轻恒牙的牙髓组织中分离培养牙髓细胞,研究其表型及生物学特性。方法:选取因正畸或阻生拔除的年轻健康双尖牙或第三磨牙,取出牙髓,组织块酶消化法分离培养人牙髓细胞,免疫细胞化学检测第3代人牙髓细胞表面标志,并对体外培养的人牙髓细胞的矿化能力进行研究。结果:体外培养的人牙髓细胞表达Ⅰ型胶原及波形丝蛋白,少数细胞增殖可形成克隆并表达间充质干细胞的表面标志STRO-1。体外连续培养可形成钙化结节,加入矿化诱导液后钙化结节形成时间明显提前,牙髓细胞碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）活性增高。结论:人牙髓细胞中含有少量干细胞,体外培养的人牙髓细胞可向成牙本质细胞分化并形成钙化结节,体外矿化诱导可促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化。     

脐血树突状细胞经卵巢癌细胞刺激后抗卵巢癌免疫应答的体外研究

目的研究脐血来源的树突状细胞(DC)的体外扩增培养方法及诱导特异性抗卵巢癌细胞免疫效应.方法①从脐血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(Mo).以粒细胞-巨噬细胞集落剂(GM-CSF)、IL-4、集落刺激因子(SCF)和酪氨酸激酶受体Ⅲ配体(Flt-3L)诱导分化扩增,共培养7d后用流式细胞仪进行表型分析;②诱导单核细胞分化的第3天加入人卵巢癌细胞株SKOV3的冻融抗原,共培养4d后获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏的DC与从脐血中分离的同种同体T淋巴细胞共培养6d,获得效应细胞;MTT法检测效应细胞对人卵巢癌细胞株SKOV3、人肝癌细胞株Hu-7的细胞毒作用;结果①脐血来源的Mo在细胞因子的作用下,7d后分化生成成熟的DC,高表达特异性抗原CD83、CD86、CD80、CD1a;②DC可负载并提呈肿瘤抗原,诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生,不同浓度的CTL对卵巢癌细胞株SKOV3均有特异性杀伤、抑制作用(P＜0.05).结论脐血中DC的前体细胞(即单核细胞)可在体外分化扩增为成熟的功能性DC,并可诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应,是一种临床应用前景良好的、方便有效的肿瘤免疫治疗方法.     

靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的：制备靶向人滋养层细胞表面抗原2（human trophoblast cell surface antigen 2 , Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell , CAR-T）,观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法：运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果：酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖（P＜0.05）;ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素（interferon-γ,IFN-γ)、白介素（interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加（P＜0.01）。结论：该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。     

白介素-8对SKOV3细胞系卵巢癌干样细胞特性的影响

目的:研究白介素-8(IL-8)能否促成人卵巢癌SKOV3细胞系细胞肿瘤干细胞样细胞特性.方法:用添加或未添加重组人IL-8(rhIL-8:10.0 ng/mL)的干细胞条件培养基处理SKOV3细胞.肿瘤球形成和琼脂集落形成试验测定球形成率和集落形成率.蛋白质印迹分析肿瘤干细胞标志蛋白CD133和CD44表达水平.结果:rhIL-8(10.0 ng/mL)显著地增高SKOV3细胞肿瘤球形成率和琼脂集落形成率.此外,rhIL-8(10.0 ng/mL)上调SKOV3细胞CD133和CD44蛋白表达.结论:rhIL-8具有促进SKOV3细胞肿瘤干细胞样细胞特性作用.     

成骨细胞样细胞体外培养的实验研究

阐明不同组织来源的成骨细胞样细胞，在各个发育阶段中的形态与功能以及它与骨形成之间的关系。方法从大鼠及鸡胚胎颅盖骨分离出３种形态的成骨细胞样细胞，即长梭形细胞、圆球形细胞、鳞片形细胞，进行体外培养。结果长梭形细胞、圆球形细胞均可向鳞片形细胞方向发展，它们有着一致的演变趋势与结果。同时处于不同发育阶段的３种形态细胞分别表现出所处阶段的功能状态，分泌酸性粘多糖、胶原、钙盐、碱性磷酸酶等物质，分泌物堆积即形成新生骨组织。同时在成骨区附近还呈现酸性磷酸酶阳性反应细胞。结论说明颅盖骨分离细胞含有两种不同来源的骨系细胞，在形成新骨的同时还进行着骨吸收的过程。     

咀嚼肌卫星细胞的体外培养及生物学特性的研究

目的:探讨咀嚼肌卫星细胞的体外培养方法并研究其生物学特性。方法:取新生绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠面部咀嚼肌,采用酶消化法分离出咀嚼肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养。采用倒置显微镜及荧光显微镜观察、测定生长曲线等指标,研究咀嚼肌肌卫星细胞的增殖与分化能力,采用骨骼肌肌动蛋白(-αsarcometric actin)单抗免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:酶消化法适于咀嚼肌卫星细胞的分离,体外培养的咀嚼肌卫星细胞增殖速度快。免疫化学染色显示,体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达。结论:体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞有强的增殖分化能力,能用于颌面部组织工程种子细胞库的构建。     

人胚腱细胞体外培养及生物学特性研究

人胚腱细胞体外培养及生物学特性研究蔚芄，杨志明，彭文珍等。华西医科大学修复重建外科研究室中国修复重建外科杂志１９９５；９（３）：１６１应用显微外科技术剥除人胚肌腱外膜组织，经胰蛋白酶及胶原酶分步消化分离出人胚腱细胞。使用含２０％新生小牛血清的Ｆ－１２...     

抗卵巢癌细胞膜抗体对卵巢癌细胞体外细胞毒性试验及荷瘤小鼠的体内聚集性的实验研究

目的：探讨抗卵巢癌细胞膜抗体作为放射免疫治疗载体的可能性,及对靶细胞体外裸鼠体内杀伤的相对特异性。方法：采用补体介导细胞毒性试验(MTT法)测定抗卵巢癌细胞膜抗体对靶、非靶细胞比毒性;建立BALB／C—mu裸鼠荷人卵巢癌模型,用SPECT显像及病理检查分析^131I标记抗卵巢癌细胞膜抗体在荷人卵巢癌裸鼠的聚集性。结果：抗卵巢癌细胞膜纯化抗体比抗血清对卵巢癌靶细胞显示了更强的细胞毒作用,并且都显示了浓度梯度依赖性。抗卵巢癌细胞膜抗体对靶、非靶细胞比毒性显示了相对特异性,对卵巢癌细胞杀伤率高于非靶细胞(宫颈癌、肝癌、胃癌、O型白细胞)。并且呈时间依赖关系。^131I标记抗卵巢癌细胞膜抗体对荷人卵巢癌裸鼠腹腔注射3d后,肿瘤区即有明显聚集,一直持续至第8天。注射后第8天,行病理检查,肉眼见有局部坏死淤血区;镜下见癌区组织大片状坏死,坏死区可见淋巴细胞浸润。结论：抗卵巢癌细胞膜抗体对体内、体外卵巢癌细胞有相对特异性靶向性,具有作为放射免疫治疗载体的能力。     

ABCG2在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的 探讨干细胞标志物ABCG2在膀胱移行细胞癌中的表达及意义.方法 对40例膀胱移行细胞癌组织(其中Ⅰ级12例,Ⅱ级18例,Ⅲ级10例)和15例正常膀胱组织采用免疫组织化学法检测,对人膀胱癌细胞株BIU-87采用免疫荧光法检测ABCG2蛋白的表达,显微镜观察并对相关图片进行光密度分析.结果 ABCG2阳性表达定位于癌细胞的胞浆和胞膜,在膀胱移行细胞癌组织和人膀胱癌细胞株BIU-87中均检测到ABCG2蛋白的表达,而在15例正常膀胱组织中表达全为阴性,光密度分析提示其表达强度与肿瘤病理分级呈正相关(P<0.05). 结论膀胱移行细胞癌中干细胞标志物ABCG2的表达提示,肿瘤的恶性程度与膀胱移行细胞癌的发生、发展可能存在关联.     

卵巢癌TIL体外研究

为了提高肿瘤浸润淋巴细胞治疗卵巢癌的临床效果，本实验分析研究了卵巢癌ＴＩＬ细胞存活天数与细胞增殖能力、细胞表型及杀伤力之间的关系，发现ＴＩＬ细胞第１５天出现增殖，至２５天达到高峰，４０天左右开始增殖缓慢；培养２０天的ＴＩＬ细胞表型中ＣＤ５、ＣＤ４、ＤＲ明显高于１０天的ＴＩＬ细胞，其中ＴＩＬ的ＣＤ３为８６．２％，ＣＤ４、ＤＲ也较高，分别为５５．６％，９３．１％，ＴＩＬ培养至３０天，其细胞表型变化幅度     

人宫颈癌侧群细胞的分选及其生物学特性的研究

目的通过人宫颈癌细胞中侧群细胞的富集、分离和鉴定,确定其肿瘤干细胞特性,探讨以侧群细胞作为宫颈癌干细胞研究切入点的可行性。方法收集40例宫颈癌患者的手术标本,通过原代培养、流式细胞荧光激活分选法将宫颈癌细胞分为侧群(side population,SP)细胞和非侧群细胞(non-side population,NSP)2个亚群,观察2组细胞的增生和分化能力,并进行裸鼠接种以观察其成瘤能力,化疗药物顺铂以不同浓度作用于SP细胞和NSP细胞后计算细胞抑制率,以评价2组细胞对化疗药物的耐受性。结果人宫颈癌细胞中侧群细胞的比例约为2.04%±0.93%,侧群细胞的比例随分化程度的降低而下降(P<0.05)。细胞生长曲线(MTT法)显示,SP细胞的体外增生能力明显强于NSP细胞(P<0.05);行裸鼠接种时,SP细胞表现出较强的致瘤性,只需1×103个即可致瘤,其致瘤能力是NSP细胞的100倍,且成瘤时间显著缩短;化疗药物顺铂以不同浓度分别作用于SP细胞与NSP细胞24h后,SP细胞的抑制率明显低于NSP细胞(P<0.05)。结论人宫颈癌细胞中存在外排Hoechst 33342荧光染料的SP细胞,分化越差的肿瘤细胞其SP细胞比例越低。宫颈癌SP细胞体外增生能力和裸鼠成瘤能力均强于NSP细胞,对化疗药物具有较强的耐受性,具备肿瘤干细胞的特性,可作为宫颈癌干细胞研究的切入点。     

ABCG2在白血病细胞中的表达及其意义

目的探讨三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)在白血病细胞膜上的表达规律及其意义.方法应用CD45SSC参数设门多色流式细胞术分析61例白血病患者白血病细胞膜ABCG2及其他白血病细胞相关抗原的表达情况.结果61例急慢性白血病患者的白血病细胞ABCG2表达阳性率为36.07%.ABCG2表达阳性率,急性白血病(AL)患者[34.48%(20/58)]与慢性白血病(CL)患者[66.67%(2/3)];儿童患者[26.09%(6/23)]与成人患者[42.11%(16/38)]差别均无显著性意义(均P＞0.05);急性髓细胞性白血病(AML)患者[46.67%(14/30)]高于急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者[16.67%(4/24)(P＜0.05)];AML患儿[55.56%(5/9)]也高于ALL患儿[7.14%(1/14)(P＜0.05)].ABCG2与另一耐药蛋白P糖蛋白(P-gp)及其他细胞表面抗原的表达均无关(r=0.152、-0.075、-0.063、0.026、-0.149,均P＞0.05),与髓系标志CD13的表达有关(r=0.307,P＜0.05).结论ABCG2在AML患儿中的表达较高,其高表达可能导致AML患儿临床耐药.ABCG2和P-gp可能参与了不同的白血病耐药机制.     

分选卵巢癌腹水中癌细胞的实验研究

目的 探讨免疫荧光细胞化学法（ICC）联合荧光原位杂交法（FISH）分离卵巢癌腹水中癌细 胞的可行性。方法 复制卵巢癌腹水模型,分阴性对照组和4 个阳性组（A、B、C、D 组）,即4 ml 良性腹 腔冲洗液中分别有0、5、10、20 和40 个标记线粒体绿色荧光（Mito-Tracker Green）的卵巢癌SKOV3 细胞, 每组样本制备3 份。复制卵巢癌裸鼠原位移植模型,分阳性组和阴性对照组,每组6 只BALB/c 裸鼠,阳性组 裸鼠在卵巢接种SKOV3 细胞,各组分别在接种后4、6 和8 周取2 只裸鼠收集腹水。采用磁激活细胞分选法 富集癌细胞,用ICC-FISH 鉴别分离样本中的癌细胞,以8 号染色体探针（CEP8）信号>2 个为FISH 阳性标准, 规定DAPI+/EBA-1+/Mito-Tracker Green+/CEP8+ 细胞为检测癌细胞。结果 腹水模型：阴性对照组和阳 性组均可见EBA-1 阳性细胞,阳性组均有标记的SKOV3 细胞,癌细胞的回收率为20% ～ 50%,12 个阳性样 本中9 个样本的检测率为100%。裸鼠模型：在200 倍显微镜视野下,4、6 和8 周每个视野的SKOV3 细胞数 最多分别为3、8 和15 个。结论 将卵巢癌腹水磁富集后,ICC-FISH 可以准确地识别其中的癌细胞,该方法 为研究和治疗卵巢癌提供了新思路。