实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫

目的 运用实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫。 方法 根据日本血吸虫18 S小亚基单位核糖体核酸（18S rRNA）基因设计特异性引物,PCR扩增出1 450 bp序列,经TA克隆后转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为模板制作荧光定量PCR 标准曲线。方法重现性评价,用初始循环数（Ct,拷贝/反应）进行标准差分析,并计算变异系数（CV）。 结果 制作的标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998 7。方法重现性评价,在1.05×107～1.05×103个拷贝范围内,对应的Ct平均值分别为17.55、20.93、24.32、27.59和30.95;CV值分别为1.31%、1.53%、0.90%、1.85%及0.90%,在重复性试验中试验间数据平均变异系数为1.27%,无非特异性扩增。 在试验检测范围内（Ct≤30.95）,可检测的日本血吸虫基因组浓度为6.15 pg,3 h内完成。 结论 运用荧光定量PCR方法检测日本血吸虫DNA,快速、灵敏、特异性高。     

血吸虫种株间18S小亚基单位核糖体核酸基因的同源性及其PCR法检测单个尾蚴的敏感性

目的探索日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸基因（18S-rRNA）序列的同源性及采用该基因建立PCR法检测水体中低密度血吸虫尾蚴的可能性。方法提取日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫基因组DNA,采用PCR方法检测上述基因组中同一目的DNA片段,比较其同源性;分别以经沸水加热处理、氨水处理及NaOH、HCl、乙醇沉淀处理和未经处理的单个尾蚴标本为模板,采用PCR法扩增,比较对单个尾蚴的检出率。结果以日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株和曼氏血吸虫基因组DNA为模板,均能扩增出长度为469bp的DNA片段。经氨水处理和NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的单个尾蚴标本,PCR方法均能扩增到目的基因。在未经处理或沸水加热处理的单个尾蚴标本中,仅有50%标本能扩增到目的基因。结论血吸虫不同种株间18S-rRNA基因具有广泛同源性。经氨水处理或NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的标本,采用PCR法对低密度尾蚴的检出率高于未经处理或经沸水加热处理的标本。     

日本血吸虫对不同地区钉螺的感染性及其致病力的研究

目的 测定不同地区钉螺对湖沼型地区日本血吸虫株的易感性，并观察虫株的致病力变化。方法 用湖沼型地区日本血吸虫感染湖沼垸外型及垸内型、水网型、山丘型地区钉螺，之后以不同地区钉螺室内保种（1代）的尾蚴和原野外尾蚴感染家兔。结果 室内饲养的上述4类地区钉螺的感染率分别为49．58％、29．65％、32．01％、25．25％；以1800条野外尾蚴和4地区钉螺保种的尾蚴感染家兔后，各组平均虫负荷分别为1297、1078、819、727、930条，家兔肝表面虫卵结节均数、每克肝虫卵均数、COPT反应率均为野外尾蚴组高于保种组，本地保种组高于异地各保种组。结论 湖沼垸外地区（本地）钉螺易感性高于异地，野外尾蚴的感染性和致病力高于保种组，保种组中本地组的感染率和致病力高于异地组。     

快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒的建立及应用

目的构建快速检测日本血吸虫感染性钉螺环介导同温DNA扩增（LAMP）试剂盒,用于血吸虫病流行区感染性钉螺调查。方法采用碱裂解法制备钉螺基因组DNA样品,以缩短检测过程中样品DNA制备时间;对LAMP试剂进行组合优化,采用染料显色方法判定LAMP结果,以减少LAMP检测的操作步骤,避免污染,减少假阳性结果产生;建立批量检测钉螺的LAMP方法,以适用于血吸虫病防治现场大规模钉螺筛查与有感染性钉螺地块的调查。将以上优化技术及试剂整合成快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒。结果制备的日本血吸虫感染性钉螺LAMP检测试剂盒可用于血吸虫流行区现场钉螺快速检测,检测时间可由原来的6h缩短为2h,方法的灵敏性与常规LAMP法相似。该试剂盒能检测出感染后1周钉螺,能对现场钉螺进行大批量检测。结论建立的LAMP试剂盒用于日本血吸虫感染性钉螺检测快速、特异、操作简便,适用于日本血吸虫病流行区感染性钉螺调查。     

PCR扩增日本血吸虫cDNA

目的扩增日本血吸虫cDNA,以便在质粒载体中克隆化。方法从日本血吸虫成虫中提取总RNA,用Oligo(dT)12-18为引物合成cDNA,并用20个引物PCR法扩增其中的cDNA。结果100mg日本血吸虫成虫(湿重)约可纯化出270ug的总RNA,其总RNA主要呈现18S一条电泳区带,所用引物PCR扩增出了多条范围在180～900bp的cDNA。结论该实验为克隆血吸虫基因及其蛋白表达的研究奠定了基础。     

日本血吸虫人工与自然感染性钉螺对小鼠的感染性

目的探讨人工培育与自然感染的日本血吸虫感染性钉螺对小鼠感染性的差异。方法将120只昆明种小鼠随机分为2组,将人工与自然感染性钉螺用常规法逸蚴,每只小鼠感染40条尾蚴,以平均虫荷、成虫发育率、每克肝脏虫卵数(肝卵EPG)和每克粪便虫卵数(粪卵EPG)为指标进行观察,并对观察结果进行统计分析。结果自然感染性钉螺感染小鼠的平均虫荷、成虫发育率、肝卵EPG及粪卵EPG分别为27.43±3.78、68.53±9.44、19 800.97±6 752.59、196.37±11.56,均明显高于人工组的23.93±4.93、59.83±12.32、5 803.69±1 560.49、107.73±10.32(P均<0.05);相同数量的尾蚴感染后,雄性组小鼠的虫荷、发育率、肝卵EPG均高于雌性组(P均<0.05)。结论自然感染性钉螺对小鼠的感染性明显高于人工感染性钉螺,且雄性小鼠比雌性小鼠更易感染血吸虫尾蚴。     

日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢

目的　为了解日本血吸虫核酸在宿主体内代谢规律 ,寻找快捷、简便的血吸虫病核酸诊断方法提供理论依据。方法　本实验用经体外扩增的日本血吸虫rRNA大亚基核酸片段 ,以不同剂量 2 0、40、6 0、80、10 0 μg经小鼠尾静脉注入小鼠体内 ,在不同的时间 5、10、2 0、30、6 0、12 0min取小鼠肝、全血及血清 ,用PCR方法检测血吸虫核酸片段在小鼠体内的分布及代谢。结果　用特异的rRNA引物对日本血吸虫成虫基因组DNA进行扩增 ,可见一条分子量大小为 2 70bp的扩增带。当注入小鼠体内核酸量大于 80 μg时 ,血清中 5、10min组、肝内 30、6 0min组检测出有血吸虫特异性的核酸片段 ;而 2 0、12 0min肝及血清中均不能检测出血吸虫的特异性片段。白细胞在不同剂量及各个时间点上的PCR结果均为阴性。结论　提示血吸虫核酸在小鼠体内的分布及代谢情况 :血吸虫核酸进入小鼠体内 ,首先是分布在血清中 ,经血液循环后 ,核酸作为异源性物质 ,很快地在肝内进行代谢 ,经一段时间后用PCR方法也检测不到     

单克隆抗体鉴别日本血吸虫感染性钉螺的初步研究

在筛选McAb与受检钉螺样本的基础上，建立了McAb－ELISA，鉴别钉螺体内日本血吸虫抗原。每只受检钉螺．事先镜检作为对照，感染血吸虫钉螺36只，血吸虫抗原阳性检出率97.22％（35／36）。合并感染其他寄生生钉螺7只，其阳性检出率为100％（7／7）。感染其他寄生虫钉螺8只，无感染钉螺22只，血吸虫抗原阴性符合率均为100％。以上结果表明，McAb－ELISA与镜检法所得的结果是一致的，这为现场检测钉螺感染血吸虫与否将提供一种简便、有效的方法。     

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测 日本血吸虫感染性钉螺

目的　建立重组酶介导的核酸等温扩增荧光（Recombinase aided amplification,RAA）法快速检测日本血吸虫感染性钉螺技术,并探索钉螺样品的最佳处理方式。方法　将钉螺样本分成3组,每组均含7个亚组,其中6个亚组分别为50只阴性钉螺中混合1、2、3、4、5、10只日本血吸虫感染性钉螺,1个亚组为100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺。3组钉螺分别采用压碎去壳核酸试剂盒提取法、压碎去壳核酸粗提法和直接压碎带壳核酸粗提法进行处理,并分别进行荧光RAA与PCR法检测,对检测结果进行比较。结果　建立了荧光RAA检测技术,工作温度为39 ℃,30 min内即可完成日本血吸虫感染性钉螺检测。钉螺群体样本采用压碎去壳核酸试剂盒提取法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺;采用压碎去壳核酸粗提法处理后, 荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合3只感染性钉螺;采用直接压碎带壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺,PCR法仅可检测出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺。结论　成功建立了钉螺群体样本中日本血吸虫感染性钉螺快速检测的荧光RAA法,该方法具有快速、灵敏、操作简便等特点;压碎去壳核酸粗提法为钉螺样品的最优处理方式。     

感染性钉螺检测方法的研究进展

正血吸虫病是当今世界危害仅次于疟疾的人类寄生虫病,影响社会经济发展,目前估计6亿人口受威胁,感染人口1.947亿[1]。血吸虫病在世界上至少已流行2 300年以上,20世纪初,人们才掌握了血吸虫的生活史,发现钉螺(Oncomelania snail)为日本血吸虫的唯一中间宿主,并且发现血吸虫病的流行与钉螺的生态特点有着密不可分的关系[2,3]。因此,对有螺地区感染性钉螺的密度及分     

日本血吸虫幼虫在钉螺体内发育起点温度的研究

目的　研究环境温度对血吸虫幼虫在钉螺体内生长发育进程的影响程度。　方法　采集无血吸虫感染的钉螺,以钉螺与毛蚴1∶20比例感染,感染后置于30℃、27℃、24℃、21℃和18℃环境中饲养,计算钉螺体内血吸虫的尾蚴开放前期和发育速度,分析尾蚴开放前期和发育速度与环境温度间的相关关系。　结果　21℃、24℃、27℃、30℃时血吸虫的尾蚴平均开放前期分别为(128.89±16.05)d、(95.00±21.03)d、(71.93±12.74)d和(62.74±14.19)d。尾蚴开放前期与环境温度的回归方程为y=730.68x-0.8918(r=0.9976,P<0.01)。血吸虫发育速度与环境温度的回归方程为y=0.0235ln(x)-0.0639(r=0.9973,P<0.01)。从此方程中推算出日本血吸虫幼虫在钉螺体内的发育起点温度为15.17℃±0.43℃。　结论　环境温度降低,钉螺体内血吸虫幼虫发育速度减慢。     

叶巢外睾吸虫感染钉螺对钉螺体内日本血吸虫发育的影响

目的　探讨在日本血吸虫中间宿主湖北钉螺体内叶巢外睾吸虫和日本血吸虫的对抗性。　方法　通过叶巢外睾吸虫和日本血吸虫对湖北钉螺的双重感染 ,计算血吸虫的感染率和尾蚴逸出量 ,常规石蜡切片观察钉螺组织学变化。　结果　钉螺在感染血吸虫 37d后再感染外睾吸虫 ,经一定时间后检查发现 ,血吸虫的感染率为 5 2 9% ,显著低于同时单独感染日本血吸虫对照组的感染率 (75 9% ) ;先感染叶巢外睾吸虫 ,经 10、 32、6 0、 10 0和 12 0d不同的时间间隔后再感染日本血吸虫的钉螺 ,血吸虫感染率分别为 6 4 %、 6 6 7%、 6 5 2 %、5 6 4 %和 5 7 1% ,而单独感染日本血吸虫对照组钉螺血吸虫感染率为 90 5 % ,经统计检验 ,各双重感染实验组血吸虫与对照组的感染率间差异具有显著或非常显著性意义 (P <0 0 5或P <0 0 1)。对各试验组及对照组钉螺逸出尾蚴试验发现 ,试验组钉螺血吸虫尾蚴逸出量均显著低于对照组的逸出量。组织学观察发现各双重感染组钉螺消化腺萎缩 ,消化腺盲囊间隙只有少量血吸虫子胞蚴 ,血吸虫子胞蚴皱缩、变形及不规则 ,且子胞蚴中只含稀疏的尾蚴胚球 ,有的子胞蚴中已无胚球 ;而单独感染血吸虫的对照组中血吸虫均发育到成熟的子胞蚴或尾蚴。　结论　钉螺体内叶巢外睾吸虫和日本血吸虫之间存     

钉螺对不同宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性

目的了解钉螺对不同终宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性差异。方法收集家兔、水牛和小白鼠排出的虫卵,孵出毛蚴,以毛蚴和钉螺5：1的比例感染同一地钉螺。同时设对照组,观察各组钉螺感染率、死亡率。结果实验组家兔、水牛和小白鼠排出虫卵孵出毛蚴感染钉螺,获得的阳性率分别为1.42%、8.67%和19.87%,钉螺死亡率分别为29.5%、13.5%和24.5%;对照组钉螺阳性率分别为2.63%、2.02%和11.66%,死亡率分别为24.0%、49.5%和18.5%。结论不同宿主源日本血吸虫毛蚴对钉螺易感性存在差异。     

日本血吸虫毛蚴侵袭前后湖北钉螺差异表达cDNA文库的构建与分析

目的构建湖北钉螺被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后差异表达cDNA文库,筛选湖北钉螺免疫相关分子,为探讨病原与中间宿主的相互作用奠定基础。方法提取被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后湖北钉螺的头足部组织总RNA,纯化mR-NA,反转录合成cDNA。分别以被日本血吸虫毛蚴侵袭前湖北钉螺(未处理组)和被日本血吸虫毛蚴侵袭后湖北钉螺(处理组)的头足部组织作为检测方(Tester)和驱动方(Driver),利用PCR方法选择cDNA杂交试剂盒分别进行正向和反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-T载体,重组质粒转入E.coliDH5α,对菌液用PCR法扩增鉴定其中的插入片段。随机抽取354个阳性克隆进行DNA序列分析,将所得表达序列标签(ESTs)序列在线进行BLAST分析。结果从正向文库随机挑取的354个阳性克隆中测得350个ESTs序列,生物信息学分析发现了34个湖北钉螺新基因,其中1个与已知基因部分同源。结论成功建立了被日本血吸虫侵袭前、后湖北钉螺差异表达片段cDNA消减文库,发现了湖北钉螺新基因,为筛选与湖北钉螺天然免疫相关的分子、进一步探讨中间宿主与病原的相互作用及筛选血吸虫病传播阻断疫苗候选分子奠定了基础。     

中国大陆湖北钉螺种下分化研究进展

湖北钉螺是日本血吸虫的惟一中间宿主,在日本血吸虫病传播过程中起重要作用,其种下分化及鉴别在血吸虫病防治、钉螺控制等方面具有重要意义。本文基于形态学、细胞生物学、分子生物学等方面证据综述了湖北钉螺种下分化的研究进展,并对今后的研究方向提出了建议。     

目平外睾吸虫日本血吸虫不同间隔时间双重感染湖北钉螺螺体血淋巴细胞存在情况的比较

目的 外睾吸虫与日本血吸虫双重感染湖北钉螺,后进入螺体的血吸虫幼虫全部被击毁,双重感染间隔时间愈长,血吸虫幼虫被击毁的效力愈强烈.为要了解钉螺血淋巴细胞在所有螺体存在及进入血吸虫幼虫体内情况是否相同,开展了本实验观察.方法与结果 共检查双重感染间隔时间21d、37d、55 d、70 d、85d5组不同时龄的血吸虫幼虫50条.50条血吸虫幼虫周围螺组织大中小3种血淋巴细胞总数:大1 43粒、中386粒、小219粒;血吸虫幼虫体内3种血淋巴细胞总数:大40粒、中65粒、小60粒;两者总数:大183粒、中451粒、小279粒;每条血吸虫幼虫体及其周围的平均数为:大3.7粒、中9粒、小5.6粒.5组每种血淋巴细胞平均数及百分比情况如下:间隔21d:9(45％)、15.9(35％)、7.4(27％);间隔37 d:4.1(21％)、11(24％)、7.8(29％);间隔55d:3.6(18％)、8.6(18％)、5.2(1 9％);间隔70 d:2(10％)、7.9(17％)、3.4(1 3％);间隔85 d:1.2(6％)、2.9(6％)、3.1(11％).结论 显示间隔时间愈长,大中小3种血淋巴细胞数均逐步下降.     

湖北钉螺被目平外睾吸虫与日本血吸虫不同间隔时间感染后分泌物的检测与分析

观察被目平外睾吸虫和日本血吸虫双重感染钉螺后钉螺体内外分泌物及其血吸虫幼虫被击毁的关系。方法 观察钉螺感染外睾吸虫21 d、37 d、55 d、70 d和85 d后再感染血吸虫,经482 d后,取钉螺软体组织作埋蜡连续染色制片。结果与结论 无论单独感染目平外睾吸虫或两种吸虫双重感染,均可在螺软体发现多种分泌物,随时间延长分泌物数量逐渐增多。螺体内含小细胞核的分泌物和螺副腺细胞都出现在各时期的血吸虫残骸体内。     

日本血吸虫幼虫在钉螺及感染外睾吸虫钉螺发育的比较

湖北钉螺先感染外睾吸虫后再感染日本血吸虫,血吸虫幼虫在其体内被击杀(唐崇惕等,2008;2009),本文用日本血吸虫毛蚴分别接触已感染外睾吸虫21d的钉螺和阴性钉螺,观察血吸虫幼虫在此2组实验钉螺体内发育情况。从感染外睾吸虫钉螺再感染血吸虫的28个(73.7%)阳性螺,查获4～82d血吸虫幼虫共300条(侵入率26.74%),全部虫体结构异常停留在早期母胞蚴阶段。从单独感染血吸虫的25粒(69.4%)阳性螺,查获5～61d正常血吸虫母胞蚴67条(侵入率13.96%)和许多不同发育期子胞蚴,感染后75d阳性螺含血吸虫成熟子胞蚴和尾蚴。单独感染血吸虫钉螺的血淋巴细胞增生情况与双重感染外睾吸虫和血吸虫的钉螺存在差异。     

安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺遗传差异性研究

目的研究安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺的遗传差异性。方法采集宁国市有螺无病地区和芜湖市有螺有病地区的湖北钉螺,提取其头足部基因组DNA,用7条GC含量不同的随机引物进行RAPD扩增,根据扩增产物琼脂糖凝胶电泳的DNA带型,比较两地湖北钉螺基因组DNA的遗传差异性,并计算其遗传距离。结果两地区湖北钉螺PCR产物呈多态性,扩增产物中除具有相同的DNA条带外,又具有各自独特的DNA条带,扩增片段共享度F值为0.603,DNA条带亮度也有不同。两地湖北钉螺遗传距离为0.387。结论安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺基因组DNA存在较大的遗传差异。     

日本血吸虫幼虫在先感染外睾吸虫后不同时间钉螺体内被生物控制效果的比较

摘要：前此实验显示：21d外睾吸虫阳性钉螺能使再侵入的全部血吸虫幼虫发育停留在异常早期母胞蚴阶段〔1 3〕。本文实验比较观察了感染外睾吸虫后不同时间（21d、35d、55d、70d及85d）的钉螺对再侵入的日本血吸虫幼虫生物控制的情况,发现外睾吸虫和血吸虫双重感染的钉螺,两者间隔时间愈长,后侵入的血吸虫幼虫被击毁程度愈强（图1 20）;不同间隔时间双重感染的各组实验钉螺,血吸虫幼虫感染率及幼虫侵入率如下：间隔21d,75%(39/52)和25.5%（398/1 560);间隔37d,77.8%（21/27）和 35.6%(299/840);间隔55d,44.4%（8/18）和11.9%(19/160);间隔70d,100%（15/15）和10.6%(143/1 350);间隔85d,43.3%（13/30）和5.8%(66/1 140)。